Name: Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Découvrez une méthode simplifiée pour isoler des cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris. Ce protocole facilite l'étude de la barrière hématorétinienne et des maladies rétiniennes comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge.

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Ce travail a été soutenu par le National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fund R01 EY029751-04

Les animaux ont été utilisés conformément aux directives du protocole animal IACUC numéro 21063 de l’Université d’Oakland et aux directives de la déclaration ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.
1. Préparation de la solution
<ol><li>Préparer le milieu complet de culture cellulaire EPR en complétant le mélange F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco avec 25 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1,5 % de pénicilline/streptomycine et 0,02 % de gentamicine.</li>
	<li>Préparer l’enzyme A en complétant 741 μL de solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) avec 127 μL de solution mère de collagénase et 132 μL de solution mère de hyaluronidase. Cela fait un volume final de 1 mL, qui peut traiter quatre yeux.<ol><li>Préparer la solution mère de collagénase en dissolvant 1 mg de collagénase de Clostridium histolyticum dans 41 mL de HBSS (19,5 unités / mL).</li>
		<li>Préparer la solution mère de Hyaluronidase en dissolvant 1 mg de Hyaluronidase provenant de testicules bovins dans 18,4 mL de HBSS (38 unités/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer l’enzyme B en ajoutant deux parties de trypsine-EDTA à 0,25% à trois parties de HBSS. Notez que le volume total dépend du nombre d’yeux disséqués; On peut avoir recours à 1 mL d’enzyme B pour traiter quatre yeux.</li>
</ol>2. Énucléation
<ol><li>Euthanasier éthiquement la souris par inhalation de dioxyde de carbone (CO2) conformément aux normesIACUC 21.<ol><li>Brièvement, placer le(s) animal(s) dans la chambre CO 2 pour introduire 100% CO 2 avec un taux de remplissage de 30% à 70% du volume de la chambre par minute avec CO 2 pour atteindre l’inconscience dans les2 à 3 minutes, avec une détresse minimale pour les souris.</li>
		<li>Confirmez la mort (manque de respiration et couleur des yeux fanée), puis déplacez la souris de la cage vers une zone chirurgicale stérilisée propre (nettoyée avec de l’alcool) équipée d’un équipement chirurgical stérilisé.</li>
	</ol></li>
	<li>Placez la souris sur un sous-tampon stérile.</li>
	<li>Énucléez les yeux en appuyant sur une pince à épiler de style 5/45 sur la zone orbitale pour induire la proptose, puis en déplaçant la pince à épiler vers l’arrière de l’œil. Extraire les yeux, avec le nerf optique intact, en tirant doucement les yeux de la cavité orbitaire.</li>
	<li>À l’aide d’une pince, immergez les yeux dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant 1 ml de povidone iodée à 5 %. Incuber les yeux à température ambiante pendant 2-3 min.</li>
	<li>Retirez les yeux de la solution de povidone iodée et placez-les dans une boîte de Pétri. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, laver les yeux avec HBSS jusqu’à ce que la couleur orange de la povidone iodée ait disparu. Cela prend environ deux ou trois lavages.</li>
	<li>Placer les yeux dans une nouvelle boîte de Petri de 60 mm et les plonger dans un milieu de culture cellulaire EPR complet à froid (2-8 °C) préparé à l’étape 1.1.</li>
</ol>3. Dissection
<ol><li>Sous un microscope chirurgical, utilisez une pince à épiler de style M5S et des ciseaux Vannas pour enlever le tissu conjonctif et les muscles extraoculaires. REMARQUE : La dissection se fait sous une capuche tissulaire dans un environnement complètement stérile. Cependant, à des fins vidéo, le microscope à dissection a été placé à l’extérieur du capot pour obtenir une démonstration / filmage de meilleure qualité. Placer un petit morceau de papier de soie non pelucheux sous l’œil améliore la stabilité pendant la dissection. Les yeux peuvent ensuite être maintenus temporairement (pas plus de 1 heure) dans le milieu de culture cellulaire EPR froid. Cependant, il est préférable de passer directement à l’étape suivante immédiatement après le nettoyage des yeux.</li>
