Name: Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Découvrez la préparation de cultures primaires d'astrocytes et de microglies de rat pour étudier la signalisation calcique intracellulaire dans la sclérose latérale amyotrophique. Cette méthode permet une caractérisation biophysique détaillée.

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Ce travail a été soutenu par le contrat n ° 451-03-9/2021-14 / 200178 du ministère de l’Éducation, des Sciences et du Développement technologique de la République de Serbie, le projet FENS - NENS Education and Training Cluster « Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation » et la subvention EC H2020 MSCA RISE #778405. Nous remercions Marija Adžić et Mina Perić pour avoir fourni les images immunohistochimiques et Danijela Bataveljić pour leur aide dans la rédaction de documents.

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives de l’UE sur la protection des animaux à des fins scientifiques et avec l’autorisation de la Commission éthique de la Faculté de biologie de l’Université de Belgrade (numéro d’approbation EK-BF-2016/08). En ce qui concerne le matériel du patient (sérum pour les IgG), il a été recueilli pour un examen clinique de routine avec le consentement éclairé du patient conformément au Code de déontologie de l’Association médicale mondiale (Déclaration d’Helsinki) pour les expériences impliquant des humains. Le protocole a été approuvé par le comité d’éthique du Centre clinique de Serbie (n ° 850/6).
1. Préparation de la culture cellulaire primaire
<ol><li>Isolement des tissus cérébraux REMARQUE : L’isolement doit être effectué sur de la glace, en utilisant des solutions glacées.<ol><li>Utilisez des nouveau-nés âgés de 1 à 3 jours pour la culture cellulaire néonatale primaire33. NOTE: Pour l’étude présentée ici, Sprague Dawley hSOD1G93A et des rats non transgéniques ont été utilisés. Pour le génotypage, les queues de rats ont été utilisées pour l’extraction ultérieure de l’ADN et la PCR.</li>
		<li>Saupoudrez la tête du chiot avec de l’éthanol à 70% et décapitez-le immédiatement rapidement à l’aide de ciseaux.</li>
		<li>Coupez la peau à l’aide de ciseaux à petit angle pour exposer le crâne. Ouvrez le crâne en faisant une coupe du foramen magnum vers les orbites. Ensuite, faites une coupe perpendiculaire de la ligne médiane. Retirez le cerveau du crâne et placez-le dans une boîte de Petri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). REMARQUE: Nettoyez les outils entre les petits pour éviter la contamination croisée entre les chiots transgéniques et non transgéniques. L’isolement des cortex du reste du cerveau doit être fait sous un stéréomicroscope.</li>
		<li>À l’aide de la pointe de la pince, déchirez les connexions entre les deux hémisphères. Ensuite, séparez les hémisphères avec des pinces incurvées en poussant doucement un hémisphère du centre vers le côté.</li>
		<li>Retirez les méninges en les déchirant soigneusement avec des pinces droites et incurvées.</li>
		<li>Retirez l’hippocampe en le pinçant avec une pince incurvée. Jetez l’hippocampe ou utilisez-le pour une autre préparation de culture cellulaire. REMARQUE: D’autres étapes doivent être effectuées sous la hotte à flux laminaire pour assurer des conditions stériles.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogénéisation et dissociation tissulaires<ol><li>Transférer un cortex dans un tube de 15 mL rempli de 3 mL de PBS froid. Pipeter la suspension de haut en bas avec un embout de 1 mL, en effectuant 10-15 coups jusqu’à ce que la suspension devienne homogène. REMARQUE: Soyez très prudent de ne pas produire de bulles dans ce processus.</li>
		<li>Centrifuger à 500 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 3 mL de PBS froid en la pipetant de haut en bas avec un embout de 1 mL. Répétez l’étape de centrifugation. NOTA: Toutes les solutions utilisées à partir de ce point doivent être préchauffées à 37 °C.</li>
		<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 2 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) complet de Dulbecco, complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et d’antibiotiques (pénicilline et streptomycine). Transférer l’homogénat dans un tube de 2 mL.</li>
		<li>Passer l’homogénat à travers des aiguilles de 21 G et 23 G (trois fois chacune) pour faire une suspension de cellules individuelles. REMARQUE: Soyez très prudent de ne pas produire de bulles dans ce processus.</li>
	</ol></li>
	<li>Verser la suspension cellulaire préparée à partir d’un cortex dans une boîte de Petri de 60 mm de diamètre ou une fiole T25 (avec la surface prétraitée avec un revêtement polypeptidique pour la croissance des cellules adhérentes) contenant 3 mL de DMEM complet. Secouez légèrement la boîte de Petri afin que la suspension soit uniformément répartie.</li>
	<li>Cultiver les cellules dans l’incubateur dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2/95% d’air à 37 °C.</li>
	<li>Changez le milieu 48 h après l’isolement et remplacez le milieu tous les 3 jours.</li>
	<li>Pour favoriser la croissance des astrocytes, lorsque les cellules atteignent 70% à 80% de confluence, lavez-les avec du PBS préchauffé pour éliminer les cellules gliales faiblement attachées et les traces de FBS dans le milieu.<ol><li>Trypsiniser la couche sous-jacente des astrocytes en ajoutant 1 mL de solution de trypsine préchauffée (0,25% trypsine, 0,02% EDTA dans PBS, filtrée stérile).</li>
