Name: Analyses de la protéinurie, de l’infiltration rénale des leucocytes et du dépôt rénal de protéines chez les souris LMR/LPR sujettes au lupus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Découvrez une méthode fiable et économique pour suivre la progression du lupus chez les souris MRL/LPR. Cette technique permet d'évaluer la protéinurie, l'infiltration leucocytaire et le dépôt protéique rénal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le Flow Cytometry Core Facility, le laboratoire d’histopathologie, le Fralin Imaging Center du Virginia Polytechnic Institute et l’Université d’État pour leur soutien technique. Ce travail est soutenu par diverses subventions internes et NIH.

Le présent protocole est approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de Virginia Tech. Étant donné que la maladie du lupus a une incidence plus élevée chez les femelles, seules les souris LMR / LPR femelles ont été utilisées. Le prélèvement de l’échantillon a commencé à l’âge de 4 semaines et s’est terminé à 15 semaines. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et ont été élevées et maintenues dans un environnement exempt d’agents pathogènes spécifiques conformément aux lignes directrices institutionnelles.
1. Test de protéinurie
<ol><li>Recueillir l’urine en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Stérilisez la hotte en pulvérisant de l’éthanol à 70%. Placez une feuille de plastique stérile sur la surface. Préparez des pointes, des tubes de 1,5 mL et une pipette pour recueillir environ 20 μL du liquide. NOTE: Les embouts et les tubes doivent être stériles et sans aucun prétraitement.</li>
		<li>Prenez la cage et vaporisez de l’éthanol à 70% avant de la mettre à l’intérieur de la hotte.</li>
		<li>Tenez la souris d’une main et utilisez l’autre main pour masser doucement la région ventrale de haut en bas.</li>
		<li>Utilisez un tube ou une pipette de 1,5 ml pour recueillir l’urine directement ou, si l’échantillon tombe, prélevez-la sur la feuille de plastique. Utilisez des gants, des draps et des embouts frais pour chaque échantillon. REMARQUE: Si cela ne fonctionne pas, utilisez un bécher stérile pour isoler la souris, puis recueillez l’urine du bécher après que la souris ait uriné.</li>
		<li>Remettez la souris dans la cage. Retirez une autre souris et répétez les étapes 1.1.3-1.1.4. REMARQUE: Nettoyez toujours la feuille de plastique et le bécher avec de l’éthanol à 70% après avoir prélevé l’échantillon pour chaque souris. Au moins cinq souris par groupe sont nécessaires pour la signification statistique. Les échantillons d’urine peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à utilisation jusqu’à 12 mois.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantifier les protéines par la méthode de Bradford24.<ol><li>Laissez les échantillons d’urine, l’albumine standard et le réactif de Bradford arriver à température ambiante (RT) en les gardant à l’extérieur du congélateur pendant 10-20 min. REMARQUE : Le réactif Bradford et l’étalon d’albumine sont inclus dans une trousse disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). La concentration initiale de l’étalon d’albumine est de 2 mg/mL. Les dilutions en série (1:2 six fois) doivent être effectuées avec de l’eau.</li>
		<li>Ajouter le réactif de Bradford à une plaque de 96 puits (200 μL/puits), non dilué.</li>
		<li>Pipeter 5 μL d’échantillon d’urine non diluée par puits et utiliser l’embout pour pipeter plusieurs fois de haut en bas pour bien mélanger.</li>
		<li>Ajouter les étalons (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dL) en double. Laissez quelques puits comme blancs. REMARQUE : L’ajout d’échantillons et de normes doit être effectué rapidement.</li>
		<li>Laisser reposer pendant 5-10 min à RT.</li>
		<li>Lire la plaque à 595 nm dans un lecteur de plaque conformément au protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolement des cellules rénales
<ol><li>Euthanasier la souris avec du CO2 (débit: 30%-70% volume/min, pour atteindre l’inconscience ou la mort) dans une chambre suivie d’une luxation cervicale. Procéder à la dissection pour prélever les deux reins. Placez un rein et demi dans un milieu C10 glacé. Mettez l’autre moitié du rein dans la TCO (étape 3.1.1). NOTE: C10 est fabriqué avec RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal, 1 mM de pyruvate de sodium, 1% de 100x MEM acides aminés non essentiels, 10 mM de HEPES, 55 μM de 2-mercaptoéthanol et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matières).</li>
	<li>Couper les reins en grains granulométriques (1-2 mm3 pièces) et les digérer dans 5 mL de tampon de digestion contenant 1 mg/mL de collagénase et 0,2 mg/mL de DNase I (voir le tableau des matières) dans un milieu RPMI 1640 contenant 10 mmol/L de HEPES pendant 1 h avec agitation douce continue à 37 °C. REMARQUE : Ajouter un tampon de digestion de 1 mL dans un tube stérile de 2 mL et utiliser des ciseaux stériles pour hacher le rein.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de 1x PBS glacé contenant 10 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incuber pendant 10 minutes sur de la glace. Puis vortex la suspension deux fois.</li>
	<li>Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 100 μM et laver avec 10 ml de HBSS-plein. REMARQUE: HBSS-full contient 5 mM d’EDTA, 0,1% BSA et 10 mM de HEPES.</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 10 min à RT.</li>
	<li>Préparer une solution de percollation isotonique mère (SIP) à 30 %, 37 % et 70 %. REMARQUE : Mélanger 1 partie de volume de 10x PBS et 9 parties de volume de Percoll pour préparer le SIP (voir le tableau des matières); utilisez HBSS-full pour diluer le SIP à 30 %, 37 % et 70 % SIP.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 5 mL de SIP à 30 % et charger 37 % de 5 mL (en haut) et 70 % en 5 mL (en bas), en faisant un gradient SIP, lentement avec une pipette à pâte à pâtisserie.</li>
	<li>Centrifuger avec Up9 down0 (ou frein 0) à 1000 x g pendant 30 min à RT.</li>
	<li>Recueillir les leucocytes de l’interface 37%-70% et les remettre en suspension dans 5 mL de C10.</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 3 mL de tampon FACS. Les cellules sont prêtes pour la coloration FACS. REMARQUE: Le tampon FACS contient 1x PBS et 0,1% d’albumine sérique bovine (BSA).</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant (SN), en laissant environ 50 μL. NOTE: Pour retirer le surnageant, verser ou pipeter soigneusement la solution loin du solide ou utiliser un vide semi-automatique pour aspirer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de bloc FcR (voir le tableau des matériaux) par tube (prédilué 1/50 dans 1x PBS); Mélanger et incuber sur la glace dans l’obscurité pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter 2 ml de tampon FACS au lavage.</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et éliminer le SN, en laissant environ 50 μL.</li>
	<li>Ajouter 20 μL du colorant fluorescent approprié (diluer 1/100 avec 1x PBS, voir le tableau des matériaux) et laisser reposer pendant 15 à 30 minutes sur la glace.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de mélange d’anticorps 15 par tube : CD138-BV711 (1/200 dans 1x PBS) et CD45-AF700 (1/200 dans1x PBS) (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Incuber sur la glace dans l’obscurité pendant 15 à 30 minutes et ajouter 3 ml de tampon FACS.</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et vide SN, laissant environ 50 μL. Resuspendre dans 200 μL de 1x PBS. Celui-ci est maintenant prêt à être analysé par cytométrie de flux.</li>
</ol>3. Coloration par immunofluorescence
<ol><li>Effectuez le prélèvement d’échantillons.<ol><li>Intégrez le demi-rein dans le petit cryomoule en plastique avec le composé à température de coupe optimale (OCT) (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Ajoutez de la glace sèche dans une boîte en mousse de polystyrène (voir le tableau des matériaux) et placez soigneusement le cryomoule sur la glace sèche. Assurez-vous que les cryomoules sont placés à plat. REMARQUE: Il faut 3-4 minutes pour que le composé OCT se solidifie et devienne blanc.</li>
		<li>Retirez le cryomoule et enveloppez-le dans du papier d’aluminium. Conserver à -80 °C jusqu’à nouvelle utilisation. REMARQUE: Celui-ci peut être conservé à -80 °C pendant au moins 1 an.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer la section et la fixation de l’échantillon.<ol><li>Couper les échantillons en sections de 4 μm, attendre au moins 2-3 heures pour sécher, puis fixer avec de l’acétone froide (à 4 °C) pendant 10 min. REMARQUE: Soyez prudent lorsque vous utilisez de l’acétone, qui nécessite une hotte chimique spécialisée.</li>
		<li>Après avoir fixé les lames, sécher à l’air libre pendant 0,5-1 h et les stocker pendant une courte période à -20 ° C ou pendant une longue période à -80 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorer les échantillons.<ol><li>Refixez les lames dans de l’acétone froide pendant 5-10 min.</li>
		<li>Laissez les sections se réchauffer à TA. Utilisez un stylo PAP (voir le tableau des matériaux) autour de la section et laissez-la sécher. REMARQUE: L’émail des ongles peut également être utilisé. Cette étape empêche la dilution des anticorps de flotter sur toute la lame.</li>
		<li>Placer les lames dans 1x solution saline tamponnée Tris (TBS) dans le pot Coplin (voir le tableau des matériaux) pendant 20 min, mettre le pot sur le shaker et agiter doucement.</li>
		<li>Versez 1x TBS et remplissez le pot avec 1x TBS, 5% BSA et 0,1% Tween 20. Incuber pendant 20 min sur le shaker, agiter doucement.</li>
		<li>Retirez les lames et essuyez le bas des lames. Si nécessaire, secouez les lames à sec. Ajouter 100 μL d’anticorps conjugués25 C3-FITC (1/100) et IgG2a-PE (1/100) à la section (voir le tableau des matières). Incuber à TA dans une chambre humidifiée pendant 1 h.</li>
		<li>Laver la section 3 fois dans 1x TBS, 5% BSA et 0,1% Tween 20 pendant 10 min sur le shaker.</li>
		<li>Secouez les lames et montez la section avec un réactif antidécoloration (voir Tableau des matières) puis un couvercle.</li>
		<li>Conservez les lames à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient observées au microscope (p. ex., microscope confocal ou microscope à système d’imagerie). Quantifier les images à l’aide d’un logiciel et soustraire les signaux d’arrière-plan lors de la comparaison de l’intensité de fluorescence entre les régions.</li>
		<li>Pour l’analyse d’images à l’aide du logiciel ImageJ (voir Tableau des matériaux), décrivez la région souhaitée.</li>
		<li>Définissez les paramètres standard en cliquant sur Analyser, puis Définir les mesures et la zone de mesure pour obtenir les résultats.</li>
		<li>Transférez les données obtenues à partir des fenêtres de mesure vers une feuille de calcul. REMARQUE: Une petite zone peut être sélectionnée à partir de l’image comme arrière-plan; Il ne devrait pas avoir de fluorescence.</li>
		<li>Une fois cela fait, cliquez sur Analyser pour mesurer la région et transférer à nouveau les données vers la feuille de calcul précédente.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.3.11 à 3.3.12 pour plusieurs régions.</li>
		<li>Calculer la fluorescence moyenne comme Fluorescence cellulaire corrigée (CCF) = Densité intégrée - (Région cellulaire sélectionnée x Fluorescence de fond moyenne).</li>
		<li>Calculez pour chaque région et analysez les données à l’aide du logiciel de représentation graphique et de statistiques (voir le tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li>
<li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lupus+nephritis%3A+lessons+from+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li>
<li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li>
<li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li>
<li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li>
<li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li>
<li>Aragón, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042(2020).</li>
<li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73(2017).</li>
<li>Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li>
<li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+should+proteinuria+be+detected+and+measured%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).</li>
<li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Chronic+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li>
<li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li>
<li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li>
<li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li>
<li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases%3A+translational+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741(2018).</li>
<li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays%3A+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li>
<li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+deficiencies+in+humans+and+animals%3A+links+to+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li>
<li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+renal+disease+in+MRL%2Flpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+regulates+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li>
<li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li>
<li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li>
<li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis%3A+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li>
<li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li>
<li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+Mice%3A+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li>
<li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li>
<li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li>
<li>Park, J. G. -, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678(2020).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

La LN est l’une des principales causes de mortalité chez les patients atteints de LED et les facteurs aggravant la maladie restent incertains. L’application de ce protocole consiste à caractériser la fonction rénale à l’aide de multiples méthodes, y compris la mesure de la protéinurie, l’analyse FACS de leucocytes rénaux isolés et la coloration par immunofluorescence de sections rénales congelées.
Un point important à considérer lors de la collecte d’urine est que l’on doit être cohérent avec ...

La fonction première du rein est l’élimination des substances toxiques par l’urine tout en maintenant l’homéostasie de l’eau et des sels1. Cette fonction est menacée chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED), conduisant à ce que l’on appelle la néphrite lupique (LN). La LN est une conséquence de l’attaque du système immunitaire sur les reins, entraînant une inflammation rénale persistante, perdant ainsi sa capacité à nettoyer les déchets du sang et à réguler les concentrations de sel et de liquide. Cela conduira éventuellement à une insuffisance rénale, qui peut être fatale. Au cours du processus néphritique, les cellules B circulantes, les cellules T et les monocytes sont recrutés dans le rein, sécrétant des chimiokines, des cytokines et des autoanticorps formant des complexes immunitaires. Cela entraîne finalement des lésions des cellules endothéliales, des lésions membraneuses, une atrophie tubulaire rénale et une fibrose2.
LMR/Mp-Fas lpr (LMR/lpr) Les souris sujettes au lupus sont un modèle de souris classique présentant des signes cliniques semblables au lupus qui ressemblent à SLE3 humains. Ce modèle a joué un rôle déterminant dans la compréhension de l’une des principales causes de mortalité chez les patients atteints de LED à la lupie (LN)4. Dans le LED humain et chez la souris, le LN se caractérise par une inflammation progressive déclenchée par le dépôt rénal de complexes immuns, suivie de l’activation du complément, du recrutement de cellules inflammatoires et de la perte de la fonction rénale5. Le dépôt du complexe immunitaire est la première étape pour induire la production de chimiokines et de cytokines par les cellules rénales intrinsèques, ce qui élargit la réponse inflammatoire en recrutant des cellules immunitaires6. Le protocole actuel présente plusieurs techniques pour suivre la progression de la maladie rénale qui analysent l’infiltration cellulaire et le dépôt de complexes immuns.
L’urine recueillie chaque semaine permet de détecter et de visualiser l’évolution de la protéinurie avant, pendant et après l’apparition du lupus. La protéinurie en tant que biomarqueur peut déterminer la progression biologique de la LN. Les autres avantages de cette technique sont qu’elle est non invasive, rentable et facile à mettre en œuvre7. Lorsque le rein fonctionne parfaitement, le taux de protéinurie est constamment bas; Cependant, chez les souris LMR/LPR, après l’âge de 8-9 semaines, on observe une augmentation progressive du taux de protéinurie, qui est finalement suffisamment élevé pour provoquer une insuffisance rénale8. Plusieurs bandelettes de réactifs et réactifs colorimétriques sont disponibles dans le commerce pour surveiller le problème. Cependant, le test de Bradford est bon marché et très précis pour déterminer l’apparition de la protéinurie et l’évolution de la néphrite lupique. Ce test est rapide et le réactif n’est pas affecté par la présence de solvants, de tampons, d’agents réducteurs et d’agents chélatants métalliques qui peuvent se trouver dans votre échantillon 9,10,11.
Un aspect important à considérer est l’infiltration cellulaire dans le rein. Ces infiltrats favorisent la pathogenèse en déclenchant la sécrétion de facteurs solubles tels que les cytokines pour aggraver l’inflammation12. Pour mieux comprendre quelles populations cellulaires sont présentes dans les infiltrats, une méthode utile consiste à isoler les leucocytes13. Ici, la détection de l’infiltration rénale des cellules B est utilisée comme exemple. La procédure commence par un processus de digestion avec de la désoxyribonucléase (DNase) et de la collagénase, suivi d’une séparation du gradient de densité qui élimine les débris, les globules rouges et les granulocytes denses. La raison de l’isolement des lymphocytes B (CD19+) et des plasmocytes (CD138+) est que les reins lupiques peuvent concentrer ces cellules14. Il est suggéré que la présence de cellules B dans de petits agrégats dans le rein peut indiquer une expansion clonale et, par conséquent, la production d’immunoglobulines (Ig). Les plasmocytes sont bien connus pour être présents dans ces agrégats ainsi que15. Une fois les leucocytes isolés, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) peut être utilisé pour analyser les cellules d’intérêt lors de la coloration avec différents anticorps conjugués à la fluorescence.
L’immunofluorescence est l’une des méthodes de détection immunohistochimique (IHC) qui permet la visualisation fluorescente des protéines dans des échantillons de tissus rénaux de 4 μm d’épaisseur. D’autres méthodes de détection de l’IHC dépendent de la nature des analytes, de la chimie de liaison et d’autres facteurs16. L’immunofluorescence est une méthode d’identification rapide qui expose l’antigène à son anticorps homologue marqué avec un fluorochrome spécifique (ou un colorant fluorescent). Lorsqu’il est excité, il produit de la lumière qu’un microscope à fluorescence peut détecter. Cette technique permet d’observer le dépôt du complément C3 et des IgG2a17. Une activation excessive en cascade du complément pourrait être associée à une réponse immunitaire incontrôlée et à une perte de fonction18. Le dépôt immunitaire d’autoanticorps anti-double brin d’ADN (anti-ADNds) dans le rein est une préoccupation majeure19, où ceux avec l’isotype IgG2a ont été associés à LN20. Plus précisément, les anticorps anti-ADNds présentent plus de pathogénicité et d’affinité pour les matières nucléaires, formant des complexes immuns21. Lorsque l’IgG2a est présente, la cascade du complément, y compris C3, est activée pour éliminer les complexes immuns22. Les marqueurs C3 et IgG2a peuvent être quantifiés individuellement ou superposés pour établir leur corrélation.
Notamment, la mesure de la créatinine sérique est une autre technique fiable qui peut être utilisée avec une hématurie microscopique et des biopsies rénales pour diagnostiquer LN23. Cependant, la présence de protéinurie est un indicateur fort de lésions glomérulaires. En ce sens, la surveillance du niveau de protéinurie pendant le lupus peut détecter l’apparition de la maladie et compléter d’autres méthodes de diagnostic du lupus. De plus, les complexes immuns déposés dans les glomérules peuvent induire une réponse inflammatoire, activer le système du complément et recruter davantage de cellules inflammatoires. Un autre point remarquable de ce protocole est l’infiltration des cellules B dans le rein. Ceci, avec les cellules T infiltrées, amplifie les réponses immunitaires locales qui déclenchent des dommages aux organes. Il est important de noter que la classification du LN n’est pas seulement basée sur les changements morphologiques glomérulaires observés en microscopie, mais aussi sur les dépôts immunitaires observés avec l’immunofluorescence. Par conséquent, dans ce protocole, des méthodes précises et rentables pour l’analyse de la fonction rénale sont proposées en laboratoire.

