Localisation du facteur unicellulaire sur la chromatine à l’aide d’un clivage d’entrée ultra-faible sous les cibles et libération à l’aide de la nucléase

CUT&RUN est une technique puissante pour déterminer la localisation des protéines sur la chromatine, et nous décrivons ici une version unicellulaire de cette technique dans un format manuel à 96 puits. La plupart des techniques de localisation des protéines, comme ChIP-seq, nécessitent un apport cellulaire élevé et prennent environ trois jours. CUT&RUN, en raison du signal élevé et de l’arrière-plan faible, a été optimisé pour les applications à cellules basses et à cellule unique, et peut être complété en une seule journée.

Nous envisageons que cette technique peut être appliquée à presque tous les échantillons biologiques et peut être particulièrement puissante pour déterminer la localisation des facteurs dans des échantillons rares et de faible abondance, tels que des échantillons de patients précieux. Avant d’effectuer des expériences sur une seule cellule, testez l’anticorps et la technique sur un grand nombre de cellules non précieuses. La principale limite de cette expérience est la dépendance à un anticorps robuste.

Santana Lardo, une spécialiste de recherche expérimentée de mon laboratoire, fait la démonstration de la procédure. Après avoir trié les cellules individuelles et les noyaux de liaison aux billes, placez la plaque de 96 puits sur un rack magnétique de 96 puits et laissez les perles se lier pendant au moins cinq minutes. Ensuite, retirez et jetez le surnageant.

Ajouter 100 microlitres de tampon bloquant aux billes liées au noyau, mélanger avec un pipetage doux et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et laissez le surnageant dégager pendant au moins cinq minutes. Ensuite, retirez et jetez le surnageant sans déranger les perles.

Retirez la plaque du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 100 microlitres de tampon de lavage par réaction avec un pipetage doux. Replacez la plaque sur le rack magnétique à 96 puits, laissez le surnageant dégager, puis retirez et jetez le surnageant. Remettre en suspension les billes dans 25 microlitres de tampon de lavage par réaction avec pipetage doux.

Fabriquer un mélange maître d’anticorps primaires en citant 25 microlitres de tampon de lavage par réaction, puis ajouter 0,5 microlitre d’anticorps par réaction. Ajouter 25,5 microlitres du mélange tampon de lavage d’anticorps, suivi d’un pipetage doux à chaque échantillon traité avec un anticorps ciblant la protéine d’intérêt. Incuber pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, replacez les échantillons sur le rack magnétique à 96 puits. Une fois que le surnageant est clair, retirez-le et jetez-le sans déranger les perles. Après avoir retiré la plaque de la grille magnétique, lavez les billes avec 100 microlitres de tampon de lavage et remettez en suspension par pipetage.

Après avoir replacé la plaque sur un rack magnétique de 96 puits et éliminé le surnageant comme démontré précédemment, remettez en suspension chaque échantillon dans 25 microlitres de tampon de lavage. Faire un mélange maître de protéine A MNase en ajoutant 25 microlitres de tampon de lavage et une quantité optimisée de protéine A MNase par réaction. Ajouter 25 microlitres de mélange maître de protéine A MNase à chaque échantillon, y compris les échantillons témoins.

Incuber les échantillons pendant 30 minutes à température ambiante. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits. Laissez le surnageant dégager pendant au moins cinq minutes, puis retirez et jetez le surnageant sans déranger les perles.

Après avoir retiré la plaque de la grille magnétique, lavez les billes avec 100 microlitres de tampon de lavage et remettez en suspension par pipetage doux. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits et jetez le surnageant comme démontré précédemment. Ensuite, retirez les échantillons du rack magnétique et remettez en suspension les billes dans 50 microlitres de tampon de lavage par pipetage doux.

Équilibrez les échantillons à zéro degré Celsius dans un mélange d’eau glacée pendant cinq minutes, puis retirez les échantillons du bain-marie. Ajouter un microlitre de chlorure de calcium de 100 millimolaires à l’aide d’une pipette multicanal. Bien mélanger trois à cinq fois avec un pipetage doux à l’aide d’une pipette multicanal à grand volume, puis remettre les échantillons à zéro degré Celsius.

