Name: Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Découvrez un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères. Cette méthode permet d'étudier les effets des protéines de liaison à l'ARN sur la biogenèse des microARN.

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Les auteurs remercient E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapour) pour les cellules HeLa-Cre et les plasmides pRD-RIPE et pCAGGS-Cre. Nous remercions Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes et Anselmo Moriscot pour leur soutien.

Une vue d’ensemble du protocole décrit ici est illustrée à la figure 1.
1. Construction plasmidique
<ol><li>pCAGGS-Cre: Ce plasmide a été fourni par le Dr E. Makeyev21.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>Amplifier le pré-miR-17-92 par PCR en utilisant 0,5 μM de chaque amorce spécifique (Tableau des matériaux), 150 ng d’ADNc, 1 mM de dNTP, 1x tampon Taq PCR et 5 U d’ADN polymérase Taq haute fidélité. Effectuer une réaction PCR de contrôle sans gabarit (utiliser de l’eau au lieu de l’ADNc) pour vérifier la contamination de l’ADN.</li>
		<li>Liférer le produit PCR en pRD-RIPE (aimablement fourni par le Dr E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapour)21 à l’intérieur de l’intron entre les sites de restriction EcoRI et EcoRV en utilisant l’ADN ligase, créant pRD-miR-17-92. Confirmez l’intégrité de la séquence par séquençage de Sanger.</li>
	</ol></li>
	<li>pmiRGLO-RAP-IB<ol><li>Concevez des amorces avant et arrière flanquées de sites de restriction XhoI/XbaI et d’un site de restriction NotI à l’intérieur. Mélanger des quantités équimolaires d’amorces avant et arrière et incuber le mélange à 90 °C pendant 5 min, puis transférer à 37 °C pendant 15 min. Comme témoins, utilisez des amorces avec des séquences cibles brouillées (Table des matériaux).</li>
		<li>Cliver les fragments recuits à l’aide d’enzymes de restriction XhoI/XbaI et les ligaturer en aval de la séquence luc2 dans pmiR-GLO, générant des constructions de rapporteur pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) et pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). Confirmer la ligature avec le décolleté NotI. NOTE: Assurez-vous que les porte-à-faux créés après le recuit de l’apprêt sont complémentaires du vecteur après réaction de clivage.</li>
	</ol></li>
	<li>pFLAG-HuR<ol><li>Pour générer un plasmide de surexpression HuR, amplifiez la séquence HuR avec des amorces spécifiques. Mélanger 300 ng d’ADNc, 0,5 μM de chaque amorce spécifique, 1 mM de mélange de dNTP, 1x tampon PCR et 5 U d’ADN polymérase Taq haute fidélité.</li>
		<li>Libeller le produit PCR en pGEM-T et confirmer l’intégrité de la séquence d’ADN par séquençage de Sanger. Retirez le fragment HuR de pGEM-T et sous-clonez-le dans le vecteur d’expression de mammifère pFLAG-CMV-3 pour générer le vecteur pFLAG-HuR.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Culture cellulaire
NOTE: La lignée cellulaire HeLa-Cre était un cadeau du Dr E. Makeyev21, et la cellule papillaire du cancer de la thyroïde (BCPAP) a été aimablement fournie par le Dr Massimo Santoro (Université « Federico II », Naples, Italie). La cellule HeLa, la cellule papillaire du cancer de la thyroïde (BCPAP) et HEK-293T ont été utilisées pour surexprimer HuR.
<ol><li>Maintenir les cellules dans du DMEM/hyperglycémie supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 mM de pyruvate de sodium, 200 mM de L-glutamine et 1x pénicilline-streptomycine (100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine) dans des boîtes de Petri de 100 mm, sauf indication contraire. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à atmosphère contrôlée (5% CO2).</li>
	<li>Incuber les cellules adhérentes avec de la trypsine/EDTA (mélange de solution à 0,5 %) à 37 °C pendant 3 à 5 min. Laissez-les se détacher de la plaque (la période d’incubation peut varier selon le type de cellule).</li>
	<li>Effectuer des transfections avec un réactif de transfection à base de lipides en suivant les instructions du fabricant. Assurez-vous que les cultures cellulaires sont confluentes à environ 70 %. Utilisez des quantités similaires d’ADN pour toutes les combinaisons de transfection, comme décrit ci-dessous, en ajoutant les ADN appropriés. Effectuer des expériences de transfection dans des répliques.<ol><li>Mélanger 200 ng d’ADN et 1,25 μL de réactif de transfection dans 100 μL du milieu de culture. Ajouter le mélange de transfection aux cellules. Incuber les cellules avec les mélanges de transfection pendant 4 h à 37 °C. Ensuite, remplacez le milieu par un milieu contenant 10% de FBS et incuber pendant 24 heures supplémentaires avant d’ajouter les antibiotiques pour la sélection.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Surexpression de HuR
<ol><li>Transfectez pFLAG-HuR et videz pFLAG dans HeLa. Sélectionner les cellules en augmentant la concentration de génétique (G418) (1 μg/mL) de 100 μg/mL à 1000 μg/mL, générant des lignées cellulaires stables.</li>