		<li>Placer le plat dans l’incubateur à 37 °C pendant 2-5 min.</li>
		<li>Vérifiez les cellules au microscope. Lorsqu’ils commencent à se détacher, ajoutez 4 mL de DMEM complet.</li>
		<li>Prélever la suspension cellulaire et la transférer dans un tube de 15 mL. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min.</li>
		<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu complet. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
		<li>Replaquer les cellules à une densité de 104 cellules/cm2 dans 5 mL de DMEM complet frais.</li>
	</ol></li>
	<li>Changez le milieu tous les 3 jours. Pour minimiser la présence d’autres types de cellules gliales, après que les astrocytes atteignent 50% de confluence et avant chaque remplacement de milieu, laver les cellules avec DMEM complet.<ol><li>Aspirer le milieu surnageant avec une pipette de 1 mL et le distribuer doucement sur la couche de cellules plusieurs fois. Assurez-vous que toute la surface de la couche cellulaire est couverte pendant cette étape de lavage.</li>
	</ol></li>
	<li>Une fois que les cellules atteignent 80% de confluence (généralement après 14 jours), répétez la trypsinisation et la collecte des astrocytes comme décrit à l’étape 1.6.</li>
	<li>Semence 5 × 103 d’astrocytes sur une lamelle circulaire de verre de 7 mm recouverte de poly-L-lysine (50 μg/mL). Utilisez-les dans des expériences après 48 h.</li>
	<li>Pour favoriser la microglie, après l’étape 1.7, permettre aux cellules gliales d’atteindre une couche confluente34. Lorsque des cellules microgliales apparaissent au-dessus de la couche astrocytaire (après 10-15 jours, reconnues par leurs corps plus petits et plus ovales et leurs processus plus courts), agitez la boîte de Petri sur un agitateur orbital pendant 2 h à 220 tr / min.</li>
	<li>Dispersion et ensemencement des cellules microgliales<ol><li>Lavez légèrement les cellules détachées et lâchement attachées en aspirant le milieu surnageant avec un embout de pipette de 1 ml et distribuez-le doucement sur la couche de cellules plusieurs fois. Assurez-vous de couvrir toute la surface de la couche cellulaire pendant cette étape de lavage, de recueillir le fluide avec les cellules détachées et de le transférer dans un tube de 15 mL.</li>
		<li>Centrifuger à 500 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu.</li>
		<li>Passez la suspension cellulaire à travers une aiguille de 21 G pour obtenir une suspension unicellulaire. NOTE: La plupart des méthodes publiées utilisent la trypsine ou la papaïne pour dissocier le tissu; Cependant, les aiguilles de 21 G ont l’avantage d’empêcher la surdigestion des cellules, permettant une dissociation plus douce.</li>
		<li>Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Semer 5 × 103 cellules microgliales sur une enveloppe circulaire en verre de 7 mm recouverte de poly-L-lysine (50 μg/mL). Utilisez-les dans des expériences après 48 h. NOTE: Il est difficile d’obtenir une culture microgliale pure par agitation, car les cellules précurseurs des oligodendrocytes et les astrocytes peuvent encore être présents en nombre variable selon l’expérience de l’expérimentateur. Le protocole immunocytochimique utilisé pour estimer la présence de différentes populations cellulaires dans les cultures gliales a été décrit ailleurs35.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Immunocytochimie
<ol><li>Rincer les cellules plaquées sur des lamelles de couverture dans PBS, 2 x 1 min.</li>
	<li>Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Laver en PBS 3 x 5 min.</li>
	<li>Incuber dans une solution de blocage contenant 10 % de sérum d’âne normal (NDS)/1 % d’albumine sérique bovine (BSA)/0,1 % de Triton X-100 pendant 45 min à TA.<ol><li>Ajouter 50 μL d’une solution de blocage par lamelle de couverture de 10 mm de diamètre.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer les anticorps primaires dans 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 dans les dilutions suivantes : souris anti-GFAP 1:300, chèvre anti-Iba1 1:500. Incuber les cellules avec des anticorps primaires pendant une nuit à +4 °C.</li>
	<li>Rincer dans PBS, 3 x 10 min.</li>
	<li>Incuber avec les anticorps secondaires conjugués à un fluorophore : âne anti-souris (excitation 488 nm [1:200)) ou âne anti-chèvre (excité à 647 nm [1:200)). Incuber les cellules pendant 2 h à RT dans l’obscurité.</li>
	<li>Lavage au PBS, 7 x 5 min.</li>
	<li>Incuber les cellules avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1:4 000) pendant 10 min à TA.</li>
	<li>Laver en PBS 5 x 5 min.</li>
	<li>Monter les lames de couverture sur des lames de microscope à l’aide d’une solution de montage; Utilisez une goutte de celui-ci par feuillet de couverture. REMARQUE : Les dilutions d’anticorps peuvent varier selon le producteur. Les utilisateurs doivent déterminer les dilutions optimales pour leurs expériences.</li>
</ol>3. Imagerie vidéo accélérée
REMARQUE: Les solutions contenant le colorant fluorescent doivent être protégées de la lumière directe. Avant de commencer l’expérience d’imagerie, assurez-vous que la lamelle de couverture en verre ne bouge pas lorsque vous allumez la perfusion.
