Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris

Cette méthode fournira un meilleur aperçu de la fonction de l’endothélium artériolaire parenchymateux qui relie directement le flux sanguin intracérébral à l’alimentation de l’activité neuronale et gliale dans tout le cerveau. Un avantage technique distinct par rapport à l’endothélium artériole est la résolution accrue des dimensions morphologiques et de la signalisation calcique et électrique entre les cellules endothéliales intracérébrales individuelles et leurs organites respectifs. Initialement, l’isolement et l’examen de l’endothélium intracérébral seront très difficiles.

Cependant, il est possible de maîtriser cette technique avec beaucoup de pratique accompagnée de patience et de dévouement. Lavez le cerveau isolé avec une solution de dissection froide dans un bécher ou une boîte de Pétri pour éliminer le sang restant de la surface du cerveau. Placez le côté ventral du cerveau vers le haut dans une chambre contenant une solution de dissection froide pour isoler les artérioles parenchymateuses.

Pour isoler les artérioles parenchymateuses, fixez le cerveau isolé avec des broches en acier dans une solution de dissection à froid dans une boîte de Petri contenant un revêtement en polymère de silicium infusé au charbon de bois de plus de 50 centimètres de profondeur. Coupez un rectangle de tissu cérébral des deux hémisphères avec des ciseaux de dissection pointus et alignés autour du MCA tout en vous assurant que la partie supérieure du segment tissulaire a dépassé le point de ramification du cercle de Willis. Fixez le tissu cérébral dans le plat avec le MCA tourné vers le haut avec des broches en acier.

Faites soigneusement une incision peu profonde près des broches et retirez la pia avec une petite pince, en pelant doucement d’une extrémité vers l’autre. Fixez soigneusement la pia isolée avec des artérioles parenchymateuses ramifiées à partir de MCA dans le plat avec les épingles et disséquez soigneusement les artérioles parenchymateuses. Coupez toutes les branches distales restantes et assurez-vous que l’artériole est propre sans tissu attaché.

Utilisez cet artériole intact et propre pour la digestion enzymatique. Alternativement, coupez chaque artériole en deux morceaux pour la digestion enzymatique afin de préparer des tubes endothéliaux si vous le souhaitez. Pour la digestion partielle des segments artériolaires, placer les segments artériolaires intacts dans un millilitre de solution de dissociation dans un tube en verre de 10 millilitres contenant de la papaïne, du dithioérythritol, de la collagénase et de l’élastase.

Incuber des segments artériolaires à 34 degrés Celsius pendant 10 à 12 minutes. Pour isoler le tube endothélial artériolaire, placez la pipette de trituration attachée avec l’injecteur à micro-seringue dans la solution de dissociation dans la chambre et placez-la près d’une extrémité du segment de récipient digéré. Réglez un débit compris entre un et trois nanolitres par seconde sur le contrôleur de la pompe pour une trituration en douceur.

Tout en maintenant un grossissement de 100X à 200X, retirez le segment artériolaire dans la pipette, puis injectez pour dissocier l’adventice et les cellules musculaires lisses. Triturez le segment des vaisseaux jusqu’à ce que toutes les cellules musculaires lisses soient dissociées et que seules les cellules endothéliales restent intactes. Avec des micro-manipulateurs, fixez chaque extrémité du tube endothélial sur le couvercle en verre dans la chambre avec des pipettes d’épinglage en verre borosilicate Pour mesurer le potentiel de la membrane endothéliale, tout en regardant à travers l’objectif 4X, positionnez soigneusement la pointe de l’électrode pointue juste au-dessus d’une cellule du tube endothélial artériolaire dans la solution saline physiologique qui coule avec un micro manipulateur.

Augmentez progressivement le grossissement à 400X et repositionnez la pointe de l’électrode au besoin. À l’aide du micro-manipulateur, insérez doucement la pointe d’une électrode tranchante dans l’une des cellules du tube endothélial et commencez à enregistrer vm à l’aide d’un électromètre. Une fois que la VM au repos endothélial est stable de moins 30 à moins 40 millivolts, appliquez les agents pharmacologiques souhaités par objectif expérimental.

Chargez le tube endothélial avec le tracker de fluorescence pour la membrane plasmique ou l’organite souhaité à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes. Lavez les cellules avec une solution saline physiologique de superfusion fraîche et imagez les cellules vivantes au microscope à la longueur d’onde d’excitation des colorants respectifs. La fonction endothéliale a été évaluée en mesurant le calcium intracellulaire et le potentiel membranaire en réponse à un agent pharmacologique MTA, un puissant agoniste des récepteurs purinergiques à 37 degrés Celsius.

Lors de l’application d’un MTA micromolaire, la concentration intracellulaire de calcium augmente rapidement avec une hyperpolarisation concomitante. De plus, l’endothélium intact a été incubé à 37 degrés Celsius avec des trackers fluorescents pour la visualisation afin d’examiner la morphologie cellulaire. L’imagerie des cellules endothéliales vivantes a montré une co-coloration de la membrane plasmique et des noyaux.

La membrane plasmique a été colorée avec une coloration fluorescente du réticulum endoplasmique où les zones de chevauchement apparent de RE à proximité de la membrane plasmique apparaissent orange. L’expérimentateur doit être prudent pendant la dissection et l’isolement pour éviter d’endommager les artérioles, car une artériole endommagée ne donnera certainement pas un tube endothélial intact. Après la procédure, les cellules peuvent être utilisées pour l’immunohistochimie fixe avec des anticorps fluorescents ou la coloration cellulaire vivante des organites et des lipides membranaires.

Cette technique générera de nouvelles informations pour comprendre les mécanismes sous-jacents au flux sanguin cérébral au niveau fondamental de la physiologie et sélectionner les transitions vers la pathologie pour la thérapie.