Name: Déchiffrer le mécanisme moléculaire de l’assemblage des histones par la technique du rideau d’ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Découvrez la technique du rideau d'ADN pour visualiser les interactions protéine-ADN en temps réel et étudier la dynamique de la chromatine. Cette méthode d'imagerie à molécule unique permet d'analyser le mécanisme moléculaire des chaperons d'histones.

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Les auteurs apprécient l’aimable soutien apporté à Abo1 et Cy5-H3-H4 par le professeur Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., et Juwon Jang, Ph.D., à KAIST, en Corée du Sud. Ce travail est soutenu par la subvention de la Fondation nationale de recherche (NRF-2020R1A2B5B01001792), le fonds de recherche intra-muros (1.210115.01) de l’Institut national des sciences et technologies d’Ulsan et l’Institut des sciences fondamentales (IBS-R022-D1).

1. Préparation de la cellule d’écoulement
<ol><li>Préparer une lame de silice fondue nettoyée contenant des motifs de nano-tranchées à la suite du rapport25 publié précédemment.<ol><li>Percez deux trous de 1 mm de diamètre dans une lame de silice fondue nettoyée (figure 1A) à l’aide d’un foret diamanté (voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Déposer 250 nm d’aluminium épais (Al) sur la lame à l’aide d’une pulvérisation cathodique CC32 (voir tableau des matériaux) avec 10 mTorr de gaz argon.</li>
		<li>Appliquer une couche de 310 nm d’épaisseur de poly(méthacrylate de méthyle) (méthacrylate de méthyle) (PMMA) 950K à 4 % (voir tableau des matériaux) à 4 000 tr/min pendant 1 min et cuire sur une plaque chauffante à 180 °C pendant 3 min.</li>
		<li>Dessinez les motifs de nano-tranchées sur la couche de PMMA entre les deux trous à l’aide de la lithographie par faisceau d’électrons (ebeam)33 avec un courant de 0,724 nA à 80 kV. NOTE : L’architecture et les dimensions des motifs de nano-tranchées sont illustrées à la figure 1A.</li>
		<li>Retirez le PMMA exposé par faisceau d’ébrèches en trempant les lames dans la solution de développement (rapport 1 :3 de méthylisobutylcétone et d’isopropanol, voir le tableau des matériaux) pendant 2 min.</li>
		<li>Graver des couches d’Al avec une gravure ionique réactive au plasma à couplage inductif (ICP-RIE) à l’aide de gaz chlore (Cl2) et trichlorure de bore (BCl3). REMARQUE : Ces deux gaz peuvent éliminer l’Al des zones exposées aux faisceaux électriques.</li>
		<li>Creuser des nano-tranchées sur les lames à l’aide de gaz de tétrafluorure de soufre (SF4), de tétrafluorométhane (CF4) et d’oxygène (O2) (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Retirez la couche d’Al restante en trempant les lames dans de l’Al etchant (révélateur AZ 300 MIF, voir Tableau des matériaux) pendant 10 min.</li>
		<li>Après la fabrication, rincez les lames avec de l’eau déminéralisée et sonicez dans de l’acétone pendant 30 min à l’aide d’un sonicateur de type bain.</li>
		<li>Nettoyez les lames dans une solution Hellmanex III à 2 % (voir tableau des matériaux) pendant au moins 1 jour avec un brassage magnétique.</li>
		<li>Ponctionner successivement les lames dans de l’acétone et 1 M de NaOH pendant 30 min.</li>
		<li>Rincez les lames avec de l’eau déminéralisée et séchez-les avec un gaz azoté (N2).</li>
	</ol></li>
	<li>Placez un papier propre (5 mm x 35 mm) au centre du ruban adhésif double face. Fixez le ruban adhésif sur la lame pour couvrir les deux trous et les nano-motifs avec le papier.</li>
	<li>Retirez le papier à l’aide d’une lame propre (Figure 1A).</li>
	<li>Placez une lamelle de verre sur le ruban adhésif double face et frottez la lamelle à l’aide d’une pointe de pipette pour former une chambre microfluidique (Figure 1A).</li>