<ol><li>Préparation des solutions et des cellules<ol><li>Préparer la solution extracellulaire (SEC) pour l’imagerie : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose et 10 mM HEPES. Ajustez le pH à 7,4. S’assurer que l’osmolarité est de 280-300 mOsm/kg et préparer le SEC sans Ca2+ : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES, et 0,1 mM EGTA.</li>
		<li>Préparer les solutions d’essai : 100 μM d’ATP dissous dans ECS, 1 μM Thg dans ECS sans Ca2+ et 0,1 mg/mL d’ALS IgG dans ECS8.</li>
		<li>Transférer une housse dans un plat avec ECS pour laver le DMEM complet. Préparer la solution de chargement de colorant en diluant 1 mM de solution mère de Fluo-4 AM avec ECS à la concentration finale de 5 μM de Fluo-4 AM.<ol><li>Placer la lamelle de couverture avec les cellules dans la solution de chargement de colorant pendant 30 min à TA dans l’obscurité. Lavez les cellules dans ECS pendant 20 min.</li>
		</ol></li>
		<li>Si les cellules ne sont pas suffisamment chargées (c.-à-d. si le niveau de fluorescence de base est trop faible - <5 % de la plage dynamique de la caméra avec un temps d’exposition supérieur à 400 ms), augmenter le temps de chargement jusqu’à 45 min à 1 h à 37 °C. Vous pouvez également mélanger la solution mère de Fluo-4 AM avec un volume égal de détergent à 20% (p / v) (Pluronic) dans du DMSO avant de diluer dans l’ECS, ce qui rend la concentration finale de Pluronic ~ 0,02%. NOTE: Les exemples expérimentaux de cette étude ont été réalisés avec des IgG humaines isolées à partir de sérums sanguins de patients SLA comme décrit précédemment 4,5,11. Chaque expérience a été réalisée avec des échantillons d’IgG d’un seul patient.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagerie vidéo REMARQUE: Dans ce protocole, le système d’imagerie vidéo a été combiné avec une lampe à arc court au xénon, un système de polychromateur et un microscope à épifluorescence inversée équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau, la glycérine et l’huile. L’imagerie timelapse a été réalisée à l’aide d’un système d’appareil photo numérique.<ol><li>Allumez les composants de la configuration d’imagerie 15 min avant l’expérience pour permettre au système d’atteindre la température de fonctionnement.</li>
		<li>Placez la lamelle de recouvrement dans la chambre d’enregistrement avec 1 mL de solution de travail (ECS ou ECS sans Ca2+).</li>
		<li>Pour choisir le protocole d’imagerie approprié, ouvrez le logiciel d’imagerie et, dans le panneau Acquisition, choisissez les paires de filtres pour Fluo4-AM avec une longueur d’onde d’excitation à 480 nm, un miroir dichroïque à 505 nm et une longueur d’onde d’émission à 535 nm.</li>
		<li>Choisissez le champ de vision en prenant soin d’avoir un nombre constant de cellules tout au long de l’expérience. Régler le temps d’exposition et le gain du détecteur de manière appropriée, de manière à ce que le signal ne soit pas saturé. Choisissez le mode pseudocolor pour l’acquisition. Pour des instructions plus détaillées, reportez-vous au manuel fourni par le fabricant.</li>
		<li>Ajustez la fréquence d’échantillonnage à 1 Hz (1 image par seconde).</li>
		<li>Commencez l’imagerie en acquérant le niveau de fluorescence de base pendant 3-5 minutes pour la détermination de la ligne de base (F0). Assurer un flux constant de la solution de travail.</li>
		<li>Arrêtez le flux de la solution de travail et passez à la solution d’essai pendant la durée souhaitée (voir également les barres de temps dans les exemples de la Figure 2 et de la Figure 3). Entre chaque solution d’essai, laver les cellules avec un débit constant de la solution de travail pendant 3-5 min.</li>
		<li>Maintenir le volume de la solution dans la chambre d’enregistrement à ~1 mL en organisant une aspiration constante à partir du haut de la solution (voir Figure 2E). REMARQUE : Pour appliquer le traitement directement aux cellules imagées, un système d’administration personnalisé constitué d’une pipette en verre (0,8 mm de diamètre intérieur) a été placé à ~350 μm de distance et ~1 mm au-dessus des cellules, à un angle de 45° combiné avec le système d’échange de solution contenant des vannes à pincement et un contrôleur électronique de vanne (voir Figure 2E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analyse des données