	<li>Transférer les yeux dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant 1 mL de solution d’enzyme A pour quatre yeux. Ensuite, incuber les yeux dans un incubateur à 37 °C pendant 40 min.</li>
	<li>Retirez les yeux de l’incubateur et du tube microcentrifugeux. Ensuite, transférez-les dans un nouveau tube microcentrifuge contenant 1 mL de solution d’enzyme B pour quatre yeux. Incuber le tube dans un incubateur à 37 °C pendant 50 min.</li>
	<li>Placer les yeux dans une nouvelle boîte de culture en suspension de 60 mm contenant 10 mL de milieu de croissance complet des cellules EPR. Incuber ensuite les yeux à 4 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Placez la capsule sous un microscope chirurgical et commencez à disséquer.</li>
	<li>Enlevez la partie antérieure de l’œil (cornée, iris et cristallin) de la partie postérieure de l’œilleton (rétine postérieure).<ol><li>Saisissez l’œil avec une pince de style M5S et faites une incision dans la section ora serrata (partie la plus antérieure de la rétine où se termine le bleu clair) avec une lame #11 ou l’aiguille d’une seringue.</li>
		<li>Saisissez la partie interne de l’incision avec une paire de pinces et saisissez la cornée avec une autre paire de pinces. Commencez à tirer ou à déchirer lentement la cornée de la rétine. Assurez-vous de déchirer par petits incréments et de descendre la déchirure tout en retirant la cornée, pour vous assurer que l’EPR reste en grande partie intacte et entraîne une déchirure plus propre. REMARQUE: Une fois que la cornée est complètement détachée, l’iris et le cristallin peuvent être vus.</li>
		<li>Séparez la cornée et l’iris.</li>
	</ol></li>
	<li>Séparez la lentille de l’œilleton avec une légère compression de la moitié postérieure de l’œil.</li>
	<li>Pour retirer la rétine neurale de la couche RPE, saisissez la couche externe de l’œilleton avec une paire de pincettes et positionnez le bras d’une deuxième paire de pincettes entre l’EPR et les couches neuronales. De là, tirez ou retirez doucement la rétine neurale de la couche d’EPR. Jetez la rétine neurale. REMARQUE: Dans la vidéo, la rétine neurale et le cristallin sont enlevés ensemble. Cependant, pour les débutants, il sera plus facile de supprimer chacun séparément. Ce qui reste, c’est l’EPR, la choroïde et la sclérotique.</li>
	<li>Jetez la cornée, l’iris, le cristallin et la rétine neurale. Déplacez l’œilleton restant dans une nouvelle zone de l’assiette exempte de débris.</li>
	<li>Pour séparer l’EPR de la choroïde et de la sclérotique, grattez doucement l’intérieur de l’œilleton avec une pince à épiler de style 5/45 pour assurer la séparation des cellules EPR. Les cellules EPR apparaissent troubles lorsqu’elles sont suspendues dans le milieu de croissance complet des cellules EPR.</li>
	<li>Aspirer les cellules à l’aide d’une pipette de transfert stérile de 3,2 mL et transférer dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL contenant un milieu de croissance complet des cellules EPR.</li>
</ol>4. Centrifugation
<ol><li>Placer le tube à centrifuger de 15 mL contenant les cellules EPR primaires à l’intérieur d’une centrifugeuse et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 10 mL de milieu de croissance complet de l’EPR. Le milieu de croissance complet de l’EPR est plus spécifique pour la croissance de l’EPR que d’autres cellules contaminantes, telles que les cellules de Müller ou les cellules endothéliales choroïdiennes. Les cellules de Müller nécessitent un milieu glycémique élevé, tandis que les cellules endothéliales choroïdiennes nécessitent des facteurs de croissance spécifiques. En changeant le milieu et en faisant passer la culture, seules les cellules EPR continueront à croître.</li>
</ol>5. Culture cellulaire
