Name: Mesure de la teneur en fer non hémique des tissus à l’aide d’un test colorimétrique à base de bathophénanthroline (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Apprenez à mesurer le fer non hémique dans les tissus animaux par dosage colorimétrique à la bathophénanthroline. Cette méthode simple et économique s'adapte au format microplaque pour un haut débit d'échantillons.

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Ce travail a été financé par des fonds nationaux par l’intermédiaire de FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., dans le cadre du projet UIDB/04293/2020.

Des souris C57BL/6 ont été achetées dans le commerce et des souris hepcidine-nulle (Hamp1−/−) sur fond C57BL/68 ont été un cadeau aimable de Sophie Vaulont (Institut Cochin, France). Les animaux ont été hébergés dans l’installation pour animaux i3S dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes, dans un environnement à température et à lumière contrôlées, avec un accès libre au chow et à l’eau standard des rongeurs. Le bar européen (Dicentrarchus labrax) a été acheté dans une ferme piscicole commerciale et logé à l’installation pour animaux ICBAS, dans un environnement à température et à lumière contrôlées, et nourri quotidiennement ad libitum avec des aliments standard pour le bar. Toutes les procédures impliquant des animaux vertébrés ont été approuvées par le comité d’éthique animale i3S et l’autorité nationale, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Les renseignements sur les réactifs commerciaux, l’équipement et les animaux sont énumérés dans le Tableau des matériaux.
1. Préparation de la solution
REMARQUE: Manipulez et préparez tous les réactifs et solutions avec de la verrerie sans fer ou de la plastique jetable. Ne laissez pas les matériaux de laboratoire métalliques (p. ex. spatules en acier inoxydable) entrer en contact avec un réactif ou une solution, en raison du risque de contamination par le fer. Assurez-vous que toute verrerie réutilisable est sans fer. Laver les matériaux avec un détergent de laboratoire approprié pendant 30 à 60 min, rincer à l’eau désionisée, faire tremper toute la nuit dans une solution d’acide nitrique à 37% diluée 1:3 avec de l’eau désionisée, rincer à nouveau à l’eau désionisée et laisser sécher.
<ol><li>Mélange acide : Ajouter 10 g d’acide trichloroacétique à 82,2 mL d’acide chlorhydrique à 37 % dans une bouteille en verre, bien dissoudre et ajuster le volume final à 100 mL avec de l’eau désionisée. Agiter avant utilisation. Alternativement, utilisez seulement 37% d’acide chlorhydrique pour la digestion des tissus. REMARQUE: La solution est stable pendant au moins 2 mois lorsqu’elle est stockée dans des bouteilles de réactif en verre brun foncé. ATTENTION : L’acide chlorhydrique et l’acide trichloroacétique sont corrosifs et les formes concentrées libèrent des vapeurs acides toxiques. Portez des vêtements de protection, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures chimiques en tout temps lorsque vous manipulez des acides. Évitez de les respirer et manipulez toujours les acides sous une hotte aspirante.</li>
	<li>Acétate de sodium saturé : Ajouter 228 g d’acétate de sodium anhydre à 400 mL d’eau désionisée dans une bouteille en verre et agiter pendant la nuit à température ambiante. Laissez la solution reposer et précipiter pendant une journée. Si aucune précipitation ne se produit, continuez d’ajouter de petites quantités d’acétate de sodium. Conservez la solution dans une bouteille en verre.</li>
	<li>Réactif chromogène: Pour préparer 1 mL de réactif chromogène, ajoutez 1 mg de sel disodique d’acide disulfonique de 4,7-diphényl-1,10-phénanthroline à 500 μL d’eau désionisée et 10 μL d’acide thioglycolique concentré (100%) et dissolvez-le complètement. Porter le volume final à 1 mL avec de l’eau désionisée. REMARQUE: Préparez autant de réactif chromogène que nécessaire. La solution est stable pendant 1 mois lorsqu’elle est protégée de la lumière.</li>
	<li>Réactif chromogène de travail (WCR): Ajouter 1 volume du réactif chromogène à 5 volumes d’acétate de sodium saturé et à 5 volumes d’eau désionisée. REMARQUE: Cette solution doit être préparée fraîchement le jour de l’utilisation.</li>
	<li>Solution étalon de fer mère : Pour préparer une solution de fer mère de 20 mM, placer 111,5 mg de poudre de fer carbonyle dans une fiole jaugée de 250 mL contenant 5 480 μL d’acide chlorhydrique à 37 %. Laisser dissoudre toute la nuit à température ambiante (ou incuber dans un bain-marie bouillant). Ensuite, composez la solution à un volume final de 100 mL avec de l’eau désionisée. REMARQUE: La solution standard peut être conservée indéfiniment lorsqu’elle est stockée dans un récipient hermétiquement fermé.</li>
	<li>Solution étalon de fer de travail (WISS) : Ajouter 13,5 μL d’acide chlorhydrique à 37 % à 500 μL d’eau désionisée. Ajouter 10 μL de la solution étalon de fer mère et porter le volume final à 1 mL avec de l’eau désionisée (11,169 μg de Fe/mL, 200 μM; mesuré par AAS). REMARQUE: La solution de travail doit être préparée fraîchement le jour de l’utilisation.</li>
</ol>2. Séchage de l’échantillon
<ol><li>Couper un échantillon de tissu pesant 10-100 mg avec une lame de scalpel. Pesez-le avec précision dans une balance analytique / précision sur un petit morceau de parafilm (Fresh Weight).</li>
	<li>À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez le morceau de tissu dans une plaque de 24 puits (non glissée pour permettre l’évaporation de l’eau) et laissez-le sécher sur un incubateur standard à 65 °C pendant 48 h.</li>
	<li>Vous pouvez également utiliser un four de digestion par micro-ondes de laboratoire pour sécher des échantillons de tissus. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez le morceau de tissu pesé dans une tasse en téflon sans fer et séchez-le au micro-ondes. Réglez les paramètres de fonctionnement conformément au manuel d’instructions de l’instrument. REMARQUE: À titre de référence, les paramètres de fonctionnement pour le séchage des échantillons de foie à l’aide du four de digestion spécifique (voir tableau des matériaux) sont indiqués dans le tableau 1.</li>
	<li>À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez chaque morceau de tissu séché sur un petit morceau de parafilm à l’intérieur d’une balance analytique / de précision et pesez-le avec précision (poids sec).</li>
</ol>3. Échantillon de digestion acide
<ol><li>À l’aide d’une pince à épiler en plastique, transférer chaque morceau de tissu séché dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 1 mL du mélange acide et fermer le tube de microcentrifugation. Préparez un blanc acide de la même manière, sauf que le tissu est omis. ATTENTION : Le mélange acide est corrosif et libère des vapeurs toxiques. Portez des vêtements de protection, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures chimiques lorsque vous manipulez le mélange acide. Évitez de l’inhaler et manipulez-le toujours sous une hotte aspirante.</li>
	<li>Digérer les tissus en incubant les tubes de microcentrifugation dans un incubateur à 65 °C pendant 20 h.</li>
	<li>Après refroidissement à température ambiante, transférer 500 μL de l’extrait acide clair (jaune) (surnageant) dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une micropipette équipée de pointes en plastique. S’il n’est pas possible d’obtenir un surnageant clair, effectuez un court spin de centrifugation. ATTENTION : Le surnageant est très acide. Portez des vêtements de protection, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures chimiques lorsque vous manipulez les surnageants. Manipulez-les toujours sous une hotte. REMARQUE: À ce stade, les extraits acides peuvent être immédiatement utilisés pour le test colorimétrique ou congelés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Décongeler complètement les échantillons congelés à température ambiante et les vortexer avant utilisation.</li>
</ol>4. Développement des couleurs
<ol><li>Préparer les réactions chromogènes comme indiqué dans le tableau 2 dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL ou, pour un débit plus élevé, directement dans le fond plat, des microplaques de polystyrène transparentes et non traitées à fond plat. Préparer toutes les réactions (blanc acide, étalon et échantillon) au moins en double exemplaire.</li>
	<li>Incuber à température ambiante pendant 15 min.</li>
</ol>5. Lecture de l’absorbance
<ol><li>Mesurer l’absorbance de l’échantillon dans un spectrophotomètre ou un lecteur de plaques à une longueur d’onde de 535 nm par rapport à une référence d’eau désionisée. Les plaques peuvent être lues non glissées ou avec couvercle. Dans le boîtier à couvercle, éliminez toute condensation formée par la libération de vapeurs acides du couvercle juste avant la mesure afin d’éviter toute interférence possible avec la lecture de l’absorbance. REMARQUE: L’absorbance optique de l’acide à blanc lu par rapport à l’eau désionisée (référence) doit être inférieure à 0,015; l’absorbance optique de l’étalon et des échantillons doit être comprise entre 0,100 et 1,000. Pour les échantillons à très ou très faible teneur en fer, les volumes d’extrait acide (surnageant) et de diH2O peuvent devoir être ajustés (tableau 2): si l’absorbance est supérieure à 1,0, utilisez un volume d’échantillon plus petit (surnageant); lorsque l’absorbance est inférieure à 0,1, utilisez un volume plus élevé du surnageant. Le volume de l’échantillon (Vsmp) est pris en compte lors du calcul de la teneur en fer tissulaire de chaque échantillon (voir étape 6).</li>
</ol>6. Calcul de la teneur en fer tissulaire
<ol><li>Calculez la teneur en fer des tissus non hémiques à l’aide de l’équation suivante : Fer tissulaire (μg/g de tissu sec) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63469/63469eq01v2.jpg"> AT = absorbance de l’échantillon d’essai AB = absorbance de l’ébauche acide AS = absorbance de l’étalon Fes = concentration en fer du WISS (μg Fe/mL) W = poids des tissus secs (g) Vsmp = volume de l’échantillon (volume variable de surnageant dans le tableau 2 converti en mL) Vf = volume final du mélange acide après incubation nocturne à 65 °C (correspondant au volume acide plus volume de tissu sec en mL; si les poids de l’échantillon ne diffèrent pas de manière significative, supposons un volume constant ≈ 1 mL) Vstd = volume standard de fer (volume de WISS dans le tableau 2 converti en mL) Vrv = volume de réaction final (volume total du tableau 2 converti en mL)</li>
</ol>