<ol><li>Définissez une région d’intérêt (ROI) qui correspond à la cellule individuelle.<ol><li>Choisissez l’image avec l’intensité du signal la plus élevée (c’est-à-dire à partir de l’application de l’ATP) et encerclez une cellule à l’aide de l’outil polygonal d’application. Répétez l’opération pour toutes les cellules du champ acquis. Choisissez cinq ROI en arrière-plan à l’aide de l’outil Cercle.</li>
		<li>Pour mesurer l’intensité moyenne du signal d’une seule cellule et l’arrière-plan pour chaque période, sélectionnez tous les ROI et utilisez la commande Multi Measure dans ROI Manager dans ImageJ ou toute commande équivalente dans les logiciels commerciaux (voir le Tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
	<li>Exportez les valeurs d’intensité du signal moyen des ROI sous forme de feuille de calcul.</li>
	<li>Faites la moyenne de cinq ROI d’arrière-plan et soustrayez l’arrière-plan moyen de chaque image de l’intensité moyenne de ROI de l’image acquise en même temps.</li>
	<li>Pour normaliser les données obtenues par rapport au signal de base, utilisez l’équation (1) : ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1) où F est l’intensité du signal de chaque période après la soustraction de fond, et F0 est la fluorescence Fluo-4 de base. REMARQUE : Un code sur mesure a été utilisé dans cette étude.</li>
	<li>Pour analyser l’activité calcique, déterminer plusieurs paramètres4 : l’amplitude du pic calcique (ΔF/F 0), le changement intégré (intégrale temporelle, surface sous l’enregistrement de la réponse) du calcium transitoire (ΔF/F 0 × s), le temps jusqu’au pic-temps écoulé entre le début de la stimulation et le maximum de transitoire(s) calcique(s), le temps d’élévation écoulé depuis le début de la stimulation jusqu’à la valeur de ΔF/F0 qui atteint 50%-80% de l’amplitude maximale (s), demi-largeur-pleine largeur d’un transitoire à demi-amplitude maximale (s), fréquence des réponses si elles sont répétitives (Hz).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Cet article présente la méthode de culture cellulaire primaire comme un outil rapide et « sur le budget » pour étudier différents aspects de la (physionomie) cellulaire tels que la SLA dans le modèle hSOD1G93A du rat. La technique convient donc à des études au niveau unicellulaire qui peuvent être extrapolées et étudiées plus avant à un niveau d’organisation plus élevé (c.-à-d. dans des tranches de tissu ou chez un animal vivant). La culture cellulaire en tant que technique, cependant, a quelques mises en gard...

Les techniques de culture cellulaire ont donné lieu à de nombreux progrès dans divers domaines de la neurophysiologie cellulaire dans la santé et la maladie. En particulier, les cultures de cellules primaires, fraîchement isolées du tissu neuronal d’un animal de laboratoire, permettent à l’expérimentateur d’étudier de près le comportement de diverses cellules dans différents milieux biochimiques et configurations physiologiques. L’utilisation de différents indicateurs physiologiques fluorescents tels que les colorants sensibles au Ca2+ en combinaison avec la microscopie vidéo time-lapse permet de mieux comprendre les processus biophysiques et biochimiques cellulaires en temps réel.
La SLA est une maladie neurodégénérative dévastatrice qui affecte les motoneurones supérieurs et inférieurs1. La maladie présente une pathogenèse complexe de type familial mais surtout de forme sporadique (90% des cas)2. Il est bien connu que les mécanismes autonomes non cellulaires contribuent à la physiopathologie de la SLA, principalement en raison du rôle essentiel des cellules gliales3. La SLA est également bien caractérisée comme une maladie neuroinflammatoire avec implication de facteurs humoraux et cellulaires de l’inflammation.