<ol><li>Plaquer les cellules primaires EPR en remise en suspension sur une boîte de Petri stérile de 100 mm et les transférer dans un incubateur (après avoir vérifié la pureté en colorant les cellules avec des marqueurs spécifiques de cellules EPR/Müller, comme indiqué à la figure 1E-N). Incuber les cellules à 37 °C et 5% de CO2. NOTE: Les marqueurs utilisés sont mentionnés dans le tableau des matériaux. Cette étape est effectuée après l’établissement de la culture.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant environ 5 jours pour se développer. Pendant ce temps, ne changez pas le milieu, ne perturbez pas les cellules ou ne déplacez pas la plaque de culture cellulaire (il s’agit d’une étape critique du protocole; après l’isolement, les cellules doivent être incubées et ne pas être perturbées pendant 5 jours). REMARQUE: Le nombre de cellules dépend du nombre d’yeux utilisés pour l’isolement. Un plus grand nombre d’yeux isolés donnera un plus grand nombre de cellules. L’isolement de l’EPR à partir de deux yeux donnera ~ 440 000-880 000 cellules, soit 5% -10% de la boîte de Petri de 100 mm, qui peut contenir 8,8 millions de cellules.</li>
</ol>6. Passage
<ol><li>Aspirer le média et laver avec 2 ml de PBS. Puis aspirez le PBS.</li>
	<li>Ajouter 4 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % (1x), ou assez pour couvrir la base du plat. Incuber pendant 5-10 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 8 mL de milieu RPE préchauffé ou deux fois le volume de la quantité de trypsine utilisée à l’étape 6.2. Ensuite, recueillez les cellules et placez-les dans un tube à centrifuger de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 7 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 10 mL de milieux de culture cellulaire EPR complets. Plaquer la suspension entière dans une boîte de Petri stérile de 100 mm. REMARQUE: Les cellules peuvent être passées jusqu’à quatre ou cinq fois18. Cependant, les résultats d’expérience les plus cohérents se trouvent après deux ou trois passages. Après deux à quatre passages, les cellules ont changé de forme (comme le montre la figure 1D) pour être plus allongées, accumulées au milieu de la plaque, ont cessé de croître et se sont détachées.</li>
	<li>Utiliser des protocoles d’immunofluorescence, selonles méthodes 8,14,15,16 publiées précédemment, pour colorer et valider la spécificité de l’EPR.</li>
</ol>7. Immunofluorescence
NOTE: L’immunofluorescence a été réalisée selon les méthodes 8,14,15,16,17,18 précédemment publiées pour colorer et valider la spécificité de l’EPR. La coloration des cellules EPR primaires était généralement effectuée aux passages P1 et P2. Ici, un bref aperçu du protocole d’immunofluorescence est présenté.
<ol><li>Ensemencer les cellules sur une lame de chambre de culture cellulaire (30 000 cellules par puits pour la lame de chambre à 8 puits).</li>
	<li>Culture des cellules dans des milieux de culture cellulaire EPR complets à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24-48 h.</li>
	<li>Lorsque les cellules sont confluentes à 80%-90%, aspirez le média et lavez la lame de chambre avec 1x PBS.</li>
	<li>Fixez la lame avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10-15 min.</li>
	<li>Aspirer le paraformaldéhyde à 4%, puis bloquer avec une solution de blocage (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Aspirer la solution bloquante et ajouter l’anticorps primaire, RPE65, et incuber pendant trois heures à 37 °C (avec une concentration d’anticorps allant de 1:200-1:250 dans le tampon de blocage, à un volume de 150-200 μL/lame). Ensuite, lavez trois fois avec PBS / TX-100 (5-10 min chaque lavage).</li>
	<li>Aspirer l’anticorps primaire et ajouter l’anticorps secondaire (avec une concentration d’anticorps de 1:1 000 dans le tampon de blocage, à un volume de 150-200 μL/lame). Incuber pendant une heure à 37 °C.</li>
	<li>Aspirer l’anticorps secondaire. Lavez trois fois avec PBS/Trtion X-100 (5-10 min chaque lavage).</li>
	<li>Ajoutez une goutte de support de montage DAPI pour étiqueter les noyaux et placez un couvercle sur la lame. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous la lame.</li>
	<li>Ensuite, prenez des images avec un microscope fluorescent, accompagné d’une caméra de microscope haute résolution (HRM) et d’un logiciel de traitement d’image (voir Tableau des matériaux).</li>
</ol>