Démarrez une minuterie de 10 minutes dès que la plaque est de retour dans le bain-marie. Arrêter la réaction en pipetant 50 microlitres d’une solution contenant deux fois la concentration de RSTOP+ et tampon dans chaque puits dans le même ordre que le chlorure de calcium a été ajouté. Incuber les échantillons pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.

Faites tourner la plaque à 16 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Placez la plaque sur un rack magnétique à 96 puits. Laissez le surnageant s’éclaircir pendant au moins cinq minutes.

Ensuite, transférez les surnageants dans une assiette fraîche de 96 puits et jetez les perles. Pour l’extraction de l’ADN, ajoutez un microlitre de 10% de FDS et 0,83 microlitre de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K à chaque échantillon et mélangez les échantillons par pipetage doux. Incuber les échantillons pendant 10 minutes à 70 degrés Celsius.

Remettre la plaque à température ambiante. Ajouter 46,6 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires et 90 microlitres de PEG4000 à 50 % et mélanger par pipetage doux. Ajouter 33 microlitres de billes de magnétite de polystyrène à chaque échantillon et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.

Placez la plaque sur une grille magnétique et laissez le surnageant dégager pendant environ cinq minutes. Ensuite, jetez soigneusement le surnageant sans déranger les perles. Rincer deux fois avec 150 microlitres d’éthanol à 80% sans déranger les billes.

Faites tourner brièvement la plaque à 1000 fois G pendant 30 secondes. Replacez la plaque sur un rack magnétique de 96 puits et retirez tout l’éthanol résiduel sans perturber les billes. Sécher les échantillons à l’air libre pendant environ deux à cinq minutes.

Remettre en suspension les billes dans 37,5 microlitres de chlorhydrate TRIS de 10 millimolaires de pH 8 et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Replacez la plaque sur une grille magnétique et laissez les perles se lier pendant cinq minutes. Transférer 36,5 microlitres du surnageant sur une plaque fraîche de 96 puits compatible avec le thermocycleur et jeter les perles.

Après avoir effectué une évaluation de la qualité des cellules, l’apparence et le pourcentage des cellules ont été examinés, démontrant que les cellules souches embryonnaires de mauvaise qualité ne devraient pas être utilisées. Le tri unicellulaire a été effectué à l’aide de la coloration Hoechst 33342, et les cellules d’essai ont été comptées pour s’assurer que zéro ou une cellule est trouvée dans chaque puits. L’analyse du gel d’agarose a révélé une échelle de faible poids moléculaire et des bibliothèques individuelles uliCUT&RUN à cellule unique.

L’analyse sous-optimale et optimale de la bibliothèque montre une échelle de faible poids moléculaire, une bibliothèque sous-optimale en raison d’une digestion inefficace des mnésons et une bibliothèque réussie avec une digestion appropriée. La distribution de l’analyseur de fragments montre que la taille attendue d’une seule cellule varie de 150 à 500 paires de bases. Cependant, dans les grandes protéines, l’ADN aura environ 270 paires de bases.

L’occupation des protéines à l’aide d’un navigateur de génome à un seul locus représentant un nombre élevé de cellules ou un contrôle négatif et d’un CTCF unicellulaire uliCUT & RUN a révélé que la cellule unique représentait en grande partie de forts pics, similaires à uliCUT & RUN à haute cellule. Les cartes thermiques du CTCF unicellulaire ou du contrôle négatif ont révélé un modèle clair d’enrichissement en lecture directement sur les sites de liaison CTCF établis dans les cellules. Les cartes thermiques unidimensionnelles montrent une densité de lecture plus élevée sur les sites de liaison CTCF établis dans les bibliothèques unicellulaires par rapport aux régions environnantes et aux témoins sans anticorps, démontrant un enrichissement spécifique des anticorps aux sites de liaison établis.

Il est important d’équilibrer les noyaux liés aux billes sur le bain-marie et de ne pas surchauffer l’échantillon lors de l’ajout de chlorure de calcium pour éviter une digestion excessive de la chromatine.