Transformation naturelle, expression des protéines et cryoconservation de la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacune

Ce protocole décrit comment la cyanobactérie filamenteuse qui appartient aux oscillatoriales peut être transformée par transformation naturelle. Il montre également comment différents types de mouvement peuvent être étudiés. La transformation naturelle est la technique de transformation la plus simple, si elle fonctionne.

Seuls l’ADN, les cellules et le milieu de croissance sont nécessaires. Jusqu’à présent, aucun autre membre des oscillatoriales n’a pu être transformé par transformation naturelle. Nous espérons que nos études inciteront d’autres groupes à essayer d’autres oscillatoires.

Pour la transformation, faites une bonne culture d’apparence saine et une bonne préparation de l’ADN. Pour les études de mouvement, utilisez toujours une culture traitée par ultrasons. Le traitement doit être frais.

La démonstration de la procédure sera assurée par Nora Weber, une technicienne de mon laboratoire. Commencez par inoculer un milieu F2 liquide de 50 millilitres dans chacun des deux flacons de 250 millilitres avec un millilitre de filaments de P.lacuna provenant d’une culture en cours d’exécution. Cultivez à la lumière blanche sous agitation pendant environ cinq jours à 25 degrés Celsius.

Après cinq jours, homogénéiser 100 millilitres de suspension de cellules P.lacuna à 10 000 tr / min pendant trois minutes et mesurer la densité optique à 750 nanomètres. Ensuite, centrifugez la suspension de la cellule pendant 15 minutes à 6 000 fois G.Retirez le surnageant et suspendez la pastille dans 800 microlitres du liquide restant et du milieu F2+ supplémentaire. Prenez huit plaques de gélose F2 + Bacto contenant 120 microgrammes par millilitre de kanamycine et pipettez 10 microgrammes d’ADN au milieu de chaque plaque de gélose.

Pipettez immédiatement 100 microlitres de la suspension cellulaire sur l’ADN. Gardez la plaque de gélose sans couvercle sur le banc propre pour permettre à l’excès de liquide de s’évaporer. Fermez la plaque et cultivez-la à la lumière blanche à 25 degrés Celsius pendant deux jours.

Après deux jours, répartir les filaments de chaque plaque de gélose sur plusieurs plaques de gélose F2+Bacto fraîches contenant 120 microgrammes par millilitre de kanamycine avec une boucle d’inoculation. Cultivez les plaques en lumière blanche à 25 degrés Celsius et vérifiez régulièrement les cultures au microscope. Après 14 à 28 jours, identifiez les filaments brunâtres morts et recherchez les filaments transformés au microscope.

Les filaments transformés ont l’air sains et verts et sont différents de la majeure partie des filaments. Transférer chaque filament transformé dans des flacons de 50 millilitres avec 10 millilitres de F2 + milieu avec 250 microgrammes par millilitre de kanamycine. Cultivez à la lumière blanche à 25 degrés Celsius sur un shaker et observez la croissance jusqu’à quatre semaines.

Transférez les filaments dans le milieu agar contenant 250 microgrammes par millilitre de kanamycine et attendez que les filaments se développent. Ensuite, augmentez à nouveau la concentration de kanamycine pour accélérer la ségrégation. Pour l’expression GFP, observe des filaments simples avec un microscope à fluorescence à un grossissement de 40X ou 63X et capture une image de transmission en champ lumineux et une image de fluorescence.

Cultiver P.lacuna dans un milieu F2 sous une agitation horizontale de 50 RPM en lumière blanche pendant environ cinq jours jusqu’à ce que la densité optique estimée à 750 nanomètres devienne 0,35. Conservez l’échantillon à quatre degrés Celsius. Homogénéiser les filaments avec des ultrasons pendant une minute à la puissance et au cycle maximum d’un.

Mesurez la densité optique à 750 nanomètres et transférez huit millilitres du milieu contenant P.lacuna dans une boîte de Petri de six centimètres. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que l’échantillon atteigne la température ambiante, puis recouvrez la boîte de Pétri avec une feuille de cellophane. Placez une lame de microscope sur la table X-Y d’un microscope standard avec une caméra.

Allumez la lumière du microscope et déplacez un objectif 4X ou 10X dans le trajet de la lumière. Ensuite, placez la boîte de Petri sur le dessus de la diapositive. Ajustez les filaments simples ou les faisceaux de filaments en fonction des mouvements X, Y et Z de la table.

Observez les mouvements de filaments ou de faisceaux simples et enregistrez les mouvements avec une caméra de microscope standard. Assurez-vous que l’objectif ne touche pas le liquide. Pipette 0,5 millilitre d’une solution contenant P.lacuna sur la surface de la gélose Bacto d’une boîte de Petri de six centimètres.