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<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li>
<li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020).</li>
<li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE65%3A+role+in+the+visual+cycle%2C+human+retinal+disease%2C+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Genetics%22%5BJournal%5D)">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li>
<li>Pérez-Álvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li>
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<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomethylfumarate+induces+%CE%B3-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+%28RPE%29+and+erythroid+cells%2C+and+in+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer qui soit pertinent pour le contenu de cet article.

Le protocole actuel est une procédure détaillée rapportée, modifiée et simplifiée pour l’isolement de l’EPR à partir des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation, la dissection, la collecte, l’ensemencement, la culture et la caractérisation des cellules EPR isolées dans les yeux de souris.
Certaines limites et étapes critiques doivent être respectées pour une isolation réussie de l’EPR, telles que l’âge des souris, le nombre d’yeux disséqués, la taille de la plaque ou de la boîte de...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Les cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) sont situées entre la choroïde et la rétine neurale, formant une simple monocouche de cellules cuboïdes qui se trouve derrière les cellules photoréceptrices (PR)1. L’EPR joue un rôle essentiel dans le maintien d’un environnement sain pour les cellules PR, principalement en réduisant l’accumulation excessive d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et les dommages oxydatifs qui en découlent1. Les cellules EPR supervisent de nombreuses fonctions, telles que la conversion et le stockage des rétinoïdes, l’absorption de la lumière diffusée, le transport des fluides et des ions et la phagocytose dela membrane du segment externe 2,3 du PR. Les altérations de l’EPR (morphologie/fonction) peuvent altérer leur fonction conduisant à la rétinopathie et c’est une caractéristique commune à de nombreux troubles oculaires4. De nombreuses maladies oculaires sont associées à des altérations de la morphologie et de la fonction des cellules EPR, y compris certaines maladies génétiques comme la rétinite pigmentaire, l’amaurose congénitale de Leber et l’albinisme 4,5,6, ainsi que des troubles oculaires liés à l’âge comme la rétinopathie diabétique (RD) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)7,8 . Les cellules humaines sont les plus souhaitables, il serait donc idéal d’étudier les troubles de l’EPR dans les cellules RPE humaines primaires pour former des monocouches d’EPR. Cependant, les questions éthiques et la disponibilité limitée des donneurs humains en raison du fait que la plupart de ces troubles entraînent une morbidité9, mais pas nécessairement la mortalité10, empêchant ainsi l’isolement des cellules humaines primaires de l’EPR. Cela fait de la culture de cellules EPR provenant de donneurs animaux non humains une alternative privilégiée. Les rongeurs, en particulier les souris, sont considérés comme un excellent modèle pour l’étude de différentes maladies oculaires puisque la technologie transgénique est plus largement établie chez ces espèces11. Même si l’utilisation de cellules EPR primaires en culture offre de nombreux avantages, il a été difficile de maintenir des cellules en croissance pendant de nombreux passages, ou de stocker et de réutiliser les cellules. La principale limitation de ce protocole est l’âge des souris; les souris utilisées pour l’isolement de l’EPR doivent être très jeunes (18-21 jours est optimal) car il a été difficile de cultiver des cellules EPR à partir de souris adultes11,12,13. Les cellules EPR peuvent être isolées des yeux de souris à tout âge, mais jusqu’à quatre passages cellulaires n’ont été efficaces qu’avec de jeunes souris (âgées de 18 à 21 jours). L’isolement de l’EPR à partir de la rétine de souris, en utilisant à la fois des souris C57BL6 et des souris transgéniques avec délétion des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) au niveau des cellules EPR, a été réalisé pour étudier l’effet de l’homocystéine d’acides aminés élevés sur le développement et la progression de la DMLA14. De plus, des cellules RPE primaires isolées ont aidé à proposer une cible thérapeutique pour la DMLA par inhibition des NMDARs sur les cellules RPE14. Certains bloqueurs NMDAR sont approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) et sont actuellement utilisés pour traiter la confusion modérée à grave (démence) liée à la maladie d’Alzheimer (MA), comme la mémantine16, qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour la DMLA14. De plus, des cellules RPE primaires isolées de souris ont été utilisées pour la détection de marqueurs inflammatoires et l’induction proposée de l’inflammation comme mécanisme sous-jacent des caractéristiques induites par l’homocystéine de la DMLA et de la MA à l’aide d’une souris génétiquement modifiée (CBS), qui présente un niveau élevé d’homocystéine16,17.
Ce protocole a été utilisé pour isoler des cellules EPR de souris C57BL/6 de type sauvage et de souris transgéniques développées dans notre laboratoire comme une adaptation simplifiée d’autres protocoles d’isolement publiés13,18,19 pour atteindre un protocole facilement applicable et fiable. Il n’y a pas de préférence sexuelle dans ce protocole. Bien que l’âge des souris soit essentiel pour le processus d’isolement, des souris jeunes et âgées (âgées de 18 à 21 jours) et des souris plus âgées de tout âge (jusqu’à 12 mois) ont été utilisées pour l’isolement de l’EPR. Cependant, nous avons remarqué que les cellules EPR isolées des souris jeunes vivaient plus longtemps et que jusqu’à quatre passages pouvaient être effectués. Les cellules EPR isolées de souris plus âgées pourraient être transmises une ou deux fois, puis elles cesseraient de croître à un rythme normal et changeraient de forme pour être plus allongées (cellules ressemblant à des fibroblastes). Une perte de pigmentation et une diminution de l’adhérence à la plaque de culture tissulaire suivies d’un décollement ont également été observées.

<table><tbody><tr><td>Bécher : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de Clostridium histolyticum&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657-25MG</td><td>Pour enzyme de travail, une</td></tr><tr><td>pipette de transfert graduée jetable :3,2 mL Stérile</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>&nbsp ; gibco&nbsp ;</td><td>11330</td><td>Milieux pour la croissance des cellules EPR²</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>Pour milieu de culture cellulaire EPR complet</td></tr><tr><td>Solution réactive de gentamicine</td><td>gibco</td><td>15750-060</td><td>Pour milieu de culture cellulaire EPR complet</td></tr><tr><td>Solution de sel équilibré de Hanks (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>88284</td><td>Pour les enzymes de travail (A& B)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i Incubateur CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase à partir de testicules de bovins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506-500MG</td><td>Pour l’enzyme de travail A</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Luer-Lok avec aiguille attachée 21 G x 1 1/2 po, stérile, à usage unique, 3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tube : 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-RPE65 de souris&nbsp ;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, États-Unis</td><td>ab78036</td><td>Pour la coloration IF&nbsp ;</td></tr><tr><td>Stylo Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>Pour milieu de culture cellulaire EPR complet</td></tr><tr><td>Pince à épiler à action positive, Style 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Iris Standard Droit 11,5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall St8</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgicale, #11, acier inoxydable</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Plat de Culture Tissulaire : 100x20mm Style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes : 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubes : 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA (1x) 0.25 % </td><td>gibco</td><td>2186962</td><td>Pour travailler l’enzyme B</td></tr><tr><td>Pince à épiler 5MS, 8.2cm, Droite, 0.09x0.05mm Embouts</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Positive Action Style 5, Biologique, Dumostar, Finition Polie, 110 mm OAL</td><td>Microscopie électronique Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Sous-coussinets, Modéré : 23 » X 36"</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Pointe de technologie</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