L’immunoglobuline G est largement utilisée comme marqueur moléculaire de la SLA et d’autres maladies neurodégénératives. L’étude du taux sérique de ce marqueur peut indiquer la présence et le stade de la neuroinflammation dans la maladie 4,5,6, tandis que sa présence dans le liquide céphalorachidien peut indiquer une brèche de la barrière hémato-encéphalique7. Les IgG ont également été identifiées comme des dépôts dans les motoneurones de la moelle épinière de patients atteints de SLA7. Néanmoins, cette approche a montré quelques incohérences dans la corrélation du taux d’IgG avec le stade et les caractéristiques de la maladie6.
Les IgG isolées à partir des sérums de patients atteints de SLA (IgG SLA) peuvent induire une réponse calcique dans les astrocytesnaïfs 8 et la libération de glutamate dans les neurones, ce qui indique un effet excitotoxique - une caractéristique de la pathologie de la SLA9. Cependant, des études sur le modèle de rat hSOD1G93A ALS (contenant plusieurs copies de la mutation humaine SOD110) ont montré un certain nombre de marqueurs du stress oxydatif dans les cellules neurogliales en culture11, les tissus 12,13,14 ou les animaux vivants 13. Il est à noter que les astrocytes cultivés à partir du modèle de rat SLA étaient plus sujets au stress oxydatif induit par le peroxyde que les astroglies de compagnons de portée non transgéniques11.
Les cellules microgliales en culture sont affectées par les IgG de la SLA d’une manière moins apparente. À savoir, une lignée cellulaire microgliale BV-2 a montré une augmentation du signal provenant de marqueurs fluorescents du stress oxydatif en réponse à l’application de seulement 4/11 échantillons de patients atteints d’IgG SLA15. Il est bien connu que la microglie participe à de nombreuses pathologies neuroinflammatoires, ajoutant au stress oxydatif et à la phase de progression tardive dans le mécanisme autonome non cellulaire de la SLA16,17. Néanmoins, les données avec les IgG de la SLA ont indiqué que ces cellules peuvent ne pas être aussi réactives que les astrocytes à ces facteurs humoraux de l’inflammation de la SLA. Plusieurs études ont été menées avec des astrocytes primaires à partir de modèles murins de SLA, non seulement chez les petits mais aussi chez les animaux symptomatiques, soit sur le cerveau, soit sur la moelle épinière 18,19,20,21. Cela est également vrai pour les cultures primaires microgliales, bien que dans une moindre mesure que les astrocytes et principalement à partir de régions du cerveau au stade embryonnaire22,23,24.
Nous utilisons l’imagerie vidéo accélérée de Ca2+ sur des cellules en culture principalement comme moyen de suivre les transitoires intracellulaires de cet ion en tant que marqueur physiologique de l’excitotoxicité. Ainsi, par la caractérisation biophysique de ces transitoires (amplitude, aire sous transitoire, temps de montée, fréquence) le chercheur peut obtenir des paramètres diagnostiques expérimentaux à partir de divers modèles cellulaires de neurodégénérescence. Cette technique offre donc l’avantage d’une évaluation physiologique quantitative des IgG en tant que biomarqueurs de la maladie. Il existe une abondante littérature sur le rôle des IgG et du Ca2+ dans l’induction de la SLA. La plupart de ces études ont été réalisées en induisant la SLA en injectant des IgG à des patients 25,26,27,28,29, qui ont ensuite montré une élévation intracellulaire du Ca 2+ et des dépôts d’IgG. Une série d’études a exploré l’effet des IgG de la SLA sur la synapse motrice in vitro30,31,32. Dans le contexte ci-dessus, la technique présentée ici met l’accent sur les cellules gliales en tant qu’acteurs importants du mécanisme autonome non cellulaire de la SLA et quantifie leur réponse excitotoxique potentielle aux IgG en tant que facteurs humoraux de la neuroinflammation. Cette approche peut avoir une application plus large dans le test d’autres facteurs humoraux tels que les sérums entiers, le LCR ou les cytokines dans différents systèmes de culture cellulaire et dans des modèles cellulaires d’inflammation générale.
Cet article décrit comment préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir des cortex de rats Sprague Dawley et comment utiliser davantage ces cellules pour étudier la physiopathologie de la SLA avec des IgG dérivées de sérums de patients. Les protocoles sont détaillés pour le chargement de colorant des cellules en culture (Figure 1) et les enregistrements des changements de Ca2+ dans les expériences d’imagerie vidéo accélérée. Des exemples d’enregistrements vidéo montreront comment les cellules gliales réagissent aux IgG de la SLA par rapport à l’ATP, ce dernier activant les récepteurs de la membrane purinergique. Pour la première fois, on montre un exemple sur la façon dont les astrocytes isolés du cerveau de rat hSOD1G93A de la SLA réagissent avec une réponse Ca 2+ plus prononcée aux IgG de la SLA par rapport aux témoins non transgéniques et comment relier ce processus aux différences dans le fonctionnement du magasin Ca2+. On montre également un exemple d’imagerie calcique dans les cellules microgliales fortement défiées par les IgG SLA, avec seulement une réponse modeste du calcium intracellulaire.

<table><tbody><tr><td>Tube de 15 mL</td><td>Sarstedt, Allemagne</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 2 mL</td><td>Sarstedt, Allemagne</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 21 G</td><td>Nipro, Japon</td><td>HN-2138-ET</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 23 G</td><td>Nipro, Japon</td><td>HN-2338-ET</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 5 mL</td><td>Nipro, Japon</td><td>SY3-5SC-EC</td><td></td></tr><tr><td>Lamelle en verre circulaire de 6 mm</td><td>Menzel Glasser, Allemagne</td><td>630-2113</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri de 60 mm</td><td>ThermoFisher Sientific, États-Unis</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver A1</td><td>Carl Zeiss, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>2110</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Âne-anti chèvre AlexaFluor 647 IgG</td><td>anticorps Invitrogen, USA</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>Âne-anti souris AlexaFluor 488 IgG</td><td>anticorps Invitrogen,</td><td>États-Unis A-21202</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>" evolve"-EM 512 Système d’appareil photo numérique</td><td>Photométrie, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, États-Unis</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fidji Logiciel ImageJ</td><td>Open source sous la licence</td><td></td><td></td>publique générale GNU</tr><tr><td>FITC jeu de filtres</td><td>Chroma Technology Inc., États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires Fluo-4 AM</td><td>, États-Unis</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1 pour chèvres</td><td>Fujifilm Wako Chemicals, États-Unis</td><td>011-27991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biowest, France</td><td>P5455</td><td></td></tr><tr><td>Système d’échange de solutions à grande vitesse</td><td>ALA Scientific Instruments, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>Math Works, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-GFAP</td><td>Merck Millipore, USA</td><td>MAB360</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>324590</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline et Streptomycine</td><td>ThermoFisher Sientific, États-Unis</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium</td><td>Carlo Erba Reagents, Espagne</td><td>471686</td><td></td></tr><tr><td>Shaker DELFIA PlateShake</td><td>PerkinElmer Life Sciencies, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate dibasique heptahydraté</td><td>Carl ROTH GmbH</td><td>X987.2</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargine</td><td>Tocris Bioscience, Royaume-Uni</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Osmomètre à pression de vapeur Vapro 5520</td><td>Wescor, ELITechGroup Inc., États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiFluor Imaging System</td><td>Visitron System Gmbh, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiChrome Polychromator System</td><td>Visitron System Gmbh, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Configuration haute performance VisiView</td><td>Visitron System Gmbh, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampe à arc court au xénon</td><td>Ushio, Japon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Ce protocole montre comment préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir des cortex de rats Sprague Dawley et comment utiliser ces cellules dans le but d’étudier la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) dans le modèle hSOD1G93A du rat. Tout d’abord, le protocole montre comment isoler et cultiver les astrocytes et les microglies à partir de cortex postnatal de rat, puis comment caractériser et tester la pureté de ces cultures par immunocytochimie en utilisant le marqueur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) des astrocytes et le marqueur microglial de la molécule ionisée liant le calcium 1 (Iba1). Dans l’étape suivante, des méthodes sont décrites pour la charge de colorant (Fluo 4-AM sensible au calcium) des cellules en culture et les enregistrements des changements Ca2+ dans des expériences d’imagerie vidéo sur des cellules vivantes.
Les exemples d’enregistrements vidéo sont les suivants: (1) cas d’imagerie Ca2+ d’astrocytes en culture exposés de manière aiguë à l’immunoglobuline G (IgG) isolée chez des patients atteints de SLA, montrant une réponse caractéristique et spécifique par rapport à la réponse à l’ATP démontrée dans la même expérience. Les exemples montrent également une augmentation transitoire plus prononcée de la concentration intracellulaire de calcium évoquée par les IgG de la SLA dans les astrocyteshSOD1 G93A par rapport aux témoins non transgéniques; (2) imagerie Ca 2+ d’astrocytes en culture lors d’un épuisement des réserves de calcium par la thapsigargine (Thg), un inhibiteur non compétitif de l’ATPase du réticulum endoplasmiqueCa2+, suivie d’une entrée de calcium opérée en magasin provoquée par l’ajout de calcium dans la solution d’enregistrement, qui démontre la différence entre le fonctionnement du magasin Ca2+ dans hSOD1G93A et dans les astrocytes non transgéniques; (3) L’imagerie Ca 2+ de la microglie en culture montrant principalement un manque de réponse aux IgG SLA, tandis que l’application d’ATP a provoqué un changement Ca2+. Cet article met également l’accent sur les mises en garde et les mises en garde possibles concernant la densité cellulaire critique et la pureté des cultures, le choix de la concentration correcte du colorant Ca2+ et les techniques de chargement du colorant.