	<li>Placez la cellule d’écoulement assemblée entre deux lames de microscope et clipsez-les.</li>
	<li>Faites cuire la cellule d’écoulement dans un four sous vide à 120 °C pendant 45 min.</li>
	<li>Fixez le connecteur de fluide (Nanoport) pour les analyses à base de puce (voir tableau des matériaux) à chaque trou ouvert à l’aide d’un pistolet à colle chaude et connectez les deux lignes de tubes Luer Lock.</li>
	<li>Branchez une seringue Luer lock contenant 3 mL d’eau déminéralisée et lavez la chambre.</li>
	<li>Lavez la chambre avec 3 mL de tampon lipidique (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 et 100 mM de NaCl) via le raccord goutte à goutte. REMARQUE : La connexion goutte à goutte relie toutes les seringues à la cellule d’écoulement pour éviter d’injecter des bulles d’air dans la chambre.</li>
	<li>Injecter 1 mL de lipides biotinylés 0,04x dans un tampon lipidique dans la chambre en deux injections avec une incubation de 5 minutes par injection. NOTE : La préparation d’une souche lipidique biotinylée 1x est décrite dans un rapport publié précédemment34.</li>
	<li>Lavez la chambre avec 3 mL de tampon lipidique et incubez pendant 20 min pour que la bicouche lipidique mûrisse sur la surface de la lame.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon BSA (40 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2 et 0,2 mg/mL de BSA) et incuber pendant 5 min pour passiver la surface de la lame. REMARQUE : Cette étape peut réduire la liaison non spécifique des protéines à la surface de la lame.</li>
	<li>Injecter 0,025 mg/mL de streptavidine dans 1 mL de tampon BSA avec deux injections et 10 minutes d’incubation par injection.</li>
	<li>Éliminer la streptavidine résiduelle avec 3 mL de tampon BSA.</li>
	<li>Injecter ~300 pM (30 μL) d’ADN de phage lambda biotinylé dans 1 mL de tampon BSA dans la chambre avec deux injections et 10 minutes d’incubation par injection. NOTE : La préparation de l’ADN lambda biotinylé est décrite dans un rapport publié précédemment34.</li>
</ol>2. Connexion de la cellule d’écoulement au système microfluidique et chargement de celle-ci sur le microscope
<ol><li>Préparer le tampon d’imagerie Abo1 (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1 mM d’ATP, 2 mM de MgCl2, 1,6 % de glucose et 0,1x de gloxy, voir le tableau des matériaux). REMARQUE : Gloxy est un système de piégeage de l’oxygène qui réduit le photoblanchiment des colorants fluorescents. La préparation d’une souche 100x gloxy avec de la glucose oxydase et de la catalase est décrite dans la référence35.</li>
	<li>Connectez une seringue contenant 10 mL de tampon d’imagerie à un pousse-seringue et éliminez les bulles dans toutes les conduites de tubulure du système microfluidique.</li>
	<li>Couplez la cellule d’écoulement préparée avec le système microfluidique via une connexion goutte à goutte pour éviter l’injection de bulles dans la cellule d’écoulement (Figure 1B).</li>
	<li>Assemblez la cellule d’écoulement et les supports de cellule d’écoulement et montez l’ensemble sur un microscope TIRF construit sur mesure (Figure 1C). ATTENTION : Lorsque la cellule d’écoulement est placée sous le microscope, réglez soigneusement la hauteur de la lentille de l’objectif. La cellule d’écoulement ne doit pas toucher la lentille de l’objectif. Cela peut endommager l’objectif.</li>
	<li>Déposez l’huile correspondante à l’indice au centre de la cellule d’écoulement et placez un prisme en forme de colombe sur mesure (voir le tableau des matériaux) sur la goutte d’huile.</li>
</ol>3. Assemblage d’histones par Abo1 à l’aide d’un rideau d’ADN
<ol><li>Mélanger 5 nM d’Abo1 et 12,5 nM de dimère d’histone H3-H4 marqué au Cy5 (Cy5-H3-H4) (voir le tableau des matériaux) dans 150 μL de tampon d’imagerie. Toutes les protéines ont été préparées conformément au rapport17 publié précédemment.</li>
	<li>Incuber le mélange sur de la glace pendant 15 min. REMARQUE : Pour éviter le photoblanchiment de Cy5, l’incubation doit se faire dans l’obscurité.</li>
	<li>Injecter ~20 pM (2 μL) de colorant YOYO-1 dans un tampon d’imagerie à travers une boucle d’échantillon de 100 μL pour colorer les molécules d’ADN lambda.</li>
	<li>Exécutez un logiciel d’imagerie (voir le tableau des matériaux) et allumez le laser 488 nm pour vérifier si les rideaux d’ADN sont bien formés. REMARQUE : Si les rideaux d’ADN sont bien formés, les molécules d’ADN, qui sont colorées avec YOYO-1, sont représentées sous forme de lignes alignées sur une barrière en présence d’écoulement. Les lignes tendues reculent et diffusent loin de la barrière lorsque le flux est coupé.</li>
	<li>Injecter 2 mL de tampon à haute teneur en sel (200 mM de NaCl et 40 mM de MgCl2) pour éliminer le colorant YOYO-1 de l’ADN.</li>
	<li>Une fois que le colorant YOYO-1 a été retiré, injectez l’échantillon de protéine pré-incubé.</li>
	<li>Lorsque les protéines atteignent le rideau d’ADN, éteignez le pousse-seringue, fermez la vanne d’arrêt et incubez 15 minutes pour la charge d’histones par Abo1.</li>
	<li>Lavez les protéines Abo1 et histones non liées pendant 5 min.</li>
	<li>Allumez la vanne d’arrêt et reprenez l’injection de débit.</li>
	<li>Allumez le laser 637 nm et imagez les protéines fluorescentes pendant que le flux tampon est activé.</li>
	<li>Arrêtez temporairement le flux tampon pour vérifier si les protéines histones sont chargées sur l’ADN (Figure 2C).</li>
	<li>Recueillir des images de rideaux d’ADN à l’aide d’un programme d’acquisition d’images (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : Lorsque le flux tampon s’arrête transitoirement, l’ADN recule hors du champ évanescent de la réflexion interne totale, et les protéines marquées par fluorescence liées à l’ADN disparaissent.</li>
</ol>4. Analyse des données
<ol><li>Transformez les images prises par le programme d’acquisition d’images au format TIFF sous forme de séquences d’images. NOTA : Toutes les données ont été analysées à l’aide de l’image J (NIH) telle qu’elle est décrite dans la référence20.</li>
	<li>Choisissez une seule molécule d’ADN parmi les séquences d’images et dessinez un kymographe. REMARQUE : Le kymographe peut montrer le changement d’intensité de fluorescence de chaque protéine histones liée à une seule molécule d’ADN en fonction du temps.</li>
	<li>Créez le profil d’intensité de fluorescence à partir du kymographe et adaptez-le à plusieurs fonctions gaussiennes.</li>
	<li>Collectez les coordonnées centrales des pics à partir du profil d’intensité de fluorescence. Dans cette étape, l’intensité minimale de la fluorescence des histones peut être obtenue.</li>
	<li>Divisez toutes les intensités maximales recueillies à partir des profils par l’intensité minimale. Le nombre de dimères H3-H4 liés à l’ADN est estimé dans cette étape.</li>
	<li>Effectuez les étapes 4.2 à 4.5 pour les autres molécules d’ADN.</li>
	<li>Créez un histogramme pour la distribution de liaison des dimères H3-H4 avec une taille de groupe de 1 kbp. Le nombre de molécules analysées est d’au moins 300.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En tant que technique d’imagerie à molécule unique, le rideau d’ADN a été largement utilisé pour sonder les réactions métaboliques de l’ADN43. Le rideau d’ADN est un système hybride qui concatène la fluidité lipidique, la microfluidique et le TIRFM. Contrairement à d’autres techniques à molécule unique, le rideau d’ADN permet une visualisation en temps réel à haut débit des interactions protéine-ADN. Par conséquent, la technique du rideau d’ADN est adaptée pour sonder le mécanisme à l’origine des ...

L’ADN eucaryote est emballé dans une structure d’ordre supérieur connue sous le nom de chromatine 1,2. Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine, qui se compose d’environ 147 pb d’ADN enroulé autour des histones octamères 3,4. La chromatine joue un rôle essentiel dans les cellules eucaryotes ; par exemple, la structure compacte protège l’ADN des facteurs endogènes et des menaces exogènes5. La structure de la chromatine change dynamiquement en fonction de la phase du cycle cellulaire et des stimuli environnementaux, et ces changements contrôlent l’accès aux protéines lors des transactions de l’ADN telles que la réplication, la transcription et la réparation6. La dynamique de la chromatine est également importante pour la stabilité génomique et l’information épigénétique.
La chromatine est régulée dynamiquement par divers facteurs, y compris les modifications de la queue des histones et les organisateurs de la chromatine tels que les remodeleurs de chromatine, les protéines du groupe polycomb et les chaperons d’histones7. Les chaperons histones coordonnent l’assemblage et le désassemblage des nucléosomes par dépôt ou détachement des histones centrales 8,9. Les défauts dans les chaperons d’histones induisent une instabilité du génome et provoquent des troubles du développement et des cancers 9,10. Divers chaperons d’histones n’ont pas besoin de consommation d’énergie chimique comme l’hydrolyse de l’ATP pour assembler ou désassembler les nucléosomes 9,11,12,13. Récemment, des chercheurs ont rapporté que les ATPases AAA+ (ATPase associées à diverses activités cellulaires) contenant des bromodomaines jouent un rôle dans la dynamique de la chromatine en tant que chaperons d’histones 14,15,16,17. L’ATAD2 humain (protéine 2 contenant le domaine AAA de la famille des ATPase) favorise l’accessibilité de la chromatine pour améliorer l’expression des gènes18. En tant que co-régulateur transcriptionnel, l’ATAD2 régule la chromatine des facteurs transcriptionnels oncogènes14, et la surexpression d’ATAD2 est liée à un mauvais pronostic dans de nombreux types de cancer19. Yta7, l’homologue de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) d’ATAD2, diminue la densité des nucléosomes dans la chromatine15. En revanche, Abo1, l’homologue Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) d’ATAD2, augmente la densité des nucléosomes16. À l’aide d’une technique unique d’imagerie à molécule unique, le rideau d’ADN, la question de savoir si Abo1 contribue à l’assemblage ou au désassemblage des nucléosomes est abordée17,20.
Traditionnellement, les propriétés biochimiques des biomolécules ont été examinées par des expériences en masse telles que le test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) ou la co-immunoprécipitation (co-IP), dans lesquelles un grand nombre de molécules sont sondées, et leurs propriétés moyennes sont caractérisées21,22. Dans les expériences en vrac, les sous-états moléculaires sont voilés par l’effet d’ensemble-moyenne, et l’exploration des interactions biomoléculaires est limitée. En revanche, les techniques à molécule unique contournent les limites des expériences en vrac et permettent la caractérisation détaillée des interactions biomoléculaires. En particulier, les techniques d’imagerie à molécule unique ont été largement utilisées pour étudier les interactions ADN-protéine et protéine-protéine23. L’une de ces techniques est le rideau d’ADN, une technique unique d’imagerie à molécule unique basée sur la microfluidique et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM)24,25. Dans un rideau d’ADN, des centaines de molécules d’ADN individuelles sont ancrées à la bicouche lipidique, ce qui permet le mouvement bidimensionnel des molécules d’ADN en raison de la fluidité lipidique. Lorsque l’écoulement hydrodynamique est appliqué, les molécules d’ADN se déplacent le long de l’écoulement sur la bicouche et restent coincées à une barrière de diffusion, où elles sont alignées et étirées. Alors que l’ADN est coloré avec des agents intercalants, des protéines marquées par fluorescence sont injectées, et TIRFM est utilisé pour visualiser les interactions protéine-ADN en temps réel au niveau d’une seule molécule23. La plate-forme de rideau d’ADN facilite l’observation des mouvements des protéines tels que la diffusion, la translocation et la collision 26,27,28. De plus, le rideau d’ADN peut être utilisé pour la cartographie des protéines sur l’ADN avec des positions, des orientations et des topologies définies ou appliqué à l’étude de la séparation de phase des protéines et des acides nucléiques 29,30,31.
Dans ce travail, la technique du rideau d’ADN est utilisée pour fournir des preuves de la fonction des chaperons grâce à la visualisation directe de protéines spécifiques. De plus, comme DNA curtain est une plate-forme à haut débit, elle facilite une collecte de données suffisante pour assurer la fiabilité statistique. Ici, il est décrit comment effectuer le test de rideau d’ADN en détail pour étudier le rôle moléculaire de l’AAA+ ATPase Abo1 contenant du bromodomaine de S. pombe .

<table><tbody><tr><td>Seringue Luer-Lock de 1 mL</td><td>BecktonDickinson</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>verre à lame fused-silca de 1 pi x 3 pi</td><td>G. Finkenbeiner</td><td></td><td>Seringue Luer-lock rectangulaire de 1 po x 3 po et de 1 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>Seringue Luer-lock de 10 mL</td><td>BecktonDickinson</td><td>302149</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&Delta ; 9-Cis) PC (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Il s’agit d’un composant du stock lipidique biotinylé</td></tr><tr><td>18:1 Capuchon biotinyle PE</td><td>Avanti</td><td>870273</td><td>Il s’agit d’un composant du stock lipidique biotinylé</td></tr><tr><td>18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>Il s’agit d’un composant du stock lipidique biotinylé Seringue</td></tr><tr><td>luer-lock de 3 mL</td><td>BecktonDickinson</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>Valve d’injection d’échantillon à 6 voies</td><td>IDEX</td><td>MX série II</td><td></td></tr><tr><td>950K PMMA</td><td>All-resist</td><td>671.04</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>SAMCHUN</td><td>A1759</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5'-triphosphate disodium sel hydraté (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium (Al)</td><td>TASCO, Corée du Sud</td><td>LT50AI414</td><td>Diamètre 4 pouce, épaisseur 1/4 pouce</td></tr><tr><td>Filtre centrifuge Amicon Ultra, MWCO 10 kDa</td><td>Millipore</td><td>Z648027</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Mbcell</td><td>MB-A4128</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>AZ 300 Révélateur MIF</td><td>Merck</td><td>10454110521</td><td>Utilisé pour enlever l’aluminium</td></tr><tr><td>Lame</td><td>DORCO</td><td>DN52</td><td>12 mm x 6 m</td></tr><tr><td>Trichlorure de bore (BCl3)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Pureté : >99,99 %</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40-1g</td><td>Il s’agit d’un composant de 100x gloxy</td></tr><tr><td>stock Chlore (Cl2)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Pureté : >99.99 %</td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face transparent</td><td>3M 3M</td><td>313770</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DC pulvérisation</td><td>Sorona</td><td>SRM-120</td><td>Utilisé pour le dépôt d’aluminium sur une glissière</td></tr><tr><td>Mèche diamantée</td><td>Eurotool</td><td>DIB-211.00</td><td>Utilisé pour percer des trous dans une lame de silice fuscée</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Dove-prism</td><td>Korea Electro-Optics Co., Ltd.</td><td>1906-106</td><td>Prisme de colombe en silice fondue sur mesure avec revêtement antireflet</td></tr><tr><td>Foret</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000</td><td>Utilisé pour faire des trous dans une lame de silice fuscée</td></tr><tr><td>Lithographie par haricots électroniques</td><td>Nanobeam Ltd.</td><td>NB3</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Raccords étanches aux doigts</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td>Il est connecté avec « PFA Tubing Natural » pour former un tube luer-lock</td></tr><tr><td>Écrou mâle sans bride</td><td>IDEX</td><td>P-235</td><td>Il est connecté avec « PFA Tubing Natural » pour former un tube luer-lock</td></tr><tr><td>Lyophilisateur, HyperCOOL</td><td>Labogene</td><td>HC3110</td><td>Utilisé pour lyophiliser les protéines liquides</td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>Sigma</td><td>G2133-50KU</td><td>Il s’agit d’un composant de 100x gloxy stock</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de guanidinium</td><td>Acros Organics</td><td>364790025</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Seringue Hamilton</td><td>Company</td><td>80065</td><td>Cette seringue est utilisée pour l’injection d’échantillons</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-36</td><td>Utilisé pour FPLC (exclusion de taille)</td></tr><tr><td>Agitateur à plaque chauffante</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma</td><td>H1759</td> Utilisé pour l’huile d’adaptation à l’indice <td>Tris-HCl</td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Gravure ionique réactive au plasma à couplage inductif</td><td>Top Technology Ltd.</td><td>FabStar</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Glentham Life Sciences</td><td>GC6586-100g</td><td>Utilisé pour l’induction de l’activité de la &beta ;-galactosidase</td></tr><tr><td>Lambda phage DNA</td><td>NEB</td><td>N0311</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>BD difco</td><td>244610</td><td>Milieu pour la croissance cellulaire E.coli</td></tr><tr><td>Adaptateur Luer 10-32</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td>Ce connecteur luer-lock seringue et tube</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Fisher bioréactifs</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>Méthylisobutylcétone (MIBK)</td><td>KAYAKU ADVANCED MATERIALS Utilisé</td><td></td><td>pour le développement de solutions</td></tr><tr><td>Microscope (Eclipse Ti2)</td><td>Microscope à fluorescence inversée</td> <td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td></tr><tr><td>Lamelle en verre de microscope</td><td>MARIENFELD</td><td>101142</td><td>22 x 50 mm (n° 1)</td></tr><tr><td>Lame</td><td>de microscope DURAN GROUP</td><td>DU.2355013</td><td>Lame en verre rectifié 45&deg ;, lisse 26 x 76 mm</td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>IDEX</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat VC 60XC WI</td><td>Type d’immersion : eau, grossissement : 60x, correction : 18, distance de travail : 0.29 (0.31-0.28)</td></tr><tr><td>One Shot BL21 (DE3)pLysS Chimiquement compétent E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C6060-03</td><td>Cellule compétente pour la surexpression des protéines</td></tr><tr><td>Oxygène (O2)</td><td>NOBLEGAS, Corée</td><td></td> du Sud <td>Pureté : >99,99 %</td></tr><tr><td>Tube PFA naturel</td><td>IDEX</td><td>1512L</td><td>Il est connecté avec des « raccords étanches au doigt » pour former un tube luer-lock</td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td><td>Roche</td><td>11359061001</td><td>Inhibiteur</td></tr> <tr><td>de protéaseSephacryl S-200 Haute Résolution</td><td>Cytiva</td><td>17-0584-01</td><td>Utilisé pour FPLC (exclusion stérique)</td></tr><tr><td>Vanne d’arrêt</td><td>IDEX</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Sigma</td><td>791741</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>s5881</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por Tube à membrane moléculaire poreuse, MWCO 6-8 kDa</td><td>Spectrum laboratories</td><td>132660</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>Tétralfluorure de soufre (SF4)</td><td>NOBLEGAS, Corée</td><td></td> du Sud <td>Pureté : >99.99 %</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>KD Scientific</td><td>78-8210</td><td></td></tr><tr><td>Tétrafluorométhane (CF4)</td><td>NOBLEGAS, Corée</td><td></td> du Sud<td>Pureté : >99,99 %</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Utilisé pour Tris-HCl</td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>TOSOH</td><td>14715</td><td>Utilisé pour FPLC (échange d’ions)</td></tr><tr><td>Assemblage union</td><td>IDEX</td><td>P-760</td><td>Ce raccord entre les tubes</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Four à vide</td><td>Jeio Tech</td><td>OV-11</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Y3601</td><td>Ce colorant d’intercalation est dilué dans du DMSO</td></tr><tr><td>&bêta ;-mercaptoéthanol (BME)</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr></tbody></table>

déchiffrer le mécanisme moléculaire de l’assemblage des histones par la technique du rideau d’adn

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

La chromatine est une structure d’ordre supérieur qui emballe l’ADN eucaryote. La chromatine subit des altérations dynamiques en fonction de la phase du cycle cellulaire et en réponse à des stimuli environnementaux. Ces changements sont essentiels à l’intégrité génomique, à la régulation épigénétique et aux réactions métaboliques de l’ADN telles que la réplication, la transcription et la réparation. L’assemblage de la chromatine est crucial pour la dynamique de la chromatine et est catalysé par les chaperons des histones. Malgré des études approfondies, les mécanismes par lesquels les chaperons histones permettent l’assemblage de la chromatine restent insaisissables. De plus, les caractéristiques globales des nucléosomes organisés par des chaperons d’histones sont mal comprises. Pour résoudre ces problèmes, ce travail décrit une technique unique d’imagerie à molécule unique appelée rideau d’ADN, qui facilite l’étude des détails moléculaires de l’assemblage des nucléosomes par les chaperons d’histones. Le rideau d’ADN est une technique hybride qui combine la fluidité des lipides, la microfluidique et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM) pour fournir une plate-forme universelle pour l’imagerie en temps réel de diverses interactions protéine-ADN. À l’aide d’un rideau d’ADN, la fonction chaperon des histones d’Abo1, l’ATPase AAA+ contenant des bromodomaines contenant des pombes de Schizosaccharomyces , est étudiée, et le mécanisme moléculaire sous-jacent à l’assemblage des histones d’Abo1 est révélé. Le rideau d’ADN offre une approche unique pour l’étude de la dynamique de la chromatine.

Ce travail décrit la procédure de préparation des cellules en flux pour le test de rideau d’ADN (Figure 1A). Le test de rideau d’ADN a facilité l’étude de l’assemblage des dimères d’histones H3-H4 sur l’ADN par Abo1. Tout d’abord, la formation d’un rideau d’ADN a été vérifiée en colorant les molécules d’ADN avec YOYO-1, un colorant intercalant. Des lignes vertes ont été montrées dans des réseaux parallèles, indiquant que YOYO-1 s’intercalait en molécules d’ADN, qui étaient bien alignées et é...

Le rideau d’ADN, une technique d’imagerie à haut débit d’une seule molécule, fournit une plate-forme pour la visualisation en temps réel de diverses interactions protéine-ADN. Le présent protocole utilise la technique du rideau d’ADN pour étudier le rôle biologique et le mécanisme moléculaire d’Abo1, une ATPase AAA+ contenant du bromodomaine de Schizosaccharomyces pombe .

Déchiffrer le mécanisme moléculaire de l’assemblage des histones par la technique du rideau d’ADN

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Ce protocole montre comment la technique du rideau d’ADN est utilisée pour étudier la dynamique de la chromatine, en particulier pour étudier la fonction moléculaire des chaperons d’histones. La technique d’imagerie à haut débit d’une seule molécule d’ADN permet de surmonter les limites des expériences en vrac et facilite l’imagerie en temps réel, permettant la caractérisation détaillée des interactions entre les biomolécules. Mettez un papier propre de dimension 5 par 35 millimètres au centre du ruban adhésif double face.Fixez le ruban adhésif sur la diapositive pour couvrir les deux trous et les nano-motifs avec le papier. Retirez ensuite le papier à l’aide d’une lame propre. Placez une lamelle de verre sur le ruban adhésif double face et frottez la lamelle de protection à l’aide d’une pointe de pipette pour former une chambre microfluidique.Placez la cellule d’écoulement assemblée entre deux lames de microscope et clipsez-les. Faites cuire la cellule d’écoulement dans un four sous vide à 120 degrés Celsius pendant 45 minutes. Fixez le connecteur de fluide pour l’analyse à base de puce à chaque trou ouvert à l’aide d’un pistolet à colle chaude.Et connectez les deux lignes de tubes de verrouillage du leurre. Branchez une seringue contenant trois millilitres d’eau déminéralisée et lavez la chambre. Lavez à nouveau la chambre avec trois millilitres de tampon lipidique via une connexion goutte à goutte.Injectez un millilitre de lipide biotinylé 0,04x dans le tampon lipidique, dans la chambre, en deux fois, avec une incubation de cinq minutes par injection. Injectez 0,025 milligramme par millilitre de streptavidine dans un millilitre de BSA, avec deux injections et une incubation de 10 minutes par injection. Injecter environ 30 picomolaires d’ADN de phage lambda biotinylé dans un millilitre de tampon BSA, dans la chambre avec deux injections et des incubations de 10 minutes par injection.Connectez une seringue contenant 10 millilitres de tampon d’imagerie à un pousse-seringue et éliminez les bulles dans toutes les conduites de tubulure du système microfluidique. Couplez la cellule d’écoulement préparée avec le système microfluidique via une connexion goutte à goutte pour éviter l’injection de bulles dans la cellule d’écoulement. Assemblez la cellule d’écoulement et les supports de cellule d’écoulement, et montez l’ensemble sur un microscope à fluorescence à réflexion interne totale construit sur mesure.Injecter 200 microlitres de colorant YOYO-1 dans le tampon d’imagerie à travers 100 microlitres de boucle d’échantillon pour colorer les molécules d’ADN Lambda. Exécutez un logiciel d’imagerie et allumez le laser de 488 nanomètres pour vérifier si les rideaux d’ADN sont bien formés. Une fois que le colorant YOYO-1 a été retiré, injectez l’échantillon de protéine pré-incubé.Lorsque les protéines atteignent le rideau d’ADN, éteignez le pousse-seringue, fermez la vanne d’arrêt et incubez pendant 15 minutes pour la charge d’histones par Abo1. Lavez les protéines Abo1 et histones non liées pendant cinq minutes. Arrêtez temporairement le flux tampon pour vérifier si les protéines histones sont chargées sur l’ADN.La formation d’un rideau d’ADN a été vérifiée en colorant les molécules d’ADN avec un colorant interpolant. Les lignes vertes montrées dans des réseaux parallèles indiquaient que YOYO1 intercalé en molécules d’ADN étaient bien alignés et étirés au niveau d’une barrière de diffusion sous écoulement hydrodynamique. Lorsque des dimères Cy5-H3-H4 ont été injectés dans le rideau d’ADN en l’absence d’Abo1, Cy5-H3-H4 ne s’est pas lié à l’ADN, ce qui indique une absence de liaison spontanée des dimères H3-H4 à l’ADN.Lorsque Cy5-H3-H4 a été injecté avec Abo1, des particules fluorescentes rouges ont été observées sur les molécules d’ADN, ce qui suggère qu’Abo1 charge des dimères H3-H4 sur l’ADN. Les signaux fluorescents ont disparu en l’absence d’écoulement tampon et sont réapparus lorsque le flux a été repris, ce qui suggère que les dimères H3-H4 se lient à l’ADN. La liaison des dimères H3-H4 à l’ADN a également été confirmée par le kymographe, dans lequel les signaux de fluorescence disparaissaient chaque fois que le flux était coupé.Peu de particules fluorescentes sont apparues dans le rideau d’ADN, soit en l’absence de nucléotide, soit en présence d’ADP, ce qui indique que les dimères H3-H4 se lient rarement à l’ADN, que ce soit à l’état Apo ou en présence d’ADP. L’analyse quantitative montre que le nombre de dimères H3-H4 liés à l’ADN augmente en présence d’ATP. Les résultats suggèrent que l’hydrolyse de l’ATP est essentielle pour le chargement de H3-H4 sur l’ADN par Abo1.Éviter l’injection de bulles dans la cellule d’écoulement est le plus critique pour toutes les étapes. Ainsi, dans ce protocole, nous mettons l’accent sur les connexions goutte à goutte. Le test de rideau d’ADN peut être étendu aux rideaux d’ADN à double attache avec deux nano-motifs.De plus, nous pouvons fabriquer un autre type de rideau d’ADN avec des filaments d’ADN simple brin, d’ARN ou d’actine. Le rideau d’ADN permet de visualiser le mouvement des protéines sur l’ADN et facilite l’étude du mécanisme de recherche de cibles. Le rideau d’ADN peut être étendu pour étudier le métabolisme de l’ADN, y compris la réplication et la transcription.

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