Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation
5 avril 2022
Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.
Ce protocole aide à isoler la microglie des lésions de démyélinisation microdisséquées du cerveau de la souris adulte pour étudier les caractéristiques microgliales in vivo. Cette technique permet de gagner du temps et d’avoir des exigences plus faibles pour les expérimentateurs et les équipements. Cette méthode aide à isoler les microglies du cerveau de l’animal, en particulier les tissus microdisséqués dans divers états pathologiques.
Commencez par microdisséquer les lésions marquées par un colorant neutre autour du corps calleux sous un stéréomicroscope. Centrifuger le tissu disséqué à 300 fois g pendant 30 secondes pour prélever l’échantillon au fond du tube. Préchauffer le mélange d’enzymes un et le mélange d’enzymes deux à 37 degrés Celsius dans un incubateur.
Ensuite, ajoutez 1 950 microlitres de mélange d’enzymes préchauffé un à un échantillon et digérez dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter 30 microlitres d’enzymes préchauffées mélanger deux, et mélanger doucement. Après la digestion, ajoutez quatre millilitres de PBS froid au tube et secouez doucement.
Centrifuger les échantillons de tissu à 300 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le surnageant lentement et complètement. Remettez en suspension doucement la pastille de cellule avec 1 550 microlitres de PBS froid. Ajouter 450 microlitres de la solution froide pour l’élimination des débris et bien les mélanger.
Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour superposer le mélange très lentement et doucement avec deux millilitres de PBS froid. Centrifugez le mélange, puis recherchez les trois couches. Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour aspirer complètement les deux couches supérieures et remplissez le tube jusqu’à cinq millilitres avec un tampon de chargement à froid.
Inverser doucement le tube trois fois. Ensuite, après centrifugation et aspiration du surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule avec 90 microlitres de tampon de chargement et ajoutez 10 microlitres de billes CD11b. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Après l’incubation, ajoutez un millilitre du tampon de chargement et lavez les cellules en pipetant doucement le liquide de haut en bas avec une pipette de 1 000 microlitres. Centrifuger les cellules à 300 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et aspirer complètement le surnageant pour éliminer les billes non liées. Remettez en suspension les cellules dans 500 microlitres du tampon de chargement et placez la colonne MS avec son séparateur pour une sélection positive dans le champ magnétique.
Rincez la colonne avec 500 microlitres du tampon de chargement pour protéger les cellules et assurer l’efficacité du tri magnétique basé sur le protocole du fabricant. Appliquez la suspension de cellule sur la colonne MS et jetez le flux contenant les cellules non étiquetées. Ajoutez 500 microlitres du tampon de chargement pour laver la colonne et retirez-la du séparateur.
Placez la colonne sur un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et ajoutez un millilitre du tampon de chargement dans la colonne. Enfin, poussez le piston vers le bas de la colonne pour débusquer les cellules marquées magnétiquement. Une représentation schématique de la stratégie de contrôle utilisée dans l’analyse par cytométrie en flux de microglies isolées des lésions de démyélinisation de souris adultes avant et après le tri cellulaire activé magnétiquement est présentée ici.
Les images graphiques représentent la hauteur de diffusion vers l’avant et la hauteur de dispersion latérale pour la sélection des cellules, la zone de dispersion vers l’avant et la hauteur de dispersion vers l’avant pour la sélection de cellules uniques, et CD11b-FITC et CD45-APC pour sélectionner les cellules myéloïdes et la microglie. La proportion de microglies a considérablement augmenté après le tri des cellules activées magnétiquement. L’image graphique représente la stratégie de contrôle utilisée dans l’analyse de cytométrie en flux pour les cellules individuelles vivantes et mortes après le tri des cellules activées magnétiquement.
Ici, la 7-aminoactinomycine D et la hauteur de dispersion latérale ont été utilisées pour sélectionner les cellules vivantes. Lors de cette tentative, n’oubliez pas de microdisséquer avec précision les lésions démyélinisantes sous un stéréomicroscope en fonction des marques rouges neutres.