Caractérisation de différents types de cellules gliales en culture Il faut généralement 15 à 21 jours pour produire des astrocytes pour les expériences, tandis que les cellules microgliales prennent 10 à 15 jours pour se développer. Une immunocoloration a été effectuée pour évaluer la pureté cellulaire de la culture. La figure 1 montre l’expression du double marquage du marqueur astrocytaire GFAP et du marqueur microglial Iba1 dans les cultures respectives.
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Nous présentons ici un protocole sur la façon de préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir de cortex de rat pour l’imagerie vidéo time-lapse de Ca2+ intracellulaire pour la recherche sur la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique dans le modèle de rat hSOD1G93A .

Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Ce protocole permet de révéler le schéma de signalisation calcique intercellulaire qui caractérise chaque type de réponse cellulaire en santé ainsi qu’en maladie. Cette technique permet une caractérisation biophysique rapide et détaillée du comportement cellulaire complexe. Nous prévoyons d’utiliser cette signalisation calcique induite par les IgG comme empreinte digitale pour la médecine personnalisée des maladies neuroinflammatoires.Dans la vie réelle, il n’est pas facile de voir et de suivre tous les processus et événements, en particulier ceux qui se produisent au microscope. Par conséquent, les données visuelles sont importantes. Après avoir décapité des chiots âgés d’un à trois jours, exposez le crâne en coupant la peau à l’aide de petits ciseaux inclinés.Ensuite, ouvrez le crâne en coupant le foramen magnum vers les orbites et faites une coupe perpendiculaire médiane. Retirez le cerveau du crâne et placez-le dans une boîte de Petri contenant du PBS. Utilisez la pointe de la pince pour déchirer les connexions entre les deux hémisphères et séparez les hémisphères avec des pinces incurvées en poussant doucement un hémisphère du centre vers le côté.Utilisez des pinces droites et incurvées pour enlever les méninges en les déchirant soigneusement. Ensuite, retirez l’hippocampe en le pinçant avec une pince incurvée et jetez-le ou utilisez-le pour une autre préparation de culture cellulaire. Ensuite, transférez le cortex dans un tube de 15 millilitres contenant trois millilitres de PBS froid et homogénéisez le tissu en pipetant de haut en bas 10 à 15 fois avec une pointe d’un millilitre.Centrifuger les cellules à 500 g pendant cinq minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans trois millilitres de PBS froid en pipetant avec un embout d’un millilitre. Centrifuger à nouveau, et remettre en suspension la pastille dans deux millilitres de DMEM complet complété par 10% FBS et antibiotiques.Après avoir transféré l’homogénat dans un tube de deux millilitres, passez l’homogénat à travers des aiguilles de calibre 21 et 23 pour fabriquer une suspension de cellules individuelles. Versez la suspension cellulaire préparée à partir d’un cortex dans une boîte de Petri de 60 millimètres contenant trois millilitres de DMEM complet et secouez légèrement la boîte de Pétri de manière à ce que la suspension soit uniformément répartie. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’air à 37 degrés Celsius.Pour favoriser la croissance des astrocytes, retirez les anciens milieux et lavez la cellule avec du PBS préchauffé pour éliminer les cellules gliales faiblement attachées et les traces de FBS une fois qu’elles atteignent 70 à 80% de confluence. Ensuite, trypsiniser la couche sous-jacente d’astrocytes en ajoutant un millilitre de solution de trypsine préchauffée et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes. Utilisez un microscope pour vérifier si les cellules commencent à se détacher et ajoutez quatre millilitres de DMEM complet.Récupérez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifuger le tube à 500 g pendant cinq minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un millilitre de milieu complet.Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, préparez le plat de culture et ajoutez le milieu de culture. Replaquez les cellules à une densité de 10 à la quatrième cellule par centimètre carré dans cinq millilitres de DMEM complet frais et lavez les cellules avec du DMEM complet avant chaque remplacement de support.Après avoir atteint 70 à 80% de confluence, répéter la trypsinisation et semer cinq fois 10 aux astrocytes tiers sur un couvercle en verre circulaire recouvert de poly-L-lysine de sept millimètres. Laissez-les fixer pendant 10 minutes et ajoutez un DMEM complet. Utilisez-les dans des expériences après 48 heures.Après avoir préparé les cultures microgliales, pour favoriser la microglie, permettre aux cellules gliales de devenir confluentes et la microglie apparaîtra au-dessus de la couche astrocytaire après 10 à 15 jours. Secouez la boîte de Petri sur un agitateur