<table><tbody><tr><td>10x solution saline tris-tamponnée (tbs)</td><td>thermo Fisher Scientific</td><td>J60764. K2</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humain/souris C3</td><td>Cedarlane</td><td>CL7632F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD138 BV711</td><td>Biolegend</td><td>142519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD45 AF700</td><td>Biolegend</td><td>103127</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Coplin</td><td>jar Fisher Scientific</td><td>50-212-281</td><td></td></tr><tr><td>Cryomoule</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td></td></tr><tr><td>Gradient de densité moyen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Eau traitée DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA-EC</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-ecdna</td><td></td></tr><tr><td>Ethylènediamineacide tétraacétique</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Système d’imagerie microscope</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td></td></tr><tr><td>FACS Fusion Trieur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Fusion Sérum</td><td></td></tr><tr><td>fœtal bovin - Premium, Inactivé par la chaleur</td><td>R& D systems</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Plaques de polystyrène 96 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-501</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad prisme</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solution saline équilibrée</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>MEM acides aminés non essentiels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Souris (MRL/lpr)</td><td>Jackson Lab</td><td>485</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Tout magasin conventionnel</td></tr><tr><td>Composé O.C.T</td><td>Tisse-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Stylo PAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Moules d’encastrement jetables Peel-A-Way</td><td>Polysciences</td><td>R-30</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 20x TBS Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28358</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Kit</td> <td>de dosageThermo Fisher Scientific</td><td>23236</td><td>Albumine standard incluse</td></tr><tr><td>ProLon Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Sérum anti-souris purifié pour rats CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>bloc FcR</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Logiciel SoftMax Pro 6.1</td></tr><tr><td>Passoires à cellules stériles 100 & micro ; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de vancomycine</td><td>Goldbio</td><td>V-200-1</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua</td><td>Biolegend</td><td>423102</td><td>colorant fluorescent pour l’analyse par cytométrie en flux</td></tr></tbody></table>

analyses de la protéinurie, de l’infiltration rénale des leucocytes et du dépôt rénal de protéines chez les souris lmr/lpr sujettes au lupus

