Test génétique préimplantatoire pour l’aneuploïdie sur une plateforme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs

Ce protocole présente la procédure allant de l’amplification d’une cellule unique aux données de déclaration finale dans le test génétique préimplantatoire pour l’aneuploïdie sur une plate-forme de séquençage de nouvelle génération basée sur des semi-conducteurs. Cette procédure peut aider les téléspectateurs à bien comprendre le flux de travail expérimental du séquençage PGT-A et à reproduire cette technique dans un laboratoire de diagnostic avec une plate-forme NGS à base de semi-conducteurs. Commencez par pipeter 25 microlitres des produits d’amplification du génome entier et transférez-les dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre préchargé de 25 microlitres d’eau sans nucléase.

Vortex et mélanger les perles de purification de l’ADN. Aliquote 50 microlitres de cette solution dans chaque tube d’échantillonnage. Vortex et centrifugation brièvement pendant cinq secondes.

Réglez le tube pendant cinq minutes à température ambiante pour le processus de liaison à l’ADN. Insérez le tube centrifuge de 1,5 millilitre dans un rack magnétique. Ensuite, attendez que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale du tube.

Transférez délicatement le surnageant dans un nouveau tube centrifuge de 1,5 millilitre. Évitez de pipeter les perles. Selon le volume d’échantillon original.

Pipette 30 microlitres de billes magnétiques, vortex et centrifugeuse brièvement pendant cinq secondes. Réglez le tube pendant cinq minutes à température ambiante pour le processus de liaison à l’ADN. Insérez les tubes centrifuges de 1,5 millimètre dans le rack magnétique.

Ensuite, attendez que toutes les billes magnétiques soient attirées par la paroi latérale du tube. Retirez et jetez soigneusement le surnageant. Évitez de pipeter les perles.

Pipeter 300 microlitres d’éthanol à 70% dans le tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Ensuite, tournez doucement le tube deux fois à un angle de 180 degrés et déplacez les billes le long de la paroi du tube pour un lavage complet. Pipeter et jeter le surnageant.

Évitez de pipeter les perles. Répétez la procédure de lavage une fois. Placez une nouvelle plaque d’amplification dans le système une fois le programme de nettoyage terminé.

Insérez les tubes de collecte, chacun prérempli de 150 microlitres brisant la solution deux dans le rotor, puis placez le pont sur les tubes de collecte. Ajouter l’huile de réaction à la moitié du tube et la solution de rupture de l’émulsifiant à un tiers du tube. Placez un nouveau filtre pour la préparation du gabarit sur un support tubulaire avec le portail d’échantillon positionné vers le haut.

Vortex la solution pendant cinq secondes et centrifuger brièvement pendant cinq secondes. Transférez ensuite la solution dans le portail d’échantillon du filtre après avoir pipeté 800 microlitres trois fois. Centrifuger le tube pour diminuer les bulles avant la dernière injection.

Évitez d’injecter de l’air dans le filtre. Injecter 200 microlitres d’huile de réaction deux, en suivant la solution mélangée. Tournez le portail d’échantillon du filtre vers le bas et remplacez l’adaptation au lavage par le filtre.

Insérez l’aiguille de l’échantillon dans le trou central du couvercle du rotor, puis appuyez sur l’aiguille vers le bas. Cliquez sur le bouton Exécuter à l’écran et choisissez le programme en fonction du kit correspondant. Sélectionnez ensuite Assisté pour cocher toutes les étapes.

Cliquez sur Suivant jusqu’à ce que l’exécution soit lancée. La course durera environ 4,5 heures. Sélectionnez Suivant à la fin du programme.

Le système lancera un processus de centrifugation de 10 minutes. Après la centrifugation, cliquez sur le bouton Ouvrir le couvercle et déplacez les tubes de collecte vers des racks. Si la procédure ne passe pas à l’étape suivante dans 15 minutes, appuyez sur le spin final pour recentrifuger.

Retirez le surnageant dans le tube de collecte, en laissant 100 microlitres de solution dans le tube. Mélanger l’échantillon restant par pipetage et transférer l’échantillon dans le nouveau tube à centrifuger de 1,5 millilitre marqué OT. Lorsque vous pipetez le surnageant, évitez de toucher le fond du tube le long des côtés. Pipeter 100 microlitres d’eau sans nucléase dans chaque tube de collecte et transférer la solution dans le tube OT lavé par pipetage répété.

