Name: Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Découvrez l'isolement de microglie primaire par tri cellulaire magnétique dans des modèles de démyélinisation chez la souris. Cette méthode optimise l'étude des caractéristiques microgliales in vivo avec une meilleure efficacité.

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L’étude a été soutenue par la Fondation pour un excellent jeune scientifique de l’hôpital Tongji (HUST) (subvention n ° 2020YQ06).

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de l’Institut des soins aux animaux du Tongji Medical College, Université des sciences et de la technologie de Huazhong, en Chine.
1. Matériaux
<ol><li>Préparez les solutions suivantes avant de commencer le protocole.<ol>
<li>Préparer le tampon de chargement en ajoutant du sérum bovin fœtal (FBS, 2%) à une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
		<li>Ajouter le colorant rouge neutre (NR) (final 1%) au PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparez les solutions suivantes à l’aide du kit de dissociation du cerveau adulte disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).<ol>
<li>Pour préparer le mélange d’enzymes 1, pipeter 1,9 mL de tampon Z et 50 μL d’enzyme P dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.</li>
		<li>Pour préparer le mélange d’enzymes 2, pipeter 20 μL de tampon Y et 10 μL d’enzyme A dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.</li>
		<li>Préparez la solution d’enlèvement des débris.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Perfusion et dissection de souris
<ol><li>Injecter par voie intrapéritonéale (i.p.) à la souris 500 μL de colorant NR à 1 % dans le PBS 2-3 h avant l’anesthésie. REMARQUE : L’injection intrapéritonéale de NR dans des modèles murins démyélinisants aide à discerner les lésions (Figure 1).</li>
	<li>Anesthésiez la souris avec du pentobarbital (50 mg/kg, i.p.), et assurez-vous que la souris est anesthésiée avec succès en examinant les réponses à la douleur.</li>
	<li>Ouvrez la cavité thoracique de la souris et exposez le cœur.</li>
	<li>Coupez soigneusement un petit coin de l’oreillette droite et perfusez la souris avec 20 à 30 ml de PBS froid du ventricule gauche.</li>
	<li>Décapiter la souris sous anesthésie.</li>
	<li>Ouvrez le crâne de la souris et libérez soigneusement le cerveau du crâne.</li>
	<li>Transférez le cerveau dans le moule de la tranche de cerveau de la souris et coupez le cerveau en tranches de 0,1 cm.</li>
	<li>Retirez les tranches de cerveau et placez-les dans du PBS froid dans une boîte de Pétri (60/15 mm). Microdissectionnez les lésions marquées par le colorant NR autour du corps calleux sous un stéréomicroscope à l’aide de pinces microchirurgicales. REMARQUE: S’assurer que le tissu disséqué est aussi complet que possible pour faciliter le transfert ultérieur; l’avancement total de la dissection devrait être achevé en 2 h.</li>
	<li>Transférer le tissu disséqué dans des tubes centrifuges de 15 mL contenant la quantité appropriée de tampon de charge à froid. REMARQUE: Regrouper le tissu du corps calleux de 2-3 souris ensemble dans un tube en un seul échantillon.</li>
</ol>3. Dissociation tissulaire
<ol><li>Centrifuger le tissu disséqué à 300 ×g pendant 30 s (après avoir atteint cette vitesse) pour prélever l’échantillon au fond du tube.</li>
	<li>Préchauffer le mélange d’enzymes 1 et le mélange d’enzymes de 2 à 37 °C dans un incubateur.</li>
	<li>Ajouter 1 950 μL de mélange d’enzymes préchauffé 1 à un échantillon et digérer dans un incubateur à 37 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter 30 μL de mélange d’enzymes préchauffé 2 et mélanger doucement.</li>
	<li>Digester dans un incubateur à 37 °C pendant 15 min et mélanger doucement toutes les 5 min.</li>
	<li>Ajouter 4 mL de PBS froid au tube après la digestion et agiter doucement.</li>
	<li>Placez des filtres de 70 μm sur des tubes centrifuges de 50 mL et préemballez les filtres avec 500 μL de PBS froid. Filtrer le tissu dissocié en faisant passer les échantillons de tissu digérés à travers les filtres et transférer la suspension filtrée dans le tube de centrifugeuse de 50 mL dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. REMARQUE: Ignorez cette étape si la quantité de tissu est trop petite.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons de tissus filtrés à 300 ×g pendant 10 min à 4 °C et aspirer le surnageant lentement et complètement. REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées sur de la glace, à l’exception de la digestion enzymatique.</li>
