Name: Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Découvrez un bioréacteur guidé par imagerie pour la manipulation des tissus des voies respiratoires. Cette méthode permet l'élimination contrôlée de l'épithélium endogène et la distribution homogène de cellules exogènes sur la trachée de rat.

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Cette recherche a été soutenue en partie par l’American Thoracic Society Foundation Research Program, la New Jersey Health Foundation et la National Science Foundation (CAREER Award 2143620) à J.K.; et les National Institutes of Health (P41 EB027062) à G.V.N.

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<li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985(2019).</li>
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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Dans ce travail, nous avons créé un bioréacteur guidé par imagerie qui peut permettre (i) la surveillance de la lumière de la trachée in situ après l’élimination cellulaire et l’administration cellulaire exogène et (ii) la culture in vitro à long terme du tissu trachéal ensemencé cellulaire. À l’aide de ce bioréacteur sur mesure, nous avons démontré (i) l’élimination sélective des cellules épithéliales endogènes de la lumière de la trachée à l’aide d’un détergent et d’un lavage des voies respiratoires a...

La surface luminale des voies respiratoires est tapissée d’une couche d’épithélium qui se compose principalement de cellules souches multiciliées, en massue, en gobelet et basales 1,2. La couche épithéliale sert de mécanisme de défense primaire du poumon, agissant comme une barrière biophysique qui protège le tissu sous-jacent des voies respiratoires contre les agents pathogènes inhalés, les particules ou les gaz chimiques. Il protège le tissu des voies respiratoires par de multiples mécanismes, y compris la formation de jonctions étroites intercellulaires, la clairance mucociliaire et la sécrétion d’antimicrobiens et d’antioxydants 3,4. L’épithélium défectueux des voies respiratoires est associé à des maladies respiratoires dévastatrices, telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)5, la dyskinésie ciliaire primaire (PCD)6 et la fibrose kystique (FK)7.
Les progrès de la technologie des poumons sur puce (LOC) représentent une occasion d’étudier le développement pulmonaire humain, de modéliser diverses maladies pulmonaires et de développer de nouveaux matériaux thérapeutiques dans des environnements in vitro étroitement réglementés. Par exemple, l’épithélium et l’endothélium des voies respiratoires peuvent être cultivés sur les côtés opposés d’une membrane mince et poreuse pour imiter le tissu pulmonaire échangeant du gaz, ce qui permet une modélisation fidèle de la maladie et des tests demédicaments 8. De même, des modèles de maladies in vitro ont été créés pour modéliser les maladies des voies respiratoires in vitro, telles que la MPOC9 et la fibrose kystique10. Cependant, un défi majeur des dispositifs LOC est de récapituler l’architecture tridimensionnelle complexe (3D) du tissu pulmonaire et les interactions dynamiques de la matrice cellulaire-tissulaire in vitro11.
Récemment, des méthodologies innovantes d’ingénierie tissulaire ont été développées qui permettent la manipulation des tissus pulmonaires ex vivo 12. À l’aide de ces méthodologies, des greffes de tissus allogéniques ou xénogéniques dénudés peuvent être préparées en éliminant les cellules endogènes du tissu pulmonaire par des traitements chimiques, physiques et mécaniques13. En outre, la matrice extracellulaire (ECM) tissulaire native préservée dans les échafaudages pulmonaires décellularisés fournit les indices structurels, biochimiques et biomécaniques physio-mimétiques permettant aux cellules implantées de se fixer, de proliférer et de se différencier14,15.
Ici, un système de bioréacteur guidé par imagerie créé en combinant les technologies LOC et d’ingénierie tissulaire pour permettre la manipulation tissulaire in vitro et la culture de tissus trachéaux de rat explantés est rapporté. À l’aide de ce bioréacteur tissulaire des voies respiratoires, le protocole démontre l’élimination sélective des cellules épithéliales endogènes sans perturber les composants cellulaires et biochimiques sous-épithéliaux sous-jacents du tissu des voies respiratoires. Nous montrons ensuite la distribution homogène et le dépôt instantané des cellules exogènes nouvellement ensemencées, telles que les cellules souches mésenchymateuses (CSM), sur la lumière des voies respiratoires dénudées en instillant la solution de pré-gel de collagène I chargée de cellules. De plus, en utilisant le dispositif d’imagerie micro-optique intégré dans le bioréacteur, la visualisation de la lumière de la trachée lors de l’élimination de l’épithélium et de la livraison de cellules endogènes est également effectuée. En outre, il est démontré que la trachée et les cellules nouvellement implantées peuvent être cultivées dans le bioréacteur sans mort cellulaire notable et dégradation des tissus pendant 4 jours. Nous envisageons que la plate-forme de bioréacteur basée sur l’imagerie, la technique de désépithélialisation à base de couches minces et la méthode d’administration cellulaire utilisée dans cette étude peuvent être utiles pour générer des tissus des voies respiratoires pour la modélisation in vitro de la maladie et le dépistage des médicaments.
Le bioréacteur comprend une chambre rectangulaire reliée à une pompe à seringue programmable, une pompe de perfusion et un ventilateur pour la culture de la trachée isolée du rat. Le bioréacteur comporte des entrées et des sorties reliées à la trachée ou à la chambre de culture tissulaire pour fournir séparément des réactifs (p. ex. milieux de culture) aux espaces internes et externes de la trachée (figure 1). Un système d’imagerie sur mesure peut être utilisé pour visualiser l’intérieur de la trachée de rat cultivée in vitro au niveau cellulaire (Figure 2). L’épithélium endogène de la trachée est éliminé par instillation d’une solution de décellularisation à base de détergent suivie d’un lavage des voies respiratoires assisté par vibration (Figure 3). La solution d’hydrogel, telle que le collagène de type I, est utilisée comme vecteur pour l’ensemencement uniforme et instantané des cellules exogènes à travers la lumière de la trachée dénudée (Figure 4). Tous les matériaux utilisés pour construire le bioréacteur et mener les expériences sont fournis dans la table des matériaux.