La couche d’épithélium pigmenté rétinien (EPR) se trouve immédiatement derrière les photorécepteurs et abrite un système métabolique complexe qui joue plusieurs rôles critiques dans le maintien de la fonction des photorécepteurs. Ainsi, la structure et la fonction de l’EPR sont essentielles pour maintenir une vision normale. Ce manuscrit présente un protocole établi pour l’isolement primaire des cellules EPR de souris. L’isolement de l’EPR est un excellent outil pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la pathologie de l’EPR dans les différents modèles murins de troubles oculaires. En outre, l’isolement de l’EPR peut aider à comparer les cellules RPE primaires de souris isolées de souris de type sauvage et génétiquement modifiées, ainsi qu’à tester des médicaments qui peuvent accélérer le développement de thérapies pour les troubles visuels. Le manuscrit présente un protocole d’isolement RPE étape par étape; L’ensemble de la procédure, de l’énucléation à l’ensemencement, prend environ 4 heures. Le milieu ne doit pas être changé pendant 5 à 7 jours après l’ensemencement, pour permettre la croissance des cellules isolées sans perturbation. Ce processus est suivi par la caractérisation de la morphologie, de la pigmentation et des marqueurs spécifiques dans les cellules via l’immunofluorescence. Les cellules peuvent être traversées un maximum de trois ou quatre fois.

Validation de la spécificité, de la pureté et de la fonction/formation de barrière des cellules EPR isolées Les cellules isolées ont été examinées au microscope optique pour vérifier leur viabilité, leur morphologie et leur pigmentation. Des images de P0 et P1 (Figure 1A,B) et des images de P0 et P4 ont été capturées (Figure 1C,D) pour montrer les changements dans les cellules; forme, taille et pigmentation au fur et à mesure ...

Ce manuscrit décrit un protocole simplifié pour l’isolement progressif des cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules EPR.

Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Ce protocole décrira un moyen simple et efficace d’isoler avec succès les cellules primaires pigmentées de l’épithélium pigmenté de la rétine de souris. Les cellules de l’épithélium pigmentées de la rétine jouent un rôle très important pour maintenir les cellules photoréceptrices et assurer le fonctionnement normal de la rétine. Notre laboratoire a isolé les cellules épithéliales pigmentées primaires de souris comme un outil important pour étudier la barrière hémato-rétinienne externe et les maladies connexes telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge.Pour extraire les yeux de souris, euthanasiez éthiquement la souris selon les méthodes approuvées de votre établissement, puis placez la souris sur un coussinet stérile et nucléez l’œil en appuyant sur une pince à épiler de style 5/45 sur la zone orbitale pour induire la proptose, puis déplacez la pince à épiler vers la partie postérieure de l’œil et tirez doucement pour enlever l’œil en vous assurant que le nerf optique est toujours intact. Lors de l’utilisation de forceps, immergez les yeux dans un tube microcentrifuge de 2 millilitres contenant 5% de povidone iodée. Incuber les yeux à température ambiante pendant 2 à 3 minutes.Retirez les yeux de la povidone iodée et placez-les dans une boîte de Pétri. Lors de l’utilisation d’une pipette de transfert stérile, lavez les yeux avec la solution saline équilibrée de Hanks jusqu’à ce que la couleur orange de la povidone iodée ait disparu. Cela prend environ 2 à 3 lavages.Placez les yeux dans une nouvelle boîte de Petri et immergez-les dans un milieu de croissance complet des cellules EPR froides. À partir de là, vous pouvez commencer à disséquer sous un microscope à dissection. Au microscope, utilisez une pince à épiler et/ou des ciseaux Vannas pour tirer ou couper le tissu conjonctif dans les muscles extraoculaires.Les yeux peuvent ensuite être maintenus pendant une heure dans des milieux de culture cellulaire EPR froids. Cependant, il est préférable de passer directement à l’étape suivante après avoir nettoyé le globe oculaire. Transférer les yeux dans un tube microcentrifuge de 2 millilitres contenant la solution d’enzyme A, puis incuber les yeux dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes.Retirez les yeux de la solution d’enzyme A et placez-les dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 millilitres contenant la solution d’enzyme B, puis placez-les dans un incubateur et incuber à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes. Retirez les yeux de l’enzyme B et placez-les dans une boîte de Petri de 60 millimètres et immergez-les et complétez le milieu de croissance des cellules EPR, puis incuber les yeux à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes. Placez la capsule sous le microscope à dissection et commencez à disséquer.Utilisez des pinces M5S et une aiguille de seringue pour faire une incision dans la section ora seratta. Maintenant, avec deux pinces, saisissez la partie interne de l’incision avec une pince et saisissez la cornée avec l’autre pince. Commencez à déchirer lentement la cornée de la rétine en tirant la cornée.Assurez-vous de déchirer par petits incréments et de descendre la déchirure lorsque vous retirez la cornée. Cela garantira que le RPE restera en grande partie intact et vous obtiendrez une déchirure plus propre. Une fois que la cornée est complètement détachée, vous devriez pouvoir voir l’iris et le cristallin.Retirez à la fois l’iris et la lentille avec une pince pour maintenir la pureté de l’isolement. Pour retirer la rétine neurale de la couche EPR, saisissez la couche externe de l’œilleton avec une pince à épiler et placez un bras d’une deuxième pince à épiler entre les couches RPE et neurale. De là, retirez doucement ou retirez la rétine neurale de la couche d’EPR, puis jetez la rétine neurale.Déplacez la couche RPE à un autre endroit de la capsule, exempte de débris. Pour séparer l’EPR de la choroïde et de la sclérotique, grattez doucement l’intérieur de l’œilleton avec une pince à épiler de style 5/45 pour assurer la séparation des cellules EPR. Les cellules EPR semblent troubles lorsqu’elles sont en suspension et complètent le milieu de croissance des cellules EPR.Aspirer les cellules à l’aide d’une pipette de transfert stérile de 3,2 millilitres et transférer dans un nouveau tube centrifuge de 15 millilitres contenant un milieu de croissance complet des cellules EPR. Les cellules peuvent être centrifugées à 300g pendant 10 minutes à température ambiante. Vous pouvez ensuite aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un milieu de croissance de cellules EPR chauffé.Plaquez les cellules sur une boîte de Petri de 100 millimètres et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de CO2. Ces images montrent une isolation réussie au passage 0 et au passage 1, ce qui est évident par la pigmentation des cellules EPR. Au passage 4, les cellules deviennent moins caractéristiques et présentent moins de pigments, montrent un aspect fusiforme ou deviennent plus robustes avec une plus grande surface.Nous avons validé les cellules EPR avec un marqueur spécifique de l’EPR, RPE65 et une protéine F-actine du cytosquelette. Nous avons également vérifié la contamination potentielle par les cellules de Muller en colorant avec un marqueur spécifique aux cellules de Muller, la vimentine. Ce protocole est une adaptation simplifiée des protocoles existants.Le protocole utilise des matériaux et des équipements connexes disponibles dans la plupart des laboratoires de recherche, ce qui aidera à isoler efficacement les cellules RPE primaires de souris.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans cette vidéo, nous montrons une procédure pour obtenir des cellules épithéliales pigmentaires oculaires à partir d’un modèle de lapin. Les cellules sont utiles dans le développement de stratégies thérapeutiques pour les maladies dégénératives de la rétine.