	<li>Confirmer la surexpression par PCR quantitative à l’aide d’amorces spécifiques pour l’ARNm HuR, comme décrit à l’étape 7.</li>
</ol>4. Isolement total de l’ARN
<ol><li>Utilisez des cellules fraîchement collectées. Trypsiniser 70% des cultures cellulaires confluentes (pour ce test, des cellules HeLa-Cre ont été utilisées), comme décrit à l’étape 2.2.</li>
	<li>Recueillir la pastille cellulaire par centrifugation pendant 5 min à 500 x g à 4 °C et la laver avec 1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate); Répétez la centrifugation.</li>
	<li>Remettez en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de 1x PBS et transférez-la dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger pendant 5 min à 500 x g à 4 °C.</li>
	<li>Pesez la pastille sèche et ajustez les volumes et la taille des tubes en conséquence. 1 mg de cellules donne environ 1 μg d’ARN total.</li>
	<li>Dans une hotte, ajoutez 500 à 1 000 μL de phénol/chloroforme à la pastille cellulaire (idéalement 750 μL par 0,25 g de cellules) et homogénéisez-la en pipetant de haut en bas et en mélangeant avec le vortex.</li>
	<li>Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante (20 °C à 25 °C) pour permettre la dissociation complète des complexes nucléoprotéiques.</li>
	<li>Centrifuger l’échantillon à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL et ajouter 200 μL de chloroforme par 1 mL de phénol:chloroforme utilisé. Boucher solidement les tubes d’échantillon.</li>
	<li>Mélanger vigoureusement pendant 15 s (à la main ou en tourbillonnant brièvement à une vitesse inférieure) et incuber à température ambiante (20 °C à 25 °C) pendant 2 min à 3 min.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.</li>
	<li>Vérifiez la présence d’une phase phénol-chloroforme rouge inférieure, d’une phase intermédiaire et d’une phase aqueuse supérieure incolore. L’ARN reste dans la phase aqueuse supérieure. Dans une hotte, recueillir la phase aqueuse, en évitant d’entrer en contact avec la phase intermédiaire, et transférer dans un tube frais.</li>
	<li>Précipiter l’ARN en mélangeant la phase aqueuse avec 400 μL d’isopropanol de qualité moléculaire (rapport 1:1 au phénol/chloroforme utilisé) et 2 μL de glycogène dans chaque tube (cela aidera à visualiser la présence de la pastille).</li>
	<li>Mélanger vigoureusement à la main ou homogénéiser avec l’embout pendant ~10 s. Incuber pendant 15 min ou toute la nuit à −20 °C.</li>
	<li>Centrifuger l’échantillon à 12 000 x g pendant 20 min à 4 °C et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Laver la pastille d’ARN en ajoutant 3 volumes d’éthanol à 100 % (environ 1 mL, dilué avec de l’eau DEPC) et mélanger l’échantillon en tourbillonnant jusqu’à ce que la pastille soit libérée et flotte du fond.</li>
	<li>Centrifuger à 7 500 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Lavez la pastille d’ARN 1x en ajoutant 1 mL d’éthanol à 75% et mélangez l’échantillon par vortex jusqu’à ce que la pastille soit libérée et flotte du fond. Répétez la centrifugation comme décrit à l’étape 4.17.</li>
	<li>Effectuer un essorage de centrifugation supplémentaire de 5 s pour recueillir le liquide résiduel du côté du tube et éliminer tout liquide résiduel avec une pipette sans perturber la pastille.</li>
	<li>Sécher brièvement à l’air la pastille d’ARN en ouvrant le bouchon du tube à température ambiante pendant 3 à 5 minutes et dissoudre la pastille d’ARN dans 20 à 50 μL d’eau traitée au DEPC sans RNase. Incuber l’ARN pendant 10 min à 55-60 °C pour faciliter la remise en suspension de la pastille.</li>
</ol>5. Détermination de la concentration et de la qualité de l’ARN total
<ol><li>Déterminer la concentration d’ARN en mesurant l’absorbance à 260 nm et 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Obtenir des données spectrales complètes avant d’utiliser les échantillons dans des applications en aval.</li>
	<li>Contrôler la qualité de l’ARN en résolvant 800-1000 ng sur un gel d’agarose à 1,5% à l’aide d’un tampon de TBI 0,5X (45 mM Tris base, 45 mM d’acide borique, 1 mM d’EDTA). L’ARN total se sépare en deux bandes se référant aux ARNr 28S et 18S.<ol><li>Fabriquez tous les réactifs et lavez tout l’équipement utilisé pour faire fonctionner le gel avec de l’eau traitée au DEPC. L’eau traitée au DEPC est préparée dans la hotte en ajoutant 1 mL de diéthylpyrocarbonate à 1000 mL d’eau ultra-pure. Incuber pendant ~2 h à température ambiante ou à 37 °C et autoclaver. Conserver à température ambiante jusqu’à 10 mois. NOTE: L’électrophorèse des ARN totaux des mammifères conduit à la séparation des ARNr 28S et 18S dans un rapport d’environ 2:1. Les bandes doivent être intactes et visibles comme deux bandes pointues. L’ARN dégradé entraînera des bandes floues.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Transcription inverse
<ol><li>Définir la réaction de transcription inverse en utilisant 1 μg d’ARN total.</li>