<table><tbody><tr><td>1& fois ; PBS</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10-010-031</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur 3 ports</td><td>World Precision Instruments</td><td>14048-20</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur 4 ports</td><td>World Precision Instruments</td><td>14047-10</td><td></td></tr><tr><td>Accéléromètre</td><td>STMicroelectronics</td><td>IIS3DWBTR</td><td></td></tr><tr><td>Doublet achromatique</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium embout de goupille</td><td>TED PELLA</td><td>16111</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycosique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Tige de montage</td><td>Thorlabs</td><td>ER1</td><td></td></tr><tr><td>Vis à tête ronde</td><td>McMaster-Carr</td><td>91255A274</td><td></td></tr><tr><td>Cube de cage</td><td>Thorlabs</td><td>C4W</td><td></td></tr><tr><td>Ruban conducteur double face en carbone</td><td>TED PELLA</td><td>16073</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’étiquetage CFSE</td><td>Abcam</td><td>ab113853</td><td></td></tr><tr><td>Citrisolv (agent nettoyant)</td><td>Decon</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur monture C</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A9</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5153</td><td></td></tr><tr><td>Peinture conductrice argent liquide</td><td>TED PELLA</td><td>16034</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque</td><td>Semrock</td><td>DI03-R488</td><td>Longueurs d’onde laser réfléchies :&nbsp ; 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm</td></tr><tr><td>Aigle modifié de Dulbecco' s medium</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de cloison à</td> cannelure de tuyau <td>Cole-Parmer</td><td>EW-45501-30</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de luer femelle à tube cannelé</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-03</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur luer femelle à mâle</td><td>Cole-Parmer</td><td>ZY-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Lentille</td><td>filtrante Chroma Technology Corp</td><td>ET535/50m</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E1000 - D</td><td></td></tr><tr><td>Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Écrou hexagonal</td><td>McMaster-Carr</td><td>91813A160</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Fisher Scientifc</td><td>AC120585000</td><td></td></tr><tr><td>Fibre d’imagerie</td><td>SELFOC, NSG groupe</td><td>Lentille</td><td></td>GRIN</tr><tr><td>Laser</td><td>Opto Engine</td><td>MDL-D-D-488-150mW</td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>d’objectif Thorlabs</td><td>SM1L40</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de viabilité/cytotoxicité (Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>MACH 3 Logiciel de contrôle CNC</td><td>Newfangled Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Olympus</td><td>UCPLFLN20X</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Cole Parmer</td><td>L/S système</td><td></td>de pompe numérique standard</tr><tr><td>Recombinant humain FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Anneau de retenue</td><td>Thorlabs</td><td>SM1RR</td><td></td></tr><tr><td>Scientific Caméra CMOS</td><td>PCO Panda PCO</td><td>Panda Panda 4.2</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>VWR</td><td>97064-472</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks ( 2019)</td><td>Dassault Syst&egrave ; Tube</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d’objectif empilable</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur à plaque de caisson de basses</td><td>Dayton Audio</td><td>SPA250DSP</td><td></td></tr><tr><td>Haut-parleur de caisson de basses</td><td>Dayton Audio</td><td>RSS21OHO-4</td><td>Diamètre de la membrane : 21 cm</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>World Precision Instruments</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de cage filetée</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur Luer fileté</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45513-81</td><td></td></tr><tr><td>Lentille tubulaire</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>13-200-110</td><td></td></tr><tr><td>XY Translator</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr></tbody></table>

bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Les lésions répétées des tissus des voies respiratoires peuvent altérer la fonction pulmonaire et causer des maladies pulmonaires chroniques, comme la maladie pulmonaire obstructive chronique. Les progrès de la médecine régénérative et des technologies de bioréacteur offrent des possibilités de produire des tissus fonctionnels et des organes cultivés en laboratoire qui peuvent être utilisés pour dépister des médicaments, modéliser des maladies et concevoir des remplacements tissulaires. Ici, un bioréacteur miniaturisé couplé à une modalité d’imagerie qui permet la visualisation in situ de la lumière interne de la trachée de rat explantée lors de la manipulation et de la culture de tissus in vitro est décrit. À l’aide de ce bioréacteur, le protocole démontre l’élimination sélective guidée par imagerie des composants cellulaires endogènes tout en préservant les caractéristiques biochimiques intrinsèques et l’ultrastructure de la matrice tissulaire des voies respiratoires. En outre, la livraison, la distribution uniforme et la culture prolongée ultérieure de cellules exogènes sur la lumière décellularisée des voies respiratoires avec surveillance optique in situ sont montrées. Les résultats soulignent que le bioréacteur guidé par imagerie peut potentiellement être utilisé pour faciliter la génération de tissus fonctionnels des voies respiratoires in vitro .

La modalité d’imagerie in situ basée sur la lentille GRIN peut permettre la visualisation de la lumière interne trachéale in situ (Figure 5A). Grâce à cette méthode d’imagerie, il est possible d’obtenir des images en champ lumineux et fluorescentes des trachées natives et désépithélialisées (Figure 5B,C). Aucun signal fluorescent n’a été observé à partir de la trachée native avant le marquage CFSE (Figure 5...

Le protocole décrit un bioréacteur basé sur l’imagerie qui permet l’élimination sélective de l’épithélium endogène de la trachée du rat et la distribution homogène des cellules exogènes à la surface de la lumière, suivie d’une culture in vitro à long terme de la construction du tissu cellulaire.

Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Ce protocole permet la culture in vitro et la visualisation microscopique directe des tissus isolés des voies respiratoires lors de différentes procédures de manipulation tissulaire, telles que la désépithélisation et la régénération des tissus des voies respiratoires. L’imagerie in situ proposée dans cette étude permet une surveillance rapide et non destructive de la lumière trachéale lors de l’ablation contrôlée guidée par imagerie de l’épithélium endogène et de l’administration des cellules exogènes. La plate-forme de bioréactivité guidée par imagerie et les protocoles de manipulation tissulaire peuvent être utilisés pour générer des tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie pour la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments.La construction et l’utilisation du bioréacteur tissulaire des voies respiratoires par imagerie seront démontrées par deux doctorants de notre groupe de recherche, Mohammad Mir, et Jiawen Chen. Pour commencer à créer un dispositif d’imagerie in situ, insérez une lentille tubulaire dans un tube de lentille empilable et fixez-la à l’aide d’un anneau de retenue. Ensuite, montez l’ensemble de la table d’objectif sur une caméra CMOS

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Bioengineering

Bioingénierie

Notre groupe a développé un système de culture bioréacteur qui imite les contraintes pulsatiles physiologiques du système cardiovasculaire pour régénérer implantables petit diamètre des greffons vasculaires.

Greffes d&#39;ingénierie biologique vasculaire basé sur l&#39;aide d&#39;un bioréacteur pulsatile

Nous avons développé une matrice extracellulaire et des poumons décellularisé bioréacteur roman biomimétiques qui peuvent être utilisés pour générer des tissus pulmonaires fonctionnelles. Par ensemencement des cellules dans la matrice et la culture dans le bioréacteur, nous générons des tissus qui démontre les échanges gazeux efficaces lorsqu'elles sont transplantées in vivo pour de courtes périodes de temps.

Procédure pour l&#39;ingénierie du poumon

La décellularisation de l’organe entier produit des échafaudages biologiques naturels qui peuvent être utilisés pour la médecine régénérative. La description d’un modèle de primate non humain de régénération pulmonaire dans lequel des poumons entiers sont décellularisés, puis ensemencés avec des cellules souches adultes et des cellules endothéliales dans un bioréacteur qui facilite la circulation vasculaire et la ventilation des milieux liquides, est présentée.

Décellularisation et recellularisation pulmonaires de primates non humains à l’aide d’un bioréacteur spécialisé à grands organes

La récapitulation du microenvironnement spécifique à l’organe, qui stimule l’angiogenèse locale, est indispensable pour une régénération réussie des tissus endommagés. Ce rapport fait la démonstration d’une nