Trancher le tronc auditif embryonnaire du poulet pour évaluer les gradients tonotopiques et les microcircuits

Cette méthode acquiert des tranches vivantes du tronc cérébral auditif du poulet qui englobe un plus grand gradient de région de fréquence dans la même tranche. Ces tranches conviennent aux expériences électrophysiologiques et anatomiques avec un axe tonotopique plus large. Cette méthodologie aidera à comprendre le développement des microcircuits dans le tronc cérébral auditif.

Bien que l’anatomie soit spécifique au poulet, d’autres espèces aviaires comme les cailles et les oiseaux chanteurs ont une anatomie similaire. Pour commencer, stérilisez les œufs avec de l’éthanol à 70% et incuberez-les à 38 degrés Celsius et 50% d’humidité. Ensuite, réglez le taux de bulle pour l’ACSF de telle sorte que le pH soit de 7,2 à 7,4 avec une osmolalité comprise entre 300 et 310 milliosmolaires par litre.

Ensuite, mélangez cinq grammes d’agarose dans 100 millilitres de dACSF. Dissoudre complètement l’agarose à l’aide d’un bain-marie ou d’un four à micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose commence à bouillonner. Versez l’agarose fondue dans une boîte de Petri jusqu’à une épaisseur de cinq millimètres et maintenez-la à température ambiante pour qu’elle prenne.

Après la prise, scellez la boîte de Petri et conservez à quatre degrés Celsius. Couper l’agarose en blocs de cubicules pour l’utiliser au moment de la dissection. Tout d’abord, nettoyez la zone de dissection en utilisant de l’éthanol à 70%.

Collez le bloc d’agarose de support ou angulaire sur le plateau de vibratome. Placez l’œuf sous une lumière vive et localisez l’espace rempli d’air sur le côté plus grand ou plus rond de l’œuf, puis fissurez la coquille sur l’espace rempli d’air et exposez le sac à membrane. Faites une incision douce dans le sac pour exposer le bec.

Avec un scalpel, retirez doucement le cou et la tête de l’œuf. Après la décapitation, nettoyer la tête avec du dACSF réfrigéré. Maintenez la tête stable dans le dACSF réfrigéré et faites une incision rostrocaudale.

Commencez l’incision derrière et entre les yeux et suivez la longueur du cou récolté. Séparez la peau pour exposer le crâne. Coupez le crâne derrière l’œil en ligne médiane à la direction latérale.

Répétez l’opération pour les deux hémisphères. Tranchez la partie rostrale du crâne en plaçant la lame derrière les yeux et en faisant une coupe rapide. Ensuite, plongez la tête dans un plat de dACSF réfrigéré.

À l’aide d’une paire de petits ciseaux, faites des incisions médianes à latérales dans la région caudale du crâne pour séparer le cerveau sans causer de lésions tissulaires. Exposez doucement le tronc cérébral et le cervelet. Rétractez la région dorsale de tout le crâne.

Retirez le tronc cérébral et exposez-le par un léger brossage à l’aide d’un pinceau fin. Utilisez des pinces incurvées pour nettoyer le tronc cérébral des tissus et des vaisseaux sanguins qui se connectent. Séparez le tronc cérébral du cervelet en coupant les pédoncules et en enlevant soigneusement les vaisseaux sanguins.

Coupez le tronc cérébral des vaisseaux sanguins supplémentaires. Tout d’abord, placez la lame du vibratome le long de l’axe horizontal. Pour les tranches coronales, collez le tronc cérébral sur un plateau de tranchage du côté rostral, en gardant l’axe rostrocaudal vertical.

Pour les tranches sagittales, maintenez l’axe médian latéral vertical. Pour les tranches horizontales, collez la face ventrale en maintenant l’axe ventral dorsal vertical. Pour obtenir le plan horizontal sagittal angulaire aigu, collez la face ventrale du tronc cérébral de telle sorte que l’axe dorsal ventral soit vertical sur le bloc d’agarose de surface de l’hypoténuse.

Collez la surface opposée du bloc d’agarose face au plateau de tranchage et maintenez l’axe rostrocaudal parallèle au bord de la lame. Comme alternative au découpage des vibratomes, immergez le tronc cérébral isolé dans un point de fusion bas de 4% agarose à 40 degrés Celsius dans une boîte de Petri de 35 par 10 millimètres. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, coupez le bloc d’agarose de la cabine à l’aide d’une lame de rasoir tranchante.

Collez le bloc d’agarose sur son côté rostral en maintenant l’axe rostrocaudale du tronc cérébral vertical. Prendre des tranches coronales jusqu’à ce que la région NM soit visible. Retirez le bloc d’agarose de la colle avec une lame tranchante.

À l’aide d’une aiguille fine, placez délicatement 0,5 microlitre de colorant bleu de toluidine sur le NM pour repérer les noyaux. Remontez ce bloc sur le plateau de tranchage pour les tranches sagittales ou horizontales. Identifier les noyaux par rapport à la région colorée et couper le tronc cérébral.

Après sectionnement, placer les tranches de 200 à 300 microns collectées séquentiellement dans une chambre tranchée contenant de l’ACSF pour équilibrer pendant une heure à température ambiante. Les coupes coronales de tissu du tronc cérébral d’un embryon de poulet E19 à 21 représentent les régions d’isofréquence relative des noyaux du tronc cérébral auditif, de la région auditive de fréquence caractéristique la plus faible à la plus élevée. Les fibres du nerf auditif afférent et la bifurcation des axones NM étaient visibles.

Nucleus angularis a également été observé. Dans les sections rostrales, le noyau olivaire supérieur est situé le long de la région latérale ventrale de la tranche coronale. Dans les coupes sagittales, NM et nucleus laminaris ou NL ont été identifiés là où les fibres nerveuses auditives sont entrées dans le groupe de neurones.

Le noyau olivaire supérieur a été identifié dans la région rostrolatérale. Des régions auditives caractéristiques de fréquence basse et élevée de NM et NL le long de l’axe rostrocaudal ont été observées. La tranche la plus médiale montrait les touffes axonales ipsilatérales et controlatérales et le point final de la région auditive.

Dans les tranches horizontales, NM et NL ont été identifiés vers la ligne médiane, et les neurones ont été répartis le long de l’axe médian latéral. Des tranches de tissu du tronc cérébral à un angle aigu par rapport à un plan horizontal ont montré les noyaux auditifs du tronc cérébral sur une grande diagonale. Les images agrandies ont montré l’axe tonotopique des noyaux auditifs le long de l’axe rostromédial à caudolatéral.

Assurez-vous que l’ensemble du processus est effectué dans du dACSF refroidi à la glace et continuellement recouvert d’oxygène carboxydé. Ce protocole est utilisé par les chercheurs qui étudient les propriétés anatomiques et biophysiques des microcircuits du tronc cérébral en développement, en particulier la relation entre les principaux noyaux auditifs.