Microdissection en couche des feuillets de valve tricuspide pour la caractérisation mécanique biaxiale et la quantification microstructurale

Cette méthode peut isoler les contributions des couches tissulaires au comportement global des tissus, fournissant ainsi de nouvelles informations sur la microstructure tissulaire. Notre cadre de microdissection et de test nous permet de comparer directement les propriétés mécaniques et microstructurales des feuillets valvulaires cardiaques à leurs propres couches composites. La microdissection peut être difficile à maîtriser, il est donc fortement recommandé de pratiquer autant que possible avant de lancer votre étude.

Tout d’abord, rassemblez les matériaux requis, planche de cire, eau DI, pipette, scalpel, micro ciseaux, pinces minces, pinces incurvées, pinces épaisses et épingles. Démontez le tissu du testeur biaxial et mesurez son épaisseur à l’aide du capteur de déplacement laser. Placez le tissu sur le panneau de cire.

Examinez le côté ventriculaire du tissu pour les grandes insertions de chorda. Prenez une photo pour référence. Étalez le tissu à plat sur la planche de cire avec l’atriaalis vers le haut.

Pour fixer le tissu à la planche, placez une broche inclinée loin du tissu dans chaque coin afin qu’il tire légèrement le tissu tendu. Assurez-vous que les broches sont à l’extérieur des trous créés par les tiges lors du montage du tissu et que le tissu est carré et ne se déplace pas pendant la microdissection de la couche. Si nécessaire, placez des épingles le long du côté du tissu pendant la dissection pour étirer davantage le tissu.

Retirez les marqueurs fiduciaires des billes de verre. Placez l’eau DI sur la surface du tissu avec une pipette de sorte qu’elle recouvre complètement le tissu d’une manière semblable à une bulle. Pour faire le coin initial, sélectionnez un coin du spécimen épinglé, en évitant les grandes insertions de chorda dans les zones fragiles.

Ensuite, coupez la couche A / S en faisant légèrement glisser le scalpel sur la surface du tissu le long des trous de montage pour les tests mécaniques. Les bords de la coupe commencent à se séparer, révélant la couche F/V en dessous. Avec des pinces minces et émoussées, frottez fermement le long de la coupe pour séparer davantage ses bords.

Si la coupe dans la couche A / S ne commence pas à se séparer, tracez légèrement la même coupe à nouveau avec un scalpel. Faites une deuxième coupe perpendiculaire à la première coupe. Si les deux coupes ne sont pas connectées, passez la pince à épiler fine sous la petite zone de tissu séparant les deux coupes.

Ensuite, utilisez soigneusement les ciseaux pour couper le tissu. Frottez le long des coupes du coin avec une pince mince jusqu’à ce que le tissu se sépare de la couche F / V. Dès qu’un petit morceau de tissu est séparé, saisissez-le avec la grande pince à épiler et tirez-le doucement pour séparer davantage les couches composites.

Continuez à peler le tissu tout en le saisissant avec une pince à épiler plus grande pour éviter les déchirures et les déchirures indésirables de la couche composite A / S, et frottez la couture jusqu’à ce qu’elle atteigne la fin des deux coupes faites pour le coin. Si le premier virage présente des problèmes majeurs de séparation, essayez un autre coin comme point de départ. Ensuite, pour faire un deuxième coin, étendez les deux coupes faites pour le premier coin en plaçant la pointe du scalpel au bas de chaque coupe et en la faisant légèrement glisser le long de la surface du tissu afin que les extensions de coupe se connectent aux coupes d’origine et continuent à suivre les trous de tige ou de suture.

Continuez à étendre les coupes et à décoller la couche supérieure composite A / S en arrière tout en frottant la couture jusqu’à ce qu’un côté soit terminé. Observez que le tissu sera entièrement séparé le long d’une coupe. Ensuite, créez un deuxième coin perpendiculaire à l’extrémité du côté entièrement pelé.

Prolongez les coupes restantes tout en évitant les grandes insertions de chorda. Exclure les insertions de chorda de la zone de séparation A/S uniquement lorsque cette exclusion permettra d’obtenir un spécimen A/S suffisamment grand pour les caractérisations expérimentales. Continuez à séparer les couches A/S et F/V en utilisant les techniques de frottement et de traction utilisées pour le premier virage.

Arrêtez immédiatement de séparer le tissu si une déchirure ou un trou se forme. Pour éviter que la pince à épiler ne se coince, placez les ciseaux dans n’importe quel trou qui se forme et coupez le tissu loin du centre. Si le défaut se forme le long de la couture de séparation, commencez à séparer le tissu le long d’un autre bord.

Recherchez les connexions intercalaires qui peuvent apparaître lors de la séparation du tissu et empêchez toute séparation ultérieure des tissus. Observez que ce sont des brins minces mais solides qui doivent être soigneusement coupés à l’aide de ciseaux. Évitez de créer un trou dans la couche A/S ou de couper vers le bas dans la couche F/V.

Poursuivez ce processus jusqu’à ce que le plus grand échantillon possible de la couche A/S ait été séparé. Marquez l’orientation de l’échantillon à l’aide du stylo chirurgical. Enfin, coupez le long de la couture de séparation pour le bord de tissu restant avec les ciseaux.

Placez la couche composite A/S séparée à plat sur le tapis de coupe. Si nécessaire, utilisez le scalpel pour redresser les bords du tissu et créer une forme de tissu carrée adaptée aux tests mécaniques biaxiaux. Placez la couche A/S dans de l’eau DI jusqu’à ce qu’elle soit prête à être testée.

Marquez l’orientation de la couche F/V qui reste sur le panneau de cire. Découpez le plus grand carré possible dans la zone où la couche A/S a été retirée. Ensuite, placez-le dans de l’eau DI.

L’analyse histologique de la feuillette intacte et des deux couches disséquées a permis de vérifier si le tissu était correctement séparé le long de la frontière entre la spongiose et la fibrose. Les micrographies histologiques ont été utilisées pour déterminer l’épaisseur de la couche tissulaire et les fractions massiques constitutives à l’aide du logiciel ImageJ. Les essais mécaniques contrôlés par déplacement et le post-traitement ont produit des données de tension membranaire par rapport à l’étirement de la feuillet antérieur de la valve tricuspide, de la feuillet postérieure de la valve tricuspide et de la feuillet septale de la valve tricuspide, décrivant le comportement mécanique non linéaire du tissu.

Les données d’imagerie du domaine de fréquence spatiale polarisée ont produit des cartes en couleur de l’orientation de la fibre de collagène et du degré d’anisotropie optique. Plus précisément, ces cartes de couleurs ont fourni une compréhension complète de l’architecture des fibres de collagène dans l’ensemble du spécimen de tissu. Il est important de noter que la couche composite rétrécit une fois qu’elle est séparée du tissu épinglé.

Prélever le plus grand échantillon possible pour s’assurer qu’il y a suffisamment de tissu pour les tests ultérieurs.