<ol><li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+carpet+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li>
<li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+and+anemia%3A+A+tight+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).</li>
<li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anemia+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li>
<li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+homeostasis%3A+Lessons+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).</li>
<li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li>
<li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorrence%2C+JD+%22Methods+in+Haematology%22">Methods in Haematology</a>. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).</li>
<li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li>
<li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li>
<li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297(2010).</li>
<li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li>
<li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li>
<li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant une adaptation du dosage colorimétrique à base de bathophénanthroline décrit à l’origine par Torrance et Bothwell5,6. Les étapes critiques de la méthode sont le séchage des échantillons de tissus; dénaturation des protéines et libération de fer inorganique par hydrolyse acide; réduction du fer ferrique (Fe3+) à l’état ferreux (Fe2+) e...

Le fer est un micronutriment essentiel, nécessaire à la fonction des protéines impliquées dans des processus biologiques cruciaux tels que le transport de l’oxygène, la production d’énergie ou la synthèse de l’ADN. Il est important de noter que l’excès de fer et la carence en fer sont très préjudiciables à la santé humaine, et les niveaux de fer dans les tissus sont finement régulés. L’absorption anormale du fer alimentaire, les régimes alimentaires déficients en fer, les transfusions sanguines répétées et l’inflammation chronique sont des causes courantes de troubles associés au fer qui affectent des milliards de personnes dans le monde1,2,3.
Des modèles animaux expérimentaux de surcharge ou de carence en fer ont joué un rôle déterminant dans la progression de nos connaissances sur les mécanismes impliqués dans la régulation systémique et cellulaire de l’homéostasie du fer4. Malgré les progrès substantiels réalisés au cours des deux dernières décennies, de nombreux aspects clés restent insaisissables. Dans les années à venir, la mesure précise des niveaux totaux de fer dans les tissus animaux restera une étape cruciale pour faire progresser la recherche dans le domaine de la biologie du fer.
La plupart des laboratoires quantifient le fer tissulaire avec la spectroscopie d’absorption atomique (SAA), la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) ou un test colorimétrique basé sur la réaction du fer non hémique avec un réactif bathophtrophrolique. Ce dernier est basé sur la méthode originale décrite par Torrance et Bothwell il y a plus de 50 ans5,6. Bien qu’une variante de cette méthode ait ensuite été développée en utilisant la ferrozine comme alternative à la bathophénanthroline7, cette dernière reste le réactif chromogène le plus largement cité dans la littérature.
La méthode de choix dépend souvent de l’expertise et de l’infrastructure disponibles. Bien que l’AAS et l’ICP-MS soient plus sensibles, le test colorimétrique reste largement utilisé car il présente les avantages importants suivants: i) il exclut la contribution du fer hémique dérivé de l’hémoglobine contenue dans les globules rouges; ii) il ne nécessite pas de compétences analytiques sophistiquées ou d’équipement très coûteux; et iii) le test original à base de cuvette peut être adapté à un format de microplaque, ce qui permet un débit d’échantillon plus élevé. L’approche colorimétrique présentée dans ce travail est couramment utilisée pour quantifier les altérations des niveaux de fer non hémique dans les tissus dans une variété de modèles animaux expérimentaux de surcharge en fer ou de carence en fer, des rongeurs aux poissons et à la mouche des fruits. Ici, un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant un test colorimétrique simple et bien établi que la plupart des laboratoires devraient trouver facile à mettre en œuvre.