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Aperçu
Cette étude présente un protocole pour isoler et purifier les microglies primaires à partir des lésions de démyélinisation dans les cerveaux de souris adultes. En utilisant le tri cellulaire magnétique activé en colonne, la méthode facilite l'étude des caractéristiques microgliales in vivo tout en optimisant les exigences en termes de temps et de ressources.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Neuropathologie
Contexte
- Les microglia jouent des rôles critiques dans la neuroinflammation et les maladies du système nerveux central.
- Comprendre leur fonction dans les conditions démyélinisantes est essentiel pour comprendre les mécanismes de la maladie.
- Des techniques d'isolement efficaces sont nécessaires pour étudier les microglia caractérisés par des états pathologiques spécifiques.
- La méthode présentée se concentre sur l'amélioration de l'efficacité dans l'isolement de ces cellules.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole fiable pour l'isolement des microglia à partir des zones ciblées du cerveau.
- Faciliter l'étude du comportement des microglia et de leurs rôles dans le contexte des maladies démyélinisantes.
- Optimiser l'utilisation des ressources pendant le processus d'isolement.
Méthodes utilisées
- Microdissection des tissus des lésions de démyélinisation sous un stéréomicroscope.
- Utilisation du tri cellulaire magnétique activé en colonne pour l'isolement des microglia.
- Les étapes comprennent la digestion des tissus, la centrifugation et la remise en suspension douce pour une isolation efficace des cellules.
- Les étapes clés impliquent la préparation des enzymes, plusieurs séquences de centrifugation et une manipulation soigneuse des échantillons microgliaux.
Résultats principaux
- Le protocole améliore significativement la proportion de microglia isolés.
- L'analyse par cytométrie en flux a démontré un tri réussi des cellules myéloïdes et l'identification spécifique des microglia.
- Un marquage vivant-mort a été réalisé pour évaluer la viabilité cellulaire et confirmer le tri réussi.
- La méthode permet une compréhension plus complète des réponses microgliales dans les conditions démyélinisantes.
Conclusions
- Cette étude démontre une méthode efficace pour isoler les microglia, facilitant la recherche future sur leur rôle dans les maladies neurologiques.
- La technique d'isolement contribue à faire progresser les connaissances sur le comportement microglial in vivo, la rendant applicable à divers modèles de maladies.
- Ce protocole peut améliorer les études visant des interventions thérapeutiques ciblant la fonction microgliale dans les maladies neurodégénératives.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary microglia from demyelinated mouse brain tissue enables precise investigation of innate immune responses in disease-relevant CNS models. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neuroinflammatory and demyelinating disease pipelines. High-purity microglial preparations facilitate translational continuity from discovery through preclinical research in neuroimmunology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglial activation states and phenotypic heterogeneity in disease-relevant CNS tissue.
- Supports functional target validation by preserving molecular characteristics of microglia from pathological lesions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory targets by isolating primary cells from in vivo models.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for downstream functional assays and compound screening.
- Improves assay reproducibility and standardization by delivering high-purity, viable cell populations.
- Enables quantitative flow cytometry readouts for cell identity and viability, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery in demyelinating conditions.
- Maintains continuity from in vivo discovery to preclinical validation by preserving microglial molecular profiles.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling direct study of microglial responses in pathological CNS environments.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neuroinflammatory and demyelinating disease research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and heterogeneity in CNS lesions.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity microglia for functional and phenotypic assays.
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry analysis of cell identity, viability, and population shifts.
- Translational Research: Preserves disease-relevant molecular features for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for isolating primary CNS immune cells across models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines cell isolation with lower equipment and expertise requirements.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by enabling direct study of primary microglia from disease models.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk and supports risk-adjusted prioritization in neuroinflammation pipelines.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microdissection and handling of CNS tissue under a stereomicroscope.
- Needs access to magnetic-activated cell sorting instrumentation and flow cytometry for validation.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different CNS regions or disease models to maintain cell purity and viability.
- Careful lesion identification and sample handling are critical to preserve molecular characteristics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Mice Dissection and Tissue Dissociation
1:35
Debris Removal and Magnetic Separation of Microglial Cells
3:26
Results: Gating Strategy Used in Flow Cytometry Analysis Before and After MACS and Gating Strategy for Living/Dead Single Cells After MACS
4:27
Conclusion
