Détection et capture en temps réel de sous-populations cellulaires invasives provenant de co-cultures

Cette technique permet d’identifier les cellules ayant différentes capacités invasives sous l’influence de facteurs sécrétés par des cellules stromales co-cultivées. La technique évalue l’impact des facteurs sécrétés par les cellules stromales ou immunitaires co-cultivées sur l’invasion cellulaire. Il permet également la récupération et l’analyse de sous-populations cellulaires invasives présentes dans des mélanges cellulaires hétérogènes.

La technique peut déterminer quelles tumeurs abritent des sous-populations cellulaires invasives qui conduisent à des métastases. La capture et l’analyse des cellules cancéreuses invasives peuvent éclairer les décisions thérapeutiques. Pour commencer la culture cellulaire, lavez les cultures cellulaires d’adhérence ayant une confluence d’environ 70% avec une solution saline tamponnée au phosphate 1X.

Ajoutez ensuite 0,05% de trypsine et une solution d’EDTA pour décoller les cellules. Neutraliser la solution de trypsine avec des milieux de culture cellulaire contenant du sérum et compter les cellules à l’aide d’une aliquote de la suspension cellulaire. Placez les trois chambres stériles dans la hotte de culture tissulaire.

Placez le bouton sur le côté court de la chambre inférieure et orientez la chambre inférieure de sorte que le bouton soit orienté vers l’expérimentateur. Ajouter 30 000 à 50 000 cellules dans 90 microlitres de milieu à chaque puits à partir de la chambre inférieure sans former de bulles. Utiliser 5 % des milieux supplémentés en sérum bovin fœtal dans deux chambres inférieures comme témoin positif de la motilité cellulaire, et utiliser 0 % des milieux supplémentés sériques comme témoin négatif.

Faites pivoter la chambre inférieure à 90 degrés après l’avoir laissée reposer pendant 10 à 15 minutes dans le capot. Placez ensuite la chambre du milieu sur le dessus afin que le bouton de la chambre inférieure glisse dans l’encoche de la chambre du milieu. Poussez la chambre verticalement vers le bas jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre de chacun des côtés longs de l’assemblage.

Ajouter 160 microlitres de milieux sans sérum à tous les puits de la chambre moyenne. Assurez-vous qu’un ménisque en forme de dôme est visible après le remplissage des puits et placez la chambre supérieure avec des électrodes tournées vers le bas sur la chambre du milieu pour aligner les points bleus sur les chambres du milieu et du haut. Poussez la chambre verticalement vers le bas jusqu’à ce qu’un cliquetis se fasse entendre de chacun des côtés longs de l’assemblage.

Ajouter 20 à 50 microlitres de milieux sans sérum dans la chambre supérieure. Montez l’assemblage sur l’analyseur de cellules à double usage dans l’incubateur de culture tissulaire et attendez 30 minutes avant de mesurer l’arrière-plan. Ouvrez le logiciel d’analyse de cellule, puis sélectionnez le berceau à utiliser, suivi d’un clic sur l’onglet de message, et assurez-vous qu’il indique Connexions correctes « pour vous assurer que le réseau est bien placé dans le berceau et que les électrodes sont bien alignées avec les capteurs.

Cliquez sur l’onglet notes de l’expérience et remplissez toutes les informations possibles sur l’expérience. Cliquez ensuite sur l’onglet mise en page et remplissez la description de la mise en page du tableau. Cliquez ensuite sur l’onglet Planification et ajoutez deux étapes dans le menu des étapes, une étape d’arrière-plan avec un balayage et une étape de test avec 100 balayages.

Une fois que la matrice est dans l’incubateur de l’analyseur de cellules à double usage depuis 30 minutes, cliquez sur le bouton de lecture pour démarrer la mesure en arrière-plan. Une fois la mesure de fond effectuée, retirez le réseau du berceau et replacez-le dans la hotte de culture cellulaire. Ajoutez ensuite 30 000 à 50 000 cellules dans 100 microlitres de milieux sans sérum à chaque puits de la chambre supérieure.

Ce sont les cellules que l’électrode détectera une fois qu’elles migreront avec succès à travers la membrane. Laissez l’ensemble reposer dans le capot pendant 30 minutes avant de le monter sur l’analyseur de cellules à double usage pour la mesure de l’impédance. Replacez le tableau dans l’analyseur de cellules à double usage et vérifiez l’onglet du message pour le message Connections okay"message.

Cliquez sur le bouton de lecture pour lancer la mesure de l’impédance, puis cliquez sur l’onglet Tracé pour surveiller la progression du signal. Si le point de terminaison est atteint avant 25 heures, cliquez sur l’étape d’abandon dans le menu déroulant d’exécution. Pour exporter des données, cliquez avec le bouton droit sur le graphique, choisissez Copier dans le format de liste, puis collez les données dans une feuille de calcul.

Surveillez le taux de migration en temps réel sur l’analyseur de cellules à double usage pour déterminer le point d’arrêt d’intérêt. Une fois réalisé, démontez l’ensemble de l’analyseur de cellules à double usage et placez-le dans la hotte de culture tissulaire. Préparez un nombre approprié de tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour prélever les cellules dans les puits d’intérêt.

Placez l’assemblage dans un plat de 10 centimètres pour contenir des liquides lorsque les chambres se détachent. Poussez les extrémités flexibles du côté long de la chambre du milieu vers l’intérieur jusqu’à ce qu’un bruit de clic se fasse entendre, puis démontez la chambre supérieure et inversez-la dans un nouveau plat de 10 centimètres. Utilisez un élévateur de cellules avec une lame de 13 millimètres pour collecter les cellules de tous les puits abritant la même condition expérimentale.

Rincez ou trempez la lame dans une solution saline tamponnée au phosphate 1X pour recueillir les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, faites tourner les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes et propagez ces cellules collectées ou effectuez une analyse des paramètres tels que le séquençage de l’ARN unicellulaire. L’évaluation de l’invasion des cellules en présence ou en l’absence de cellules stromales a montré que l’invasion cellulaire MDA-MB-231 était renforcée lorsque la souche J2 de fibroblastes Swiss-3T3 irradiés était assise dans la chambre inférieure pour l’échange de facteurs entre les deux lignées cellulaires.

Fait intéressant, l’invasion MDA-MB-231 a augmenté lorsque le nombre de cellules 3T3 J2 a été doublé. D’autre part, le taux d’invasion d’un clone invasif de cellules MCFDCIS, DCIS-Delta Four, semble être inhibé par la diaphonie avec les cellules 3T3 J2, suggérant l’application précieuse du réseau de trois chambres pour mesurer les effets variables du stroma. Dans ce cas, les fibroblastes sur l’invasion cellulaire.

Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine étaient plus invasives en réponse aux facteurs sécrétés par les cellules MDA-MB-231, contrairement à celles sécrétées par les cellules DCIS, ce qui est cohérent avec la capacité des tumeurs invasives à recruter des cellules endothéliales pour la formation des vaisseaux sanguins et leur dissémination ultérieure dans la circulation. L’invasion de cellules xénogreffes dérivées de patients à partir de la chambre supérieure a augmenté en réponse aux cellules immunitaires de la moelle osseuse humaine co-cultivées. Fait intéressant, la présence de 2% de sérum dans la chambre inférieure avec les cellules immunitaires de la moelle osseuse humaine était essentielle pour l’invasion des xénogreffes dérivées des patients.

Les puits peuvent être recouverts d’une matrice extracellulaire pour imiter la barrière de la membrane basale. Des agents thérapeutiques peuvent être ajoutés aux milieux dans les puits pour surveiller leur effet sur l’invasion.