<table><tbody><tr><td>Plaque transparente UV 96 puits</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Kern</td><td>ABJ 220-4M</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium anhydre</td><td>Merck</td><td>106268</td><td></td></tr><tr><td>Bathophénanthroline sulfonate (acide dissulfonique 4,7-Diphényl-1,10-phénantroline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1375</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 souris (Mus musculus)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poudre de fer carbonylique, &ge ; 99.5</td><td> %Sigma-Aldrich</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes jetables en polyméthacrylate de méthyle (PMMA)</td><td>VWR</td><td>634-0678P</td><td></td></tr><tr><td>Eau stérile double distillée</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques à fluorescence</td><td>BioTek Instruments</td><td>FLx800</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique, 37 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Four de digestion au micro-ondes et tasses en téflon blanc</td><td>CEM</td><td>MDS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Acide nitrique</td><td>Fisher Scientific</td><td>15687290</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Binder</td><td>ED115</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs chow</td><td>Harlan Laboratories</td><td>2014S</td><td>Teklad Global 14 % Protein Rongeurs Entretien Régime contenant 175 mg/kg de fer</td></tr><tr><td>Bar (Dicentrarchus labrax)</td><td>Sonrionansa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentation pour bar</td><td>Skretting</td><td>L-2 Alterna 1P</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis monofaisceau</td><td>Shimadzu</td><td>UV mini 1240</td><td></td></tr><tr><td>Acide thioglycolique</td><td>Merck</td><td>100700</td><td></td></tr><tr><td>Acide trichloracétique</td><td>Merck</td><td>100807</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de la teneur en fer non hémique des tissus à l’aide d’un test colorimétrique à base de bathophénanthroline

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Le fer est un micronutriment essentiel. La surcharge et la carence en fer sont très préjudiciables aux humains, et les niveaux de fer dans les tissus sont finement régulés. L’utilisation de modèles animaux expérimentaux de surcharge ou de carence en fer a été déterminante pour faire progresser les connaissances sur les mécanismes impliqués dans la régulation systémique et cellulaire de l’homéostasie du fer. La mesure des niveaux de fer total dans les tissus animaux est généralement effectuée par spectroscopie d’absorption atomique ou avec un test colorimétrique basé sur la réaction du fer non hémique avec un réactif bathophénanthroline. Depuis de nombreuses années, le test colorimétrique est utilisé pour mesurer la teneur en fer non hémique dans un large éventail de tissus animaux. Contrairement à la spectroscopie d’absorption atomique, elle exclut la contribution du fer hémique dérivé de l’hémoglobine contenue dans les globules rouges. De plus, il ne nécessite pas de compétences analytiques sophistiquées ou d’équipements très coûteux, et peut donc être facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires. Enfin, le test colorimétrique peut être basé sur une cuvette ou adapté à un format de microplaque, ce qui permet un débit d’échantillon plus élevé. Le présent travail fournit un protocole bien établi qui convient à la détection d’altérations des niveaux de fer tissulaire dans une variété de modèles animaux expérimentaux de surcharge en fer ou de carence en fer.

Comparaison entre la cuvette et la microplaque à 96 puits La mesure du fer non hémique tissulaire par réaction avec un réactif bathophénanthroline décrit à l’origine par Torrance et Bothwell5,6 repose sur l’utilisation d’un spectrophotomètre pour la lecture de l’absorbance. Par conséquent, les volumes utilisés dans la réaction chromogène sont compatibles avec la taille d’une cuvette spectrophotomètre régulière. Le présent travail décrit une ad...

