Amplification d’Escherichia coli dans une puce microfluidique PCR à flux continu et sa détection à l’aide d’un système d’électrophorèse capillaire

Ce protocole décrit comment construire un système de chaîne polymérase à flux continu basé sur la puce microfluidique, et comment construire un système d’électrophorèse capillaire en laboratoire. Il s’agit d’un moyen simple d’analyser les acides nucléiques en laboratoire. La réaction en chaîne par polymérase est une méthode traditionnelle utilisée pour l’amplification du gène cible.

Cependant, la PCR traditionnelle prend beaucoup de temps en raison de l’efficacité de la faible variation de température. Ce travail propose un système de PCR en flux continu basé sur la puce microfluidique. Le temps d’amplification peut être considérablement réduit en faisant passer la solution PCR dans un microcanal placé sur des réchauffeurs réglés à différentes températures.

Comme le CE présente de nombreux avantages, tels qu’une haute résolution, une vitesse élevée et une excellente reproductibilité, il est devenu un outil populaire en laboratoire pour l’analyse des acides nucléiques et des protéines. Cependant, la plupart des laboratoires, en particulier ceux des pays en développement, ne peuvent pas se permettre cette technologie en raison du prix élevé de l’instrument CE. Dans cet article, nous avons décrit les protocoles de fabrication de la puce microfluidique CF-PCR et de construction d’un système CE polyvalent en laboratoire.

Nous démontrons également le processus d’amplification d’Escherichia coli par le système CF-PCR, et la détection des produits PCR par le système CE. En suivant les procédures décrites dans ce protocole, les utilisateurs devraient être en mesure de fabriquer des puces microfluidiques, de préparer une solution de PCR, de construire un système CF-PCR pour l’amplification des acides nucléiques et de mettre en place un système CE simple, même avec des ressources limitées, pour séparer les fragments d’ADN. Chauffez la plaquette de silicium à 200 degrés centigrades pendant 25 minutes pour éliminer l’humidité.

Distribuez un millilitre de résine photosensible SU-8 2075 par pouce de plaquette. Faites-le tourner sur la plaquette de silicium à l’aide d’une machine à enrober à 500 tr/min pendant 5 à 10 secondes avec une accélération de 100 tr/min par seconde, puis à 2 000 tr/min pendant 30 secondes avec une accélération de 500 tr/min par seconde. Faites-le cuire au four à 65 degrés centigrades pendant trois minutes et à 95 degrés centigrades pendant 15 minutes.

Définissez 150 à 215 millijoules par centimètre carré comme énergie d’exposition pour la machine de photolithographie, et gravez le motif conçu sur la résine photosensible avec un masque de photolithographie. Placez la plaquette de silicone et le masque prêts pour l’exposition. Après l’exposition, faites cuire la gaufrette à 65 degrés centigrades pendant deux minutes et à 95 degrés centigrades pendant sept minutes.

Plongez la plaquette de silicium dans la solution de révélateur pour éliminer l’excès de résine photosensible et retirez-la lorsque les microcanaux sont visibles. Utilisez ensuite de l’isopropanol pour rincer la solution de révélateur résiduelle. Mélangez le prépolymère de polydiméthylsiloxane et l’agent de durcissement dans un rapport de 10 à 1.

Versez la solution PDMS mélangée dans le moule de la réplique et solidifiez-la à 80 degrés centigrades pendant 60 minutes. Collez la puce microfluidique PDMS sur une lame après activation à l’aide d’un nettoyeur plasma et solidifiez-les à 80 degrés centigrades pendant 30 minutes dès que possible. Utilisez un mélangeur vortex et une centrifugeuse pour vous assurer que les réactifs sont bien mélangés.

Préparez un tube à centrifuger. Ajoutez d’abord de l’eau dans le tube de la centrifugeuse. Ajoutez ensuite la matrice d’ADN, l’amorce, le tampon, le mélange dNTP, Tween 20, PVP, et enfin ajoutez l’ADN polymérase.

Enfin, mélangez la solution par vortex. Préparez deux radiateurs en céramique PTC, deux relais à semi-conducteurs, deux régulateurs de température, deux capteurs de température et un cordon d’alimentation. Connectez l’appareil de chauffage au relais à semi-conducteurs.

Connectez le relais statique au régulateur de température PID. Fixez ensuite la sonde du capteur de température au bas des deux appareils de chauffage et connectez la borne au régulateur de température PID. Enfin, connectez deux relais statiques en série et branchez le cordon d’alimentation.

Imprimez en 3D une fente pour les deux radiateurs et maintenez les radiateurs sur le même plan. Placez la puce microfluidique sur les deux radiateurs. Préparez un pousse-seringue et une seringue, puis fixez la seringue sur le pousse-seringue.