	<li>Effectuer la transcription inverse (RT) en utilisant l’enzyme de transcriptase inverse (voir le tableau des matériaux) et des amorces de décamer aléatoire de 50 ng/μL.<ol><li>Mélanger l’ARN, les amorces aléatoires et le mélange de dNTP de 1 mM (10 mM) dans 10 μL. Incuber à 65 °C pendant 5 min et sur glace pendant 1 min. Ajouter les réactifs suivants : 1x tampon RT, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U d’inhibiteur de RNase et 200 U de transcriptase inverse.</li>
		<li>Incuber pendant 10 min à 25 °C et pendant 1 h à 50 °C (les températures peuvent changer si différentes enzymes sont utilisées). Mettre fin à la réaction en incubant à 85 °C pendant 5 min. Les ADNc peuvent être stockés à −20 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>7. PCR quantitative
<ol><li>Pour assembler la réaction dans un volume final de 15 μL, mélanger 3 μL d’ADNc (100 ng/μL), 3,2 pmol de chaque amorce, 6 μL de mélange maître contenant les dNTP et l’enzyme, et 2,8 μL d’eau ultrapure. REMARQUE : Utiliser des amorces pour les gènes constitutifs endogènes comme témoins (gènes ménagers) pour normaliser les niveaux d’expression de l’ARNm HuR et des miARN. β-actine et snRNA U6 (RNU6B) sont des options disponibles pour la normalisation des ARNm et des miARN, respectivement, mais d’autres gènes pourraient également convenir selon le cas.</li>
	<li>Quantifier les niveaux d’expression à l’aide de la méthode delta-delta Ct (2-ΔΔCt)20.</li>
</ol>8. Le test rapporteur
<ol><li>Cellules utilisées pour le test<ol><li>Transfecter les plasmides dans les cellules HeLa-Cre comme suit. Transfect avec pTK-Renilla (40 ng), puis pRD-miR-17-92, générant HeLa-Cre-miR-17-92, et sélectionnant avec 1 μg/mL de puromycine.</li>
		<li>Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla avec pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR ou pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, séparément. Choisissez en utilisant la pénicilline (100 U/mL) et la streptomycine (100 μg/mL). Ces transfections génèrent Luc-RAP-1-B et Luc-scrambled.</li>
		<li>Transfectez les cellules avec pFLAG-HuR ou pFLAG vide (étape 3).</li>
		<li>Procéder à la culture cellulaire, comme détaillé à l’étape 2.2., avec HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-brouillé, HeLa-Cre miR-17-92-HuR et HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc jusqu’à environ 80% de confluence. Induire avec 1 μL de doxycycline (1 μg/mL) pendant 30 min à 37 °C. Aussi, gardez toutes les cellules sans doxycycline comme témoins, pour la même période. NOTE: La concentration finale de doxycycline dépend de la lignée cellulaire choisie. Un excès de doxycycline peut être toxique pour les cellules de mammifères.</li>
	</ol></li>
	<li>Dosage luminescent<ol><li>Pour quantifier et comparer différentes intensités de luminescence, utilisez le kit de test Dual-luciferase reporter. Décongeler les solutions de dosage de la luciférase et les laisser à température ambiante avant de commencer l’essai.</li>
		<li>Préparer le mélange Stop et Glo (tubes à chapeau bleu) en mélangeant 200 μL du substrat dans 10 mL de Luciferase Assay Buffer II. Préparer le mélange LAR II (tubes à capuchon vert) en mélangeant 10 ml de Luciferase Assay Buffer II dans le flacon ambré de Luciferase Assay Substrate II et bien agiter.</li>
		<li>Transférer les solutions dans des tubes centrifugés de 15 mL préalablement identifiés et protégés de la lumière. REMARQUE : Comme alternative, les solutions peuvent être préalablement préparées dans des aliquotes de 1 à 2 mL et congelées à -80 °C à l’abri de la lumière dans du papier d’aluminium.</li>
		<li>Effectuer les lectures de luminescence à l’aide d’un équipement tel que Synergy; mesure exprimée en luciférase en unités de lumière relative (RLU).</li>
		<li>Exportez les résultats vers une feuille de calcul pour une analyse statistique plus approfondie.</li>
		<li>Effectuer la normalisation de l’activité des luciférases par le contrôle Renilla (luciférase/Renilla) et tracer cela en tant qu’unités de lumière relative (RLU) dans un graphique. Répétez cette opération pour les groupes avec et sans induction de doxycycline.</li>
		<li>Calculer la moyenne et l’erreur-type de la moyenne (MEB). Effectuez le test t ou l’ANOVA bidirectionnelle d’un étudiant suivi du post-test de Tukey pour permettre une comparaison de groupe. Ces analyses sont disponibles dans un package tel que GraphPad Prism. Les différences à des valeurs p < 0,05 sont considérées comme significatives.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosha+promotes+splicing+of+a+pre-microRNA-like+alternative+exon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon.</a> PLoS Genetics. 10 (5), 1004312(2014).</li>
<li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+HuR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li>
<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li>
<li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li>
<li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