Ici, un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant un test colorimétrique simple et bien établi qui peut être facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires.

Mesure de la teneur en fer non hémique des tissus à l’aide d’un test colorimétrique à base de bathophénanthroline

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Ici, nous avons fourni un protocole pour mesurer la teneur en non-hème dans les tissus animaux. En utilisant un test colorimétrique simple et bien établi qui peut être mis en œuvre facilement dans la plupart des laboratoires. Le test colorimétrique à base de bathophénanthroline ne nécessite pas de compétences sophistiquées ou d’équipement très coûteux et peut être adapté au format microplaque pour un débit d’échantillon et une rentabilité plus élevés.Ce protocole est adapté pour détecter les altérations des niveaux de fer tissulaire dans une variété de modèles animaux expérimentaux de surcharges en fer ou d’efficacité du fer. Commencez par couper un échantillon de tissu pesant de 10 à 100 grammes avec une lame de scalpel. Pesez-le avec précision dans une balance analytique sur un petit morceau de parafilm.Utilisez une pince à épiler en plastique pour placer le morceau de tissu dans une plaque de 24 puits. Laissez-le sécher sur un incubateur standard à 65 degrés Celsius pendant 48 heures. Alternativement, placez le morceau de tissu à l’aide d’une pince à épiler dans une tasse en téflon sans fer et séchez-le dans le four de digestion au micro-ondes du laboratoire.Placez chaque morceau de tissu séché sur un petit morceau de paraforme à l’intérieur d’une balance analytique et pesez-le avec précision. Transférer chaque morceau de tissu séché dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajouter un lit du mélange acide au tube et le fermer.Préparez un blanc acide de la même manière, sauf que le tissu est omis ici. Incuber les tubes à 65 degrés Celsius pendant 20 heures pour digérer le tissu. Après refroidissement à température ambiante, utilisez une micro-pipette équipée d’embouts en plastique pour transférer 500 microlitres de l’extrait acide clair dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.Préparez les réactions de chromogène directement dans les microficles de polystyrène transparents à fond plat de 96 puits et non traités. Température ambiante incubée pendant 15 minutes. Mesurer l’absorbance de l’échantillon dans un lecteur de plaques à une longueur d’onde de 535 nanomètres par rapport à une référence d’eau désionisée.La détermination du fer non hémique par la cuvette et les tests colorimétriques à base de microplaques à 96 puits sont présentés ici. La corrélation entre les niveaux de fer non hémique à base de cuvette et de microplaques dans 55 échantillons de tissus de mâles noirs âgés de six mois, six souris, y compris le foie, la rate, le cœur, les poumons et la moelle osseuse sont montrés ici. La forte corrélation entre les deux méthodologies indique que la méthode à base de microplaques est une alternative valable à la méthode originale à base de cuvette.Enfin, les niveaux de fer non hémique ont été quantifiés avec la méthode à base de microplaques après digestion acide d’échantillons dérivés des mêmes tissus avec un mélange d’acide chlorhydrique et d’acide trichloroacétique ou d’acide chlorhydrique seul. La forte corrélation montre que l’acide trichloroacétique peut être émis par la digestion acide. L’image représentative montre les niveaux de fer non hémique dans le foie, la rate, le cœur et le pancréas de souris mâles noires de type sauvage six et de souris knock-out d’hepcidine mâle sur fond génétique noir six mesuré avec un test colorimétrique à base de bathophénonthroline.La perturbation de l’hepcidine conduit à une hémochromatose comme le phénotype de dépôt de fer avec une accumulation sévère de fer hépatique, pancréatique et cardiaque et une déplétion de fer splénique. Les niveaux de fer hépatique non hémique chez le bar européen femelle juvénile après modulation expérimentale du fer sont montrés ici. Les niveaux de fer hépatique ont augmenté massivement chez les animaux traités au fer.Alors que l’anémie a provoqué une légère réduction des réserves hépatiques de fer. Les images représentatives montrent les niveaux de fer non hémique chez la drosophile âgée d’un mois mesurés avec un test colorimétrique à base de bathophénanthroline. Les résultats montrent la teneur en fer non hémique dans chaque pool de 20 mouches ou la teneur estimée en fer de chaque mouche.Considérant un poids moyen de 0,64 milligrammes par mouche. Lorsque vous tentez cette procédure, n’oubliez pas de nettoyer soigneusement toute l’usure du verre et de ne pas laisser les matériaux de laboratoire métalliques entrer en contact avec un réactif ou une solution en raison du risque de contamination.