Connectez un tube en silicone avec une seringue et connectez une aiguille en acier au sommet du tube en silicone. Insérez l’aiguille en acier dans l’entrée de la puce microfluidique. Placez une pointe de pipette à la sortie de la puce pour recueillir les produits PCR.

Utilisez une alimentation haute tension pour générer un champ électrique pulsé. Regardez, il s’agit d’une alimentation haute tension. Il s’agit d’électrodes positives et négatives.

Utilisez une lampe au mercure comme source de lumière et filtrez la longueur d’onde d’excitation de la lampe au mercure à travers un filtre. Placez le capillaire sur la platine du microscope. Collectez l’émission de fluorescence avec l’objectif, puis détectez-la à l’aide d’un tube photomultiplicateur.

C’est notre microscope et c’est notre capillaire. Maintenant, nous allumons la lumière dans des conditions de pièce sombre. La lumière d’excitation est collectée par l’objectif.

Utilisez le logiciel LABVIEW développé en interne pour contrôler l’alimentation électrique et terminer l’acquisition des données. Préréglez la température des réchauffeurs du système CF-PCR à 65 degrés centigrades et 95 degrés centigrades. Placez la puce microfluidique sur les deux blocs chauffants.

Insérez l’embout du tube en silicone dans un tube à centrifuger contenant 50 microlitres de solution PCR. Tirez sur le piston de la seringue pour retirer lentement la solution. Fixez la seringue sur un pousse-seringue.

Insérez l’aiguille en acier dans l’entrée de la puce microfluidique. Réglez le débit de la pompe à 10 microlitres par minute et appuyez sur le bouton de démarrage pour pousser la solution dans le microcanal à l’entrée de la micropuce. Récupérez les produits PCR à la sortie de la puce microfluidique.

Préparez un capillaire de 8 centimètres de longueur totale et de 6 centimètres de longueur effective. Préparez le tampon de séparation en mélangeant 100 microlitres de 1 % HEC, deux microlitres de 100x SYBR Green et 98 microlitres d’eau ultrapure pour obtenir 0,5 % HEC contenant 1x SYBR Green. Remplissez le capillaire avec le tampon de séparation préparé à l’aide d’une pompe à vide.

Entrez la tension d’injection et le temps d’injection sur l’interface logicielle, cliquez sur le bouton de démarrage et attendez que les produits PCR soient introduits électrodynamiquement dans le capillaire. Entrez la tension continue sur l’interface logicielle, cliquez sur le bouton de démarrage et exécutez l’électrophorèse à 100 volts par centimètre d’intensité de champ électrique. Cliquez sur le bouton d’arrêt une fois que tous les fragments d’ADN ont été séparés dans le capillaire.

Rincez le capillaire avec de l’eau stérilisée pendant une minute après chaque passage. Cette image représente l’électrophérogramme des produits PCR et des marqueurs ADN. Nous avons d’abord amplifié le gène cible d’Escherichia coli dans le système CF-PCR, et la solution PCR a pris environ 10 minutes et 30 secondes de l’entrée à la sortie de la puce.

La taille de l’amplicon cible d’Escherichia coli était de 544 pb. Après cela, nous avons analysé les produits de PCR amplifiés dans le système d’électrophorèse capillaire. De plus, nous avons également réalisé l’électrophorèse capillaire d’une échelle d’ADN de 100 pb dans les mêmes conditions expérimentales.

La taille du produit PCR peut être évaluée en fonction de l’électrophérogramme de l’échelle d’ADN. Chaque expérience a été réalisée trois fois pour la reproductibilité. Les données de cette image montrent que le pic correspondant aux produits PCR d’Escherichia coli a été observé après la séparation, et que le temps de migration des produits PCR dans la puce microfluidique était cohérent avec celui d’un thermocycleur.

La PCR et l’EC sont deux biotechnologies populaires dans l’analyse des acides nucléiques. Cet article décrit l’amplification d’Escherichia coli et la détection des produits PCR à l’aide des systèmes CF-PCR et CE, tous deux construits en interne. Le gène cible d’Escherichia coli a été amplifié avec succès en 10 minutes, et les fragments d’ADN inférieurs à 1 500 pb ont été séparés en huit minutes.

De plus, le système CF-PCR basé sur la puce microfluidique et le système CE introduit dans ce travail sont faciles à fabriquer et peuvent offrir un moyen simple pour l’analyse des acides nucléiques en laboratoire. Il ne peut amplifier et détecter qu’un seul échantillon à la fois, ce qui limite son application à grande échelle. Par conséquent, le développement d’un réseau intégré de puces microfluidiques CF-PCR et CE pour la détection à haut débit des agents pathogènes est toujours en cours.