L’épissage pré-ARNm est un processus important pour la régulation de l’expression génique, et son contrôle peut déclencher de forts effets sur les modifications phénotypiques cellulaires22,23. Plus de 70% des miARN sont transcrits à partir d’introns chez l’homme, et nous avons émis l’hypothèse que leur traitement et leur maturation pourraient être facilités par l’épissage des protéines régulatrices24,25. ...

L’épissage précurseur de l’ARNm est un processus important pour la régulation de l’expression génique chez les eucaryotes1. L’élimination des introns et l’union des exons dans l’ARN mature sont catalysées par le spliceosome, un complexe ribonucléoprotéique de 2 mégadaltons composé de 5 ARNn (U1, U2, U4, U5 et U6) ainsi que de plus de 100 protéines 2,3. La réaction d’épissage se produit co-transcriptionnellement, et le splicéosome est assemblé à chaque nouvel intron guidé par la reconnaissance des sites d’épissage conservés aux limites exon-intron et à l’intérieur de l’intron4. Différents introns peuvent avoir des taux d’épissage différents malgré la conservation remarquable du complexe spliceosome et de ses composants. En plus des différences dans la conservation du site d’épissage, les séquences régulatrices réparties sur les introns et les exons peuvent guider les protéines de liaison à l’ARN (RBP) et stimuler ou réprimer l’épissage 5,6. HuR est un RBP omniprésent et est un facteur important pour contrôler la stabilité de l’ARNm7. Les résultats antérieurs de notre groupe ont montré que HuR peut se lier aux introns contenant des miARN, ce qui indique que cette protéine pourrait être un facteur important pour faciliter le traitement et la maturation des miARN, conduisant également à la génération d’isoformes d’épissage alternatives 6,8,9.
De nombreux microARN (miARN) sont codés à partir de séquences introniques. Alors que certains font partie de l’intron, d’autres sont connus sous le nom de « mirtrons » et sont formés par l’intron entier10,11. Les miARN sont de courts ARN non codants, allant de 18 à 24 nucléotides de longueur12. Leur séquence mature montre une complémentarité partielle ou totale avec les séquences cibles dans les ARNm, affectant ainsi les taux de translation et/ou de désintégration de l’ARNm. Les combinaisons de miARN et de cibles conduisent la cellule à des résultats différents. Plusieurs miARN peuvent conduire les cellules à des phénotypes pro- ou anti-tumoraux13. Les miARN oncogènes ciblent généralement les ARNm qui déclenchent une caractéristique suppressive, entraînant une augmentation de la prolifération, de la migration et de l’invasioncellulaires 14. D’autre part, les miARN suppresseurs de tumeurs pourraient cibler les ARNm oncogènes ou les ARNm liés à une prolifération cellulaire accrue.
Le traitement et la maturation des miARN dépendent également de leur origine. La plupart des miARN introniques sont traités avec la participation du microprocesseur, formé par la ribonucléase Drosha et les cofacteurs protéiques12. Les mirtrons sont traités avec l’activité du spliceosome indépendamment de Drosha15. Compte tenu de la fréquence élevée des miARN trouvés dans les introns, nous avons émis l’hypothèse que les protéines de liaison à l’ARN impliquées dans l’épissage pourraient également faciliter le traitement et la maturation de ces miARN. Notamment, le RBP hnRNP A2/B1 a déjà été associé au microprocesseur et à la biogenèsemiARN 16. 
Nous avons déjà signalé que plusieurs protéines de liaison à l’ARN, telles que hnRNP et HuR, sont associées aux miARN introniques par spectrométriede masse 17. L’association de HuR (ELAVL1) avec les miARN de l’amas intronique miR-17-92 a été confirmée par immunoprécipitation et analyse in silico 9. miR-17-92 est un amas de miARN introniques composé de six miARN avec une expression accrue dans différents cancers18,19. Ce groupe est également connu sous le nom de « oncomiR-1 » et est composé de miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b et miR-92 a. miR-19 a et miR-19b sont parmi les miARN les plus oncogènes de ce groupe 19. L’expression accrue de HuR stimule la synthèse miR-19a et miR-19b 9. Étant donné que les régions introniques flanquant ce groupe sont associées à HuR, nous avons développé une méthode pour déterminer si cette protéine pouvait réguler l’expression et la maturation de miR-19a et miR-19b. Une prédiction importante de notre hypothèse était que, en tant que protéine régulatrice, HuR pourrait faciliter la biogenèse des miARN, conduisant à des altérations phénotypiques. Une possibilité était que les miARN étaient traités par la stimulation de HuR mais ne seraient pas matures et fonctionnels et, par conséquent, les effets de la protéine n’auraient pas d’impact direct sur le phénotype. Par conséquent, nous avons développé un test de rapporteur d’épissage pour déterminer si une RBP telle que HuR pouvait affecter la biogenèse et la maturation d’un miARN intronique. En confirmant le traitement et la maturation des miARN, notre test montre l’interaction avec la séquence cible et la génération d’un miARN mature et fonctionnel. Dans notre essai, nous couplons l’expression d’un groupe de miARN intronique avec un plasmide luciférase pour vérifier la liaison à la cible du miARN dans les cellules en culture.