Ajoutez 600 microlitres d’eau sans nucléase au tube OT pour constituer le volume total d’un millilitre. Vortex pendant 30 secondes dans la centrifugeuse à 15 500 fois G pendant huit minutes. Retirer délicatement le surnageant en laissant 100 microlitres de solution dans le tube OT.

Utilisez l’embout pour éliminer complètement la couche d’huile. Ajouter 900 microlitres d’eau sans nucléase, vortex pendant 30 secondes et centrifuger à 15 500 fois G pendant huit minutes. Retirez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 20 microlitres de la solution et ajoutez la solution de remise en suspension du gabarit pour constituer le volume de 100 microlitres.

Puis vortex pendant 30 secondes et centrifuger brièvement pendant deux secondes. Passez à l’étape suivante dans les 12 heures suivant le traitement de l’échantillon Chargez 100 microlitres de la bibliothèque diluée, 130 microlitres de billes C1, 300 microlitres de trois x solution de lavage à gabarit et 300 microlitres de la solution fondue dans les huit bandes de puits. Installez les huit bandes de puits sur le module d’enrichissement, chargez la pointe de pipetage et placez le tube centrifuge de 200 microlitres en position de collecte.

Cliquez sur Démarrer pour exécuter le programme. Pipeter 55 microlitres de la solution échantillon et l’injecter dans le trou d’échantillon de la puce. Placez la puce sur la centrifugeuse.

Gardez l’encoche vers l’extérieur et le portail d’échantillon vers l’intérieur. Ensuite, équilibrez-le avec une autre puce usagée et centrifugez pendant 10 minutes. Préparez la solution de chargement comme décrit dans le manuscrit du texte.

Soufflez 100 microlitres d’air dans la solution moussante. Pipeter la solution à plusieurs reprises jusqu’à ce que les bulles soient dans un état dense et moussant et maintenir le volume de mousse à environ 250 microlitres. Placez la puce sur le banc après la centrifugeuse.

Injectez 100 microlitres de mousse dans le trou de l’échantillon et retirez la solution extrudée dans le portail de sortie. Ensuite, centrifugez brièvement la puce pendant 30 secondes. Répétez ce processus une fois.

Injectez 100 microlitres à 50% de tampon de lavage deux fois et retirez la solution extrudée dans le portail de sortie après chaque injection. Injectez ensuite trois fois 100 microlitres à 50% de tampon de recuit et retirez la solution extrudée dans le portail de sortie après chaque injection. Injectez 65 microlitres à 50% de tampon de réaction enzymatique, en évitant les bulles et retirez la solution extrudée dans le portail de sortie.

Stabilisez la puce chargée à température ambiante pendant cinq minutes et installez la puce sur le portail de puce du séquenceur. Choisissez le programme planifié, vérifiez les informations et démarrez l’exécution. L’exécution représentative a obtenu un total de données de 17,6 gigaoctets et le taux de charge global de la particule de sphère ionique était de 88% dans le total des puits de la puce.

La carte thermique a confirmé la charge uniforme de l’échantillon sur la surface totale de la puce. 77 % du total des lectures étaient utilisables. Tous les puits chargés d’ISP ont montré un enrichissement de modèles de 100% dans lequel 78% étaient clonaux.

Sur l’ensemble des modèles clonaux, 97 % ont été qualifiés de bibliothèque finale. La durée moyenne de la lecture était de 177 paires de bases, tandis que la médiane et le mode étaient respectivement de 176 et 174 paires de bases. Les nombres maximaux de thymine, de cytosine et d’adénine dans les gabarits étaient d’environ 76 au-dessus de la ligne de coupure admissible de 50.

Dans tous les puits adressables avec des FAI actifs, 99,5 % ont été qualifiés de bibliothèque construite et 20 % des bibliothèques polyclonales et de faible qualité ont été filtrées, tandis que 76,6 % des FAI ont été qualifiés pour une analyse plus approfondie. Le résultat de la variance du nombre de copies d’un seul échantillon a représenté une trisomie mosaïque de 182,16 paires de mégabases de P 16,3 à Q 35,2 sur le chromosome quatre et un segment de monosomie de 33 points de 13 paires de mégabases de Q 11,1 à Q 13,33 sur le chromosome 22. Lors de la sélection des fragments, les intervalles de temps entre les étapes doivent être modifiés en fonction de la taille des échantillons du même lot afin d’éviter le surrisque et le manque d’exposition des échantillons avant et arrière.