</ol>4. Enlèvement des débris
<ol><li>Remettez en suspension doucement la pastille de la cellule avec 1 550 μL de PBS froid.</li>
	<li>Ajouter 450 μL de solution froide pour l’élimination des débris et bien mélanger.</li>
	<li>Superposer le mélange ci-dessus très lentement et doucement avec 2 x 1 mL de PBS froid à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. REMARQUE: Inclinez le tube de centrifugeuse de 45 ° et ajoutez lentement pbS le long de la paroi du tube avec la pipette.</li>
	<li>Transférer le tube lentement et doucement dans une centrifugeuse et tourner à 4 °C et 3 000 × g pendant 10 min.</li>
	<li>Recherchez trois couches après centrifugation. Aspirer complètement les deux couches supérieures à l’aide d’une pipette de 1 000 μL (Figure 2).</li>
	<li>Remplissez le tube jusqu’à 5 mL avec un tampon de chargement à froid et inversez doucement le tube trois fois.</li>
	<li>Centrifuger à 4 °C et 1 000 × g pendant 10 min. Aspirez complètement le surnageant et évitez de perturber la pastille cellulaire.</li>
</ol>5. Séparation magnétique des cellules microgliales
<ol><li>Remettez en suspension la pastille de cellule avec 90 μL de tampon de chargement et ajoutez 10 μL de billes CD11b (Microglia).</li>
	<li>Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 °C.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de chargement et pipeter doucement le liquide de haut en bas avec une pipette de 1 000 μL pour laver les cellules après l’incubation. Centrifuger les cellules à 4 °C et 300 × g pendant 10 min et aspirer complètement le surnageant pour éliminer les billes non liées.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 500 μL de tampon de chargement.</li>
	<li>Placez la colonne MS avec son séparateur pour une sélection positive dans le champ magnétique.</li>
	<li>Rincez la colonne avec 500 μL de tampon de charge pour protéger les cellules et assurer l’efficacité du tri magnétique basé sur le protocole du fabricant.</li>
	<li>Appliquez la suspension de cellule sur la colonne MS et éliminez le flux contenant des cellules non étiquetées.</li>
	<li>Ajoutez trois fois 500 μL de tampon de chargement à la colonne pour éliminer les cellules qui adhèrent à la paroi de la colonne et éliminer le flux. REMARQUE: N’ajoutez un nouveau tampon de chargement pour le lavage que lorsque le réservoir de colonne est complètement vide.</li>
	<li>Retirez la colonne du séparateur après avoir lavé la colonne et placez-la sur un tube de centrifugeuse de 15 mL.</li>
	<li>Ajoutez 1 mL de tampon de chargement dans la colonne et poussez le piston vers le bas de la colonne pour débusquer les cellules marquées magnétiquement. Répétez cette étape trois fois pour collecter complètement les cellules marquées magnétiquement.</li>
</ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGinhoux%2C+F+%22Science%22">Science</a>. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).</li>
<li>Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+C+%22Science%22">Science</a>. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaolicelli%2C+RC+%22Science%22">Science</a>. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li>
<li>Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+microglial+subset+in+development%2C+aging%2C+and+disease%3A+Lessons+from+transcriptomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).</li>
<li>Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Neuroscience+and+Oxidative+Stress%22%5BJournal%5D)">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fbrain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+the+brain%3A+Complementary+partners+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).</li>
<li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li>
<li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP%28%2B%29-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).</li>
<li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+%26+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).</li>
</ol>

Les auteurs ont déclaré qu’il n’existait pas d’intérêts concurrents.

Le protocole propose une méthode pour isoler la microglie autour des lésions démyélinisantes, ce qui peut aider à étudier les caractéristiques fonctionnelles de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes. Les microglies capturées à l’aide de billes CD11b présentent une pureté et une viabilité élevées. Les étapes critiques du protocole comprennent la localisation précise des foyers et la purification microgliale optimale. Dans l’étape de protocole 2.1, il est nécessaire d’injecter la solution NR 2 h ava...

Les microglies proviennent de progéniteurs du sac vitellin, qui atteignent très tôt le cerveau embryonnaire et participent au développement du SNC 1,2. Par exemple, ils sont impliqués dans l’élagage synaptique3 et la régulation de la croissance axonale4. Ils sécrètent des facteurs qui favorisent la survie neuronale et aident à la localisation neuronale5. Dans le même temps, ils sont impliqués dans l’élimination des cellules anormales et des cellules apoptotiques pour assurer le développement normal du cerveau6. En outre, en tant que cellules immunocompétentes du cerveau, les microglies surveillent continuellement le parenchyme cérébral pour éliminer les cellules mortes, les synapses dysfonctionnelles et les débris cellulaires7. Il a été démontré que l’activation microgliale joue un rôle important dans une variété de maladies, y compris les maladies inflammatoires démyélinisantes, les maladies neurodégénératives et les tumeurs cérébrales. Les microglies activées dans la sclérose en plaques (SEP) contribuent à la différenciation des cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) et à la régénération de la myéline en engloutissant les débris de myéline8.
Dans la maladie d’Alzheimer (MA), l’accumulation de bêta-amyloïde (Aβ) active la microglie, ce qui affecte les fonctions phagocytaires et inflammatoires de la microglie9. La microglie activée dans le tissu du gliome, appelée microglie associée au gliome (GAM), peut réguler la progression du gliome et finalement affecter le pronostic des patients10. L’activation modifie profondément le transcriptome microglial, entraînant des changements morphologiques, l’expression des récepteurs immunitaires, une augmentation de l’activité phagocytaire et une augmentation de la sécrétion de cytokines11. Il existe différents sous-ensembles de microglies activées dans les maladies neurodégénératives telles que la microglie associée à la maladie (DAM), la microglie à réponse activée (ARM) et le phénotype neurodégénératif microglial (MGnD)8.
De même, de multiples sous-ensembles fonctionnels dynamiques de microglies coexistent également dans le cerveau dans les maladies inflammatoires démyélinisantes12. Comprendre l’hétérogénéité entre différents sous-ensembles de microglies est essentiel pour étudier la pathogenèse des maladies inflammatoires démyélinisantes et trouver leurs stratégies thérapeutiques potentielles. L’hétérogénéité de la microglie dépend principalement de la spécificité moléculaire8. Il est essentiel de décrire avec précision les altérations moléculaires de la microglie pour l’étude de l’hétérogénéité. Les progrès de la technologie du séquençage de l’ARN unicellulaire (séquençage de l’ARN) ont permis d’identifier les caractéristiques moléculaires de la microglie activée dans des conditions pathologiques13. Par conséquent, la capacité d’isoler les populations cellulaires est essentielle pour une étude plus approfondie de ces cellules cibles dans des conditions spécifiques.
Les études effectuées pour comprendre les caractéristiques et les fonctions de la microglie sont généralement des études in vitro, car il a été constaté qu’un grand nombre de microglies primaires peuvent être préparées et cultivées à partir de cerveaux de chiots de souris (âgés de 1 à 3 jours), qui se fixent aux flacons de culture et se développent à la surface du plastique avec d’autres cellules gliales mélangées. Par la suite, la microglie pure peut être isolée en fonction de l’adhérence différente des cellules gliales mélangées14,15. Cependant, cette méthode ne peut isoler que la microglie du cerveau périnatal et prend plusieurs semaines. Les variables potentielles en culture cellulaire peuvent influencer les caractéristiques microgliales telles que l’expression moléculaire16. De plus, la microglie isolée par ces méthodes ne peut participer à des expériences in vitro qu’en simulant les conditions des maladies du SNC et ne peut pas représenter les caractéristiques et les fonctions de la microglie dans les états pathologiques in vivo. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes pour isoler la microglie du cerveau de la souris adulte.
Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et la séparation magnétique sont deux méthodes largement utilisées, bien qu’elles aient leurs propres limites 16,17,18,19. Leurs avantages et inconvénients respectifs seront mis en contraste dans la section de discussion. La maturation de la technologie MACS offre la possibilité de purifier rapidement les cellules. Huang et al. ont développé une méthode pratique pour étiqueter les lésions démyélinisantes dans le cerveau20. En combinant ces deux approches techniques, nous proposons un protocole de séparation magnétique cylindrique CD11b rapide et efficace, fournissant une description étape par étape pour isoler la microglie autour des lésions démyélinisantes dans le cerveau de souris adultes et préserver les caractéristiques moléculaires de la microglie. Les lésions démyélinisantes focales ont été causées par l’injection stéréotaxique de 2 μL de solution de lysolécithine (1% LPC dans 0,9% de NaCl) dans le corps calleux 3 jours avant le début du protocole21. Ce protocole jette les bases pour effectuer l’étape suivante dans les expériences in vitro. De plus, ce protocole permet de gagner du temps et reste réalisable pour une utilisation généralisée dans diverses expériences.