<table><tbody><tr><td>< ADN recombinant >fort</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-Cre (plasmide codant pour le Cre)</td><td></td><td></td><td>Un don aimable de E. Makeyev de Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pFLAG-HuR</td><td></td><td></td><td>Généré au cours de ce travail</td></tr><tr><td>pmiRGLO-RAP-IB</td><td></td><td></td><td>Généré au cours de ce travail</td></tr><tr><td>pmiRGLO-scrambled</td><td></td><td></td><td>Généré pendant ce travail</td></tr><tr><td>pRD-miR-17-92</td><td></td><td></td><td>Généré au cours de ce travail</td></tr><tr><td>pRD-RIPE-donateur</td><td></td><td></td><td>Un don aimable de E. Makeyev de Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-B-actin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>anti-HuR</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>mAb&nbsp ; 12582</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680CW IgG anti-souris pour chèvre</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Anti-lapin pour chèvre IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>929-70020<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Modèles expérimentaux : Lignées cellulaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Cre</td><td></td><td></td><td>Un don aimable de E. Makeyev de Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92</td><td></td><td></td><td>Généré au cours de ce travail</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td><td></td><td></td><td>Généré au cours de ce travail</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td><td></td><td></td><td>Généré au cours de ce travail</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td><td></td><td></td><td>Généré au cours de ce travail</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td><td></td><td></td><td>Généré au cours de ce travail</td></tr><tr><td>Chemicals et peptides </forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/à haute teneur en glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>BioBasic</td><td>MB719150</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0271</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0301</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E859-EG</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pFLAG-CMV&trade ;-3 Vecteur d’expression</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6783</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polymérase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10966-030</td><td></td></tr><tr><td>pmiR-GLO</td><td>Promega</td><td>E1330</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>752899</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091050</td><td></td></tr><tr><td>Trizol-LS réactif</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>trypsine/EDTA 10X</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Promega</td><td>R616A</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forward RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT</td><td></td></tr><tr><td>reverse RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>forward scrambled pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td><td></td></tr><tr><td>reverse scrambled pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>forward HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC</td><td></td></tr><tr><td>reverse HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG</td><td></td></tr><tr><td>forward pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG</td><td></td></tr><tr><td>reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG</td><td></td></tr><tr><td>forward snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td><td></td></tr><tr><td>reverse snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG</td><td></td></tr><tr><td>forward B-Actin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td><td></td></tr><tr><td>reverse B-Actin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td><td></td></tr><tr><td>forward HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td><td></td></tr><tr><td>reverse HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td><td></td></tr><tr><td>forward pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG</td><td></td></tr><tr><td>reverse pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8 pour Mac OS</td><td>X Graphpad</td><td></td><td></td>https://www.graphpad.com</tr><tr><td>ImageJ</td><td>Instituts nationaux de la santé</td><td>http://imagej.nih.gov/ij</td><td></td></tr></tbody></table>