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Dans cette vidéo, nous décrivons une technique permettant d’isoler les cellules épithéliales de l’iris et du pigment rétinien des yeux porcins afin d’obtenir leurs cultures primaires pour des études in vivo et ex vivo. Ces cellules pigmentaires pourraient être génétiquement modifiées pour étudier des approches régénératives pour traiter les troubles oculaires.

Isolement des cellules IPE et RPE : une technique pour obtenir des cellules épithéliales pigmentées à partir d’un œil porcin isolé

L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est un épithélium multifonctionnel de le œil. Nous présentons ici un protocole visant à mettre en place des cultures de cellules primaires provenant de la RPE murine.

Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

Ce protocole, qui a été initialement rapporté par Fernandez-Godino et coll. en 20161, décrit une méthode pour isoler efficacement et culturer les cellules RPE de souris, qui forment un monocouche RPE fonctionnel et polarisé en moins d’une semaine sur les plaques Transwell. La procédure dure environ 3 heures.

Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Nous décrivons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Cette procédure permet des études de biologie moléculaire de suivi sur l’EPR isolé, y compris des analyses d’expression génique.

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye

Ce protocole décrit la procédure d’obtention et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires (EPR) à partir d’yeux porcins d’origine locale. Ces cellules constituent une alternative de haute qualité aux cellules souches et conviennent à la recherche rétinienne in vitro .

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines primaires pour la modélisation in vitro

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

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Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

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