Laissez le liquide pénétrer dans la surface. Après environ 20 minutes, fermez la boîte de Petri et observez le mouvement des filaments sur la surface à l’aide d’un objectif 4X ou 10X. Capturez les enregistrements en accéléré à l’aide d’une caméra oculaire et d’un système de mini-ordinateur.

Les filaments doivent d’abord être focalisés à l’œil, puis à travers la caméra oculaire. Assurez-vous que l’intervalle de temps entre les images suivantes est de cinq secondes à une minute. Programmez le script Linux du mini-ordinateur pour contrôler l’enregistrement en accéléré.

Préparez des supports de LED où les LED de cinq millimètres sont montées pour irradier une zone de 20 millimètres carrés du bas vers le haut. Mesurez et ajustez les intensités des LED. Assurez-vous que tout le décor se trouve dans une pièce sombre ou dans un récipient fermé et sombre.

Placez huit millilitres du milieu contenant P.lacuna dans une boîte de Petri de six centimètres, fermez la boîte de Petri avec le couvercle et placez-la sur un support LED de sorte que la LED soit au centre de la boîte de Petri. Après généralement deux jours, capturez une image de la boîte de Petri avec un appareil photo de smartphone visant directement la position du traitement de la lumière. Utilisez un support et une feuille blanche comme arrière-plan pour assurer la même distance et les mêmes conditions de lumière pour chaque image.

Ouvrez le logiciel ImageJ, cliquez sur Fichier, Ouvrir et sélectionnez le fichier. Ensuite, cliquez sur Entrée. Sélectionnez le bouton droit et appuyez sur le bouton gauche de la souris pour tracer une ligne d’une extrémité de la boîte de Pétri à l’extrémité opposée.

Assurez-vous que la ligne passe par le centre du cercle de filaments. Cliquez sur Analyser et mesurer pour voir la longueur de la boîte de Pétri. Ensuite, cliquez sur Analyser et tracer le profil dans le menu ImageJ.

Estimez une valeur moyenne pour l’intensité des pixels à l’extérieur du cercle et une autre valeur moyenne pour l’intensité des pixels à l’intérieur du cercle. Pointez la souris sur la position Y entre ces valeurs pour estimer les valeurs X des deux côtés du cercle. Notez les deux valeurs et calculez la différence.

Sélectionnez ensuite le bouton droit et tracez une ligne à la valeur moyenne maximale de l’intensité en pixels. Enfin, cliquez sur Analyser, puis sur Mesurer pour obtenir la longueur du cercle de la cellule interne. L’intégration et la ségrégation de l’insert après la transformation de P.lacuna avec PAK1 sont montrées ici.

Un test PCR avec des amorces externes environ une semaine après la transformation a généralement deux bandes sur le gel d’électrophorèse, une avec la taille de la bande de type sauvage, et une bande de migration plus lente qui indique l’insertion de la cassette de résistance. Ici, les voies 1 à 4 représentent les produits PCR des filaments après sept jours, 11 jours, 14 jours et 17 jours d’isolement d’un filament résistant, et la voie 5 représente un produit PCR de type sauvage. Dans l’échantillon de sept jours, l’insert est présent dans une petite fraction des chromosomes.

Cette fraction augmente jusqu’à 17 jours, où aucune bande de type sauvage n’est visible, c’est-à-dire que la ségrégation est complète. Cette image représente le vecteur pMH1 pour l’expression de sfGHP sous le contrôle du promoteur endogène de la phycocyanine bêta. La séquence homologue P.lacuna, l’épine dorsale du vecteur pUC19 et l’insert avec résistance au sfGFP et à la kanamycine sont présentés ici.

Dans pMH1, le gène sfGHP est placé trois premiers du gène bêta de la phycocyanine; par conséquent, il est entraîné par le promoteur bêta cpc endogène. Des images de fluorescence de filaments de type sauvage P.lacuna et après transformation avec PAK1, PAK2, PAK3 et pMH1 sont montrées ici. L’expression de sfGFP est pilotée par le promoteur cpc 560, le promoteur a2813, le promoteur psbA2S ou le promoteur bêta cpc endogène.

Les images fusionnées présentées ici montrent la motilité de la lacune de Phormidium. Le mouvement sur la surface de la gélose est montré ici. L’intervalle de temps était d’une minute.

Le mouvement dans le milieu liquide est présenté ici. L’intervalle de temps était de 10 secondes. La transformation naturelle est une méthode simple.

Il suffit de mélanger l’ADN plasmidique avec une cassette de résistance dans des séquences homologues avec les cellules et de laisser les cellules se développer sur un milieu avec des antibiotiques. Les gènes peuvent être inactivés et les protéines peuvent être surexprimées. Ceci est important pour toute recherche fondamentale et pour les études biotechniques.

Dans les cyanobactéries unicellulaires où la transformation naturelle est également établie, des études moléculaires sur la photosynthèse ou les photorécepteurs, et cetera, ont été abordées.