un test rapporteur pour analyser la maturation des microarn introniques dans des cellules de mammifères

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

Les microARN (miARN) sont des molécules d’ARN courtes qui sont répandues chez les eucaryotes. La plupart des miARN sont transcrits à partir d’introns, et leur maturation implique différentes protéines de liaison à l’ARN dans le noyau. Les miARN matures interviennent fréquemment dans le silençage génique, ce qui est devenu un outil important pour comprendre les événements post-transcriptionnels. En outre, il peut être exploré comme une méthodologie prometteuse pour les thérapies géniques. Cependant, il existe actuellement un manque de méthodes directes pour évaluer l’expression des miARN dans les cultures de cellules de mammifères. Ici, nous décrivons une méthode efficace et simple qui aide à déterminer la biogenèse et la maturation des miARN en confirmant son interaction avec les séquences cibles. En outre, ce système permet de séparer la maturation exogène du miARN de son activité endogène à l’aide d’un promoteur inductible par la doxycycline capable de contrôler la transcription primaire des miARN (pri-miARN) avec une efficacité élevée et un faible coût. Cet outil permet également la modulation avec des protéines de liaison à l’ARN dans un plasmide séparé. En plus de son utilisation avec une variété de miARN différents et leurs cibles respectives, il peut être adapté à différentes lignées cellulaires, à condition que celles-ci se prêtent à la transfection.

Notre hypothèse initiale était que HuR pourrait faciliter la biogenèse intronique des miARN en se liant à sa séquence pré-miARN. Ainsi, la connexion de l’expression de HuR et de la biogenèse des amas miR-17-92 pourrait indiquer un nouveau mécanisme régissant la maturation de ces miARN. La surexpression de HuR lors de la transfection de pFLAG-HuR a été confirmée dans trois lignées cellulaires différentes : HeLa, BCPAP et HEK-293T (Figure 2). Comme témoins, des cellules non transfecté...

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Notre protocole porte sur les effets des protéines de liaison à l’ARN régulateur sur la biogenèse et la maturation des microARN, directement à partir de cultures cellulaires. La méthode que nous décrivons peut être réalisée avec des réactifs de culture cellulaire courants et est relativement rapide. Cette méthode peut être importante pour étudier les effets phénotypiques des microARN et de leurs cibles dans différents types de cellules eucaryotes.Des cellules normales ou semblables à des maladies peuvent être utilisées. Il est important de choisir des lignées cellulaires susceptibles de transfection, d’effectuer des contrôles adéquats de transfection et d’induction afin d’observer les changements d’affinité de la cible par l’activité de la luciférase. Pour commencer, maintenez les cellules dans DMEM, supplément de glucose élevé dans des boîtes de Petri de 100 millimètres et incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à atmosphère contrôlée humidifié avec 5% de dioxyde de carbone.Pour détacher les cellules adhérentes, incuber avec une solution de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Pour effectuer des transfections, mélangez 200 nanogrammes

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Nous décrivons ici un test qui utilise la puissance du micro-injection couplé à...

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L&#39;identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3&#39;UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

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