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une maladie auto-immune sans remède connu et se caractérise par une inflammation persistante de nombreux organes, y compris les reins. Dans de telles circonstances, le rein perd sa capacité à nettoyer les déchets du sang et à réguler les concentrations de sel et de liquide, conduisant éventuellement à une insuffisance rénale. Les femmes, en particulier celles en âge de procréer, sont diagnostiquées neuf fois plus souvent que les hommes. La maladie rénale est la principale cause de mortalité chez les patients atteints de LED. Le présent protocole décrit une méthode simple et rapide pour mesurer les niveaux de protéines excrétées dans l’urine recueillie, en suivant la progression du lupus au fil du temps. En outre, une approche pour isoler les cellules mononucléaires rénales est fournie en fonction de la sélection de la taille et de la densité pour étudier l’infiltration rénale des leucocytes. De plus, une méthode immunohistochimique a été développée pour caractériser le dépôt de protéines dans les glomérules et l’infiltration leucocytaire dans l’espace tubulo-interstitiel. Ensemble, ces méthodes peuvent aider à étudier la progression de l’inflammation chronique associée aux reins des souris LMR / LPR sujettes au lupus.

Le protocole utilise plusieurs méthodes pour évaluer les LMR / lpr chez les souris pour la néphrite lupique. Tout d’abord, une procédure est décrite pour étudier l’augmentation des niveaux de protéinurie due à un dysfonctionnement rénal au fil du temps. Comme le montre la figure 1, des souris femelles ont été traitées avec un gavage oral de 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) comme groupe témoin et avec le probiotique Lactobacillus reuteri comme groupe de trait...

Le présent protocole décrit une méthode pour suivre la progression du lupus chez la souris. Deux procédures supplémentaires sont présentées pour caractériser la néphrite lupique basée sur l’infiltration cellulaire et le dépôt de protéines dans les reins.

Analyses de la protéinurie, de l’infiltration rénale des leucocytes et du dépôt rénal de protéines chez les souris LMR/LPR sujettes au lupus