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Dosage colorimétrique à base de bathophénanthroline sulfonate : une méthode simple et rapide pour la quantification du fer non héminique dans le tissu hépatique de souris

Cette vidéo présente une technique in vitro pour évaluer la biodisponibilité du fer dans des sources alimentaires complexes. La technique combine la simulation de la digestion humaine avec l’absorption du fer par des cellules Caco-2 différenciées. La formation de ferritine intracellulaire agit comme un marqueur de l’absorption cellulaire du fer.

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Nous présentons un protocole simple et fiable pour mesurer la teneur en fer dans les tissus végétaux à l’aide de la méthode colorimétrique de bleu de Prusse.

Une méthode colorimétrique pour mesurer la teneur en fer chez les plantes

Nous présentons un analyse pour la quantification facile des métaux introduits aux échantillons préparés utilisant la chromatographie immobilisée d'affinité de métal. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol comme indicateur de métal colorimétrique et un spectrophotomètre UV-Vis comme détecteur.

Quantification du lixiviation des métaux dans la chromatographie d'affinité métallique immobilisée

Cette méthode de spéciation de redox de fer est basée sur la spectrométrie de masse plasmatique capillaire couplée à l’électrophorèse-inductivement couplée avec l’empilage d’échantillon combiné avec l’analyse courte dans une course. La méthode analyse rapidement et fournit de faibles limites de quantification pour les espèces de redox de fer à travers une gamme variée de tissus et d’échantillons de biofluides.

Configuration de la spectrométrie de masse plasmatique capillaire couplée à l’électrophorèse (CE-ICP-MS) pour la quantification des espèces de redox de fer (Fe(II), Fe(III))

Cet article montre comment préparer et administrer du fer isotopique non radioactif lié à la transferrine pour des études sur le transport du fer chez la souris gravide. L’approche de quantification du fer isotopique dans les compartiments fœtoplacentaires est également décrite.

Quantification du transport du fer à travers le placenta de la souris in vivo à l’aide d’isotopes de fer non radioactifs

Le bioessai sur cellules Caco-2 pour la biodisponibilité du fer (Fe) représente une approche rentable et polyvalente pour évaluer la biodisponibilité du Fe dans les aliments, les produits alimentaires, les suppléments, les repas et même les régimes alimentaires. Rigoureusement validé par les études humaines, il représente l’état de l’art pour les études de biodisponibilité du Fe.

Le bioessai sur cellules Caco-2 pour la mesure de la biodisponibilité du fer alimentaire

Nous décrivons un test fluorescent qui peut confirmer rapidement et à peu de frais la capacité de nouveaux composés à chélater le fer. Le test mesure la capacité des composés à surpasser l’activité de liaison au fer de la sonde fluorescente chélatrice du fer faible Calcein, ce qui entraîne une augmentation quantifiable de la fluorescence lors de la chélation.

Méthode de fluorescence acellulaire quantifiable et peu coûteuse pour confirmer la capacité de nouveaux composés à chélater le fer 

Ce protocole présente des méthodes permettant d’évaluer la distribution et la quantité des dépôts de fer dans les tissus, en particulier le cerveau. Le protocole détaille les procédures de préparation des échantillons, de coloration Perls/DAB, de capture d’images et d’analyse des données.

Évaluation du dépôt de fer dans le cerveau de souris 5xFAD par coloration Perls/DAB

Dans le cadre de ces travaux, nous avons discuté du protocole de conception et de développement d’un dispositif POCT E-Eye-Enable pour détecter Fe, Cr, As et F dans des échantillons environnementaux, des échantillons biologiques, des aliments et des boissons. Près de 2000 échantillons ont été testés, et les résultats sont conformes à la technique de référence.

TD-DFT Technique avancée de détection E-Eye guidée pour la quantification sur site de Fe, Cr, F et As dans les échantillons environnementaux, biologiques et alimentaires

Apprenez à mesurer le fer non hémique dans les tissus animaux par dosage colorimétrique à la bathophénanthroline. Cette méthode simple et économique s'adapte au format microplaque pour un haut débit d'échantillons.

Mesure de la teneur en fer non hémique des tissus à l’aide d’un test colorimétrique à base de bathophénanthroline

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