<table><tbody><tr><td>Tubes à centrifuger CFT001015 1,5 mL Tubes</td> à <td></td> centrifuger <td>BIOFIL</td> CFT011150 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro ; m Filter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociation cérébrale adulte, souris et rat</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-107-677</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Souris</td><td>SJA Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglie) Perles, humaines et souris</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>BOSTER</td><td>PYG0001</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Biosciences</td><td>V10</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Rouge neutre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1013690025</td><td></td></tr><tr><td>NovoCyte Cytomètre en flux</td><td>Agilent</td><td></td><td>Un système composé de de diverses pièces</td></tr><tr><td>NovoExpress</td><td>Agilent</td><td>1.4.1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>MshOt</td><td>MZ62</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Les microglies, les cellules immunitaires innées résidentes dans le cerveau, sont les principaux répondeurs à l’inflammation ou aux blessures du système nerveux central (SNC). La microglie peut être divisée en état de repos et en état activé et peut rapidement changer d’état en réponse au microenvironnement du cerveau. La microglie sera activée dans différentes conditions pathologiques et présentera différents phénotypes. En outre, il existe de nombreux sous-groupes différents de microglies activées et une grande hétérogénéité entre différents sous-groupes. L’hétérogénéité dépend principalement de la spécificité moléculaire de la microglie. Des études ont révélé que la microglie sera activée et jouera un rôle important dans le processus pathologique de démyélinisation inflammatoire. Pour mieux comprendre les caractéristiques de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes telles que la sclérose en plaques et le trouble du spectre de la neuromyélite optique, nous proposons un protocole de tri microglial primaire périlésionnel. Ce protocole utilise le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne (MACS) pour obtenir une microglie primaire hautement purifiée et préserver les caractéristiques moléculaires de la microglie afin d’étudier les effets potentiels de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes.

Les microglies isolées à l’aide de billes CD11b ont une grande pureté Les cellules microgliales autour des lésions dans les modèles murins de démyélinisation ont été isolées à l’aide du protocole mentionné ci-dessus et testées par cytométrie en flux. Les cellules sont marquées par fluorescence avec de l’isothiocyanate de fluorescéine CD11b (FITC) et de l’allophycocyanine CD45 (APC) pour déterminer la microglie dans la cytométrie en flux conformément aux instructions du fabricant. Il existe de nombreus...

Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.

Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Ce protocole aide à isoler la microglie des lésions de démyélinisation microdisséquées du cerveau de la souris adulte pour étudier les caractéristiques microgliales in vivo. Cette technique permet de gagner du temps et d’avoir des exigences plus faibles pour les expérimentateurs et les équipements. Cette méthode aide à isoler les microglies du cerveau de l’animal, en particulier les tissus microdisséqués dans divers états pathologiques.Commencez par microdisséquer les lésions marquées par un colorant neutre autour du corps calleux sous un stéréomicroscope. Centrifuger le tissu disséqué à 300 fois g pendant 30 secondes pour prélever l’échantillon au fond du tube. Préchauffer le mélange d’enzymes un et le mélange d’enzymes deux à 37 degrés Celsius dans un incubateur.Ensuite, ajoutez 1 950 microlitres de mélange d’enzymes préchauffé un à un échantillon et digérez dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter 30 microlitres d’enzymes préchauffées mélanger deux, et mélanger doucement. Après la digestion, ajoutez quatre millilitres de PBS froid au tube et secouez doucement.Centrifuger les échantillons de tissu à 300 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le surnageant lentement et complètement. Remettez en suspension doucement la pastille de cellule avec 1 550 microlitres de PBS froid. Ajouter 450 microlitres de la solution froide pour l’élimination des débris et bien les mélanger.Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour superposer le mélange très lentement et doucement avec deux millilitres de PBS froid. Centrifugez le mélange, puis recherchez les trois couches. Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour aspirer complètement les deux couches supérieures et remplissez le tube jusqu’à cinq millilitres avec un tampon de chargement à froid.Inverser doucement le tube trois fois. Ensuite, après centrifugation et aspiration du surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule avec 90 microlitres de tampon de chargement et ajoutez 10 microlitres de billes CD11b. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Après l’incubation, ajoutez un millilitre du tampon de chargement et lavez les cellules en pipetant doucement le liquide de haut en bas avec une pipette de 1 000 microlitres. Centrifuger les cellules à 300 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et aspirer complètement le surnageant pour éliminer les billes non liées. Remettez en suspension les cellules dans 500 microlitres du tampon de chargement et placez la colonne MS avec son séparateur pour une sélection positive dans le champ magnétique.Rincez la colonne avec 500 microlitres du tampon de chargement pour protéger les cellules et assurer l’efficacité du tri magnétique basé sur le protocole du fabricant. Appliquez la suspension de cellule sur la colonne MS et jetez le flux contenant les cellules non étiquetées. Ajoutez 500 microlitres du tampon de chargement pour laver la colonne et retirez-la du séparateur.Placez la colonne sur un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et ajoutez un millilitre du tampon de chargement dans la colonne. Enfin, poussez le piston vers le bas de la colonne pour débusquer les cellules marquées magnétiquement. Une représentation schématique de la stratégie de contrôle utilisée dans l’analyse par cytométrie en flux de microglies isolées des lésions de démyélinisation de souris adultes avant et après le tri cellulaire activé magnétiquement est présentée ici.Les images graphiques représentent la hauteur de diffusion vers l’avant et la hauteur de dispersion latérale pour la sélection des cellules, la zone de dispersion vers l’avant et la hauteur de dispersion vers l’avant pour la sélection de cellules uniques, et CD11b-FITC et CD45-APC pour sélectionner les cellules myéloïdes et la microglie. La proportion de microglies a considérablement augmenté après le tri des cellules activées magnétiquement. L’image graphique représente la stratégie de contrôle utilisée dans l’analyse de cytométrie en flux pour les cellules individuelles vivantes et mortes après le tri des cellules activées magnétiquement.Ici, la 7-aminoactinomycine D et la hauteur de dispersion latérale ont été utilisées pour sélectionner les cellules vivantes. Lors de cette tentative, n’oubliez pas de microdisséquer avec précision les lésions démyélinisantes sous un stéréomicroscope en fonction des marques rouges neutres.