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Ces méthodes peuvent aider à étudier la progression de l’inflammation chronique associée aux reins chez les patients atteints de lupus. Nous offrons une alternative fiable et rentable qui peut être utilisée pour surveiller l’évolution de la maladie dans le lupus. Commencez à stériliser la hotte en pulvérisant de l’éthanol à 70% et placez une feuille de plastique stérile sur la surface.Préparez ensuite des embouts, des tubes de 1,5 millilitre et une pipette pour recueillir environ 20 microlitres d’urine. Prenez la cage et vaporisez de l’éthanol à 70% avant de la placer à l’intérieur de la hotte. Ensuite, tenez la souris d’une main et utilisez l’autre main pour masser doucement la région ventrale de haut en bas.À l’aide d’un tube ou d’une pipette de 1,5 millilitre, recueillir l’urine directement. Ou si les gouttes d’échantillon le recueillent sur la feuille de plastique. Remettez ensuite la souris dans la cage.Couper les reins disséqués en granulométrie et les digérer dans cinq millilitres de tampon de digestion contenant de la collagénase et de la DNase 1 dans un milieu RPMI 1640 contenant de l’HEPES pendant une heure avec agitation douce continue à 37 degrés Celsius. Ajouter 10 millilitres de PBS glacé contenant 10 millimolaires d’EDTA et incuber pendant 10 minutes sur de la glace. Puis vortex la suspension deux fois.Plus tard, filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire de 100 micromètres et lavez avec 10 millilitres de HBSS plein. Ensuite, centrifuger à 350 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Préparer une solution de Percoll isotonique à 30, 37 et 70 % et ajouter une couche de solution de Percoll à 37 % par-dessus la solution à 70 %.Re suspendre les cellules dans cinq millilitres de Percoll isotonique à 30%. À l’aide d’une pipette Pasteur, chargez lentement 37% de cinq millilitres en haut et 70% de cinq millilitres en bas, ce qui rend le gradient de Percoll isotonique du stock. Ensuite, centrifuger avec le numéro neuf et le numéro zéro à 1000 fois G pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, collectez les leucocytes de l’interface 37 à 70% et remettez-les en suspension dans cinq millilitres de C 10. Encore une fois, centrifuger à 350 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Par la suite, remettre en suspension la pastille de la cellule dans trois millilitres de tampon de télécopie et centrifugeuse à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Jetez ensuite le surnageant en laissant environ 50 microlitres du volume total. Ajouter 50 microlitres de bloc récepteur FC par tube. Ensuite, mélangez et incuber sur de la glace dans l’obscurité pendant 10 minutes.Plus tard, ajoutez deux millilitres de tampon fax pour le lavage. Ensuite, centrifuger à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant en laissant environ 50 microlitres du volume total. Ensuite, ajoutez 20 microlitres du colorant fluorescent approprié et laissez-le reposer pendant 15 à 30 minutes sur de la glace.Ajouter 50 microlitres de mélange d’anticorps par tube contenant CD 138 brilliant violet seven 11 et CD 45 Alexa Fluor 700 et incuber sur de la glace dans l’obscurité pendant 15 à 30 minutes. Ensuite, ajoutez trois millilitres de tampon de fax. Centrifuger à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Retirer le surnageant par aspiration en laissant environ 50 microlitres du volume total. Plus tard, remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres de PBS. Pour prélever l’échantillon, intégrez le demi-rein dans le petit cryomoule en plastique avec le composé à température de coupe optimale.Ensuite, ajoutez de la glace sèche dans une boîte en mousse de polystyrène et placez soigneusement le cryomoule sur la glace sèche. Ensuite, retirez le cryomoule, enveloppez-le dans du papier d’aluminium et stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Ensuite, fixez les sections sèches à quatre micromètres avec de l’acétone froide pendant 10 minutes.Après avoir fixé les lames, séchez-les à l’air pendant 0,5 à une heure et conservez-les à moins 20 degrés Celsius pendant une courte période ou moins 80 degrés Celsius pendant une longue période. Pour colorer les échantillons, refixez les lames dans de l’acétone froide pendant cinq à 10 minutes et laissez les sections se réchauffer à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’un stylo pat, tracez un cercle hydrophobe autour de la section et laissez-la sécher.Ensuite, placez les lames dans TBS dans le pot Copeland pendant 20 minutes et agitez doucement en mettant le pot sur le shaker. Ensuite, versez TBS et remplissez le pot avec TBS 5% BSA et 0,1% TW 20. Plus tard, incuber le pot pendant 20 minutes en agitant doucement sur le shaker.Ensuite, retirez les diapositives et essuyez le bas des diapositives. Ajouter 100 microlitres d’anticorps conjugués C3 fit C et IgG2 APE à la section et incuber la température ambiante dans une chambre humidifiée pendant une heure. Laver la section trois fois dans du PBS 5%BSA et 0,1%TW 20 pendant 10 minutes sur le vibreur, puis sécher les lames.Montez la section avec un réactif anti-décoloration, puis avec un couvercle. Conservez ensuite les lames à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient observées au microscope. Pour l’analyse d’image à l’aide du logiciel image J, décrivez la région souhaitée.Ensuite, définissez les paramètres standard en cliquant sur analyser, puis définissez les mesures et mesurez la zone pour obtenir les résultats. Ensuite, transférez les données obtenues à partir des fenêtres de mesure vers une feuille de calcul. Une fois cela fait, cliquez sur analyser pour mesurer la région et transférez à nouveau les données vers la feuille de calcul précédente.Les niveaux de protéines dans l’urine des souris LMR LPR ont été détectés au fil du temps lorsqu’elles ont été traitées avec une solution saline tamponnée au phosphate comme groupe témoin et lactobacillus reuteri comme groupe de traitement. Le groupe de souris traitées avec L. reuteri à une progression protéinurique plus agressive que le groupe témoin. L’analyse par fax a été effectuée pour les leucocytes rénaux isolés afin d’analyser les plasmocytes.En outre, les souris ont été traitées avec de la vancomycine ou de la vancomycine avec de l’ADN double brin d’Escherichia coli. Bien que l’on s’attendait à ce que l’ADN double brin d’Escherichia coli déclenche l’infiltration rénale, aucune différence significative n’a été observée dans le pourcentage de plasmocytes. Le complément C3 et les IgG2a ont été détectés par coloration par immunofluorescence sur des coupes rénales LMR féminines IPR.Les facteurs environnementaux efficaces sur les dépôts rénaux de C3 et d’IgG2a ont été comparés pour le pain de souris maison dans l’animalerie et ceux achetés auprès d’un vendeur. L’analyse immunohistochimique n’a montré aucune différence entre les deux groupes. L’ajout de chaque couche de la solution ISO 20 Percoll en pourcentage peut être difficile, et si elles se mélangent, vous devez recommencer.Cette procédure aide avec le cytomètre de flux et dans les expériences de vitter, de sorte que vous ne pouvez pas étudier les différents types de cellules rénales des populations. Cette procédure nous permet d’étudier les infiltrats de cellules B dans les reins et il n’y a pas beaucoup d’informations dans la littérature.