orbital pendant deux heures à 220 tr / min. Maintenant, lavez légèrement les cellules détachées et lâchement attachées en aspirant le surnageant avec un embout de pipette d’un millilitre.Distribuez doucement le surnageant sur la couche de cellules plusieurs fois, en veillant à couvrir toute la surface de la couche cellulaire pendant cette étape de lavage. Recueillez le milieu avec les cellules détachées et transférez-le dans un tube de 15 millilitres. Centrifuger, remettre en suspension et compter les cellules comme démontré précédemment.Ensemencez cinq fois 10 à la troisième microglie sur un couvercle circulaire en verre recouvert de poly-L-lysine de sept millimètres. Laissez-les fixer pendant 10 minutes et ajoutez un DMEM complet. Utilisez-les dans des expériences après 48 heures.Pour laver le DMEM complet, transférer un couvercle dans une boîte avec une solution extracellulaire. Préparer la solution de charge de colorant en diluant une Fluo-4 AM millimolaire avec une solution extracellulaire pour obtenir la concentration finale de cinq micromolaires. Placez le couvercle avec les cellules dans la solution de chargement de colorant pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité et lavez les cellules dans une solution extracellulaire pendant 20 minutes.Placez le couvercle dans la chambre d’enregistrement avec un millilitre de solution de travail. Choisissez le champ de vision ayant un nombre constant de cellules tout au long de l’expérience. Démarrez l’imagerie et déterminez la ligne de base en acquérant le niveau de fluorescence de base pendant trois à cinq minutes.Arrêtez ensuite le flux de la solution de travail et passez à la solution de test pendant la durée souhaitée. Entre chaque solution d’essai, laver les cellules avec un flux constant de la solution de travail pendant trois à cinq minutes. Maintenez le volume de la solution dans la chambre d’enregistrement à un millilitre en organisant une aspiration constante par le haut de la solution.Choisissez l’image d’intensité de signal la plus élevée et encerclez une cellule à l’aide de l’application d’outil Polygonal. Après avoir encerclé toutes les cellules du champ acquis, choisissez cinq régions d’intérêt en arrière-plan à l’aide de l’outil Cercle. Mesurez ensuite l’intensité moyenne du signal d’une seule cellule et l’arrière-plan pour chaque période.Sélectionnez toutes les régions d’intérêt et utilisez la commande Multi-Mesure dans ROI Manager dans ImageJ, ou toute commande équivalente dans les logiciels commerciaux. Après avoir importé les données dans le logiciel MATLAB, faites la moyenne de cinq ROI d’arrière-plan et soustrayez l’arrière-plan moyenné de chaque image de l’intensité moyenne de ROI des images acquises simultanément. Plus tard, analysez l’activité du calcium en déterminant l’amplitude du pic de calcium, le changement intégré du transitoire calcique, le temps jusqu’au pic, le temps de montée, la demi-largeur et la fréquence.GFAP est utilisé pour visualiser les astrocytes et Iba1 pour visualiser la microglie. Les astrocytes hSOD1G93A répondent à l’immunoglobuline G de la SLA avec une plus grande amplitude du transitoire calcique, un changement intégré global plus considérable et un temps de pic plus court que les astrocytes non transgéniques. La réponse à l’immunoglobuline G de la SLA se distingue de la réponse à l’ATP.Les astrocytes hSOD1G93A avaient un niveau plus élevé d’ions calcium dans les réserves, comme le révèle l’épuisement des réserves, indiquant une surcharge de cet ion. Les microglies ont été cultivées et l’intensité moyenne de fluorescence a été extraite au fil du temps. Les traces de calcium de trois cellules représentaient qu’une seule cellule répondait à l’immunoglobuline G de la SLA, tandis que toutes les cellules répondaient à l’ATP.Les images pseudo-couleur représentaient l’intensité de fluorescence et la ligne de base en réponse à la SLA, aux IgG et à l’ATP. Les cellules doivent être correctement chargées et les paramètres du système d’imagerie doivent être ajustés de manière appropriée, afin que le signal ne soit pas séparé pendant l’expérience. En plus de l’émission de calcium, le serrage du patch peut être effectué.Ainsi, une image plus complète de la corrélation entre les différents courants d’ions membranaires et les émissions de calcium peut être obtenue. La compréhension de l’homéostasie calcique intracellulaire est d’une importance essentielle pour l’exploration de plusieurs réponses aux stimuli naturels ainsi qu’aux stimuli stressants et externes.

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Découvrez la préparation de cultures primaires d'astrocytes et de microglies de rat pour étudier la signalisation calcique intracellulaire dans la sclérose latérale amyotrophique. Cette méthode permet une caractérisation biophysique détaillée.

Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique

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