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Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules CD11b, y compris la microglie, du cerveau des petits de souris en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement. Les tissus cérébraux sont homogénéisés pour obtenir des suspensions unicellulaires, qui sont incubées avec des microbilles enrobées d’anticorps anti-CD11b, suivies d’une séparation sur colonne magnétique pour purifier la population de cellules CD11b+.

Isolement magnétique de la microglie à partir du cerveau d’un bébé souris

Cette vidéo présente une méthode permettant d’isoler des cellules oligodendrocytaires primaires à partir d’une suspension de cellules neurales obtenue à partir d’un bébé souris en utilisant la séparation magnétique. La technique utilise des billes magnétiques recouvertes d’anticorps spécifiques aux antigènes des oligodendrocytes, permettant l’isolement sélectif de ces cellules.

Isolement d’oligodendrocytes primaires murins à l’aide de billes immunomagnétiques

Cette vidéo présente un protocole d’extraction de cellules microgliales à partir de lésions démyélinisantes dans le cerveau de souris à l’aide du tri cellulaire magnétique. Le protocole consiste à disséquer le tissu cérébral lésé contenant des cellules microgliales, à traiter le tissu avec des enzymes spécifiques pour obtenir une suspension unicellulaire et à utiliser des billes magnétiques spécifiques des récepteurs microgliaux pour isoler les cellules microgliales.

Isolement de la microglie à partir de lésions démyélinisantes du cerveau de souris à l’aide du tri cellulaire activé par magnétoscopie

Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.

Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.

La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Nous décrivons l’isolement immunomagnetic des oligodendrocytes principal de la souris, qui permet d’isoler des cellules in vitro culture rapide et spécifique.

Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.

Isolement magnétique de cellules microgliales de souris nouveau-née pour des cultures de cellules primaires

Nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules microgliales de l’hypothalamus de souris (ou de petites structures cérébrales équivalentes) en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), dans un délai relativement court. La microglie hypothalamique triée par MACS peut être utilisée pour l’analyse ex vivo et peut être utilisée pour effectuer des essais in vitro .

Isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme  

Nous avons créé des souris modèles de la leucomalacie périventriculaire (PVL), la lésion cérébrale prédominante chez les prématurés caractérisée par des lésions de la substance blanche périventriculaire. L'hypoxie / ischémie avec / sans infection systémique sont les principales causes de PVL. Unilatérale ligature carotidienne et l'exposition hypoxie avec / sans injection de lipopolysaccharide crée PVL lésions semblables chez les souris P6.

Les modèles murins de la leucomalacie périventriculaire

Découvrez l'isolement de microglie primaire par tri cellulaire magnétique dans des modèles de démyélinisation chez la souris. Cette méthode optimise l'étude des caractéristiques microgliales in vivo avec une meilleure efficacité.

Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation (Vidéo) | JoVE Journal

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