analyses-proteinuria-renal-infiltration-leukocytes-renal-deposition

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Le transfert de lymphocytes bm12 chez un receveur C57BL/6 est un modèle établi de lupus érythémateux disséminé. Nous décrivons ici comment initier une maladie à l’aide de ce modèle et comment caractériser les cellules auxiliaires folliculaires T, les cellules B du centre germinatif et les plasmocytes par cytométrie en flux.

Le bm12 inductible modèle du lupus érythémateux disséminé (SLE) dans C57BL / 6

Nous décrivons ici l’induction de syndrome néphrotique expérimental chez la souris 129S1/SvImJ par injection rapide rétrooculaire de la doxorubicine. Nous traitons également néphrotiques souris avec des boulettes de libération prolongée contenant aprotinine pour inhiber l’activité de la protéase sérine urinaire et prévenir la rétention sodée.

Induction de Syndrome néphrotique chez la souris par Injection rétrooculaire de la doxorubicine et la prévention de la rétention de Volume par LIBERATION PROLONGEE aprotinine

Ce protocole décrit une marche à suivre complète rein qui devrait être effectué dans des modèles murins de la maladie glomérulaire. Les méthodes permettent d’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, qui peut être appliquée à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

Évaluation de la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire

Ici, nous présentons trois méthodes pour évaluer la migration et l’infiltration de neutrophiles in vivo et in vitro. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.

Détection de la migration et de l’infiltration des neutrophiles chez les souris

Les microARN sont impliqués dans la pathogenèse de la néphropathie à IgA. Nous avons développé une méthode fiable pour détecter les niveaux d’expression des microARN dans les reins d’un modèle murin de néphropathie à IgA (souris HIGA). Cette nouvelle méthode facilitera la vérification de l’implication des miARN dans la néphropathie à IgA.

Détection de l’expression de microARN dans les reins de souris néphropathiques immunoglobulines A

Ici, nous présentons un protocole utilisant la microscopie à 2 photons chez des rats Wistar Fromter de Munich avec des glomérules de surface pour quantifier les effets de l’obstruction urétérale prolongée sur la dynamique et la fonction glomérulaires.

Utilisation de la microscopie à 2 photons pour quantifier les effets de l’obstruction urétérale unilatérale chronique sur les processus glomérulaires

Ce protocole fournit une méthode d’isolement de l’ADN simple et rentable pour l’analyse des altérations du microbiote intestinal murin au cours du développement de maladies auto-immunes.

Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN

Ce protocole décrit une méthode d’induction d’une obstruction urétérale unilatérale (UUO) chez la souris afin d’étudier la progression de la fibrose tissulaire dans la néphropathie obstructive. Il comprend les procédures chirurgicales, les soins postopératoires et les méthodes d’évaluation de la fibrose.

Modèle d’obstruction urétérale unilatérale pour l’étude de la fibrose interstitielle rénale

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’analyse protéomique de l’ensemble du rein, du tubule cortical isolé et des protéomes médullaires. L’étude compare également les protéomes régionaux dans un modèle de souris diabétiques et chez des souris non diabétiques.

Analyse protéomique comparative des tubules rénaux entiers, moelleux et corticaux dans la pathogenèse diabétique des lésions rénales chez la souris

Ce protocole décrit une procédure de survie pour une lymphadenectomie rénale bilatérale murine sûre et bien tolérée.

Lymphadenectomie rénale bilatérale murine

Découvrez une méthode fiable et économique pour suivre la progression du lupus chez les souris MRL/LPR. Cette technique permet d'évaluer la protéinurie, l'infiltration leucocytaire et le dépôt protéique rénal.

Analyses de la protéinurie, de l’infiltration rénale des leucocytes et du dépôt rénal de protéines chez les souris LMR/LPR sujettes au lupus (Vidéo) | JoVE Journal

Analyses de la protéinurie, de l’infiltration rénale des leucocytes et du dépôt rénal de protéines chez les souris LMR/LPR sujettes au lupus

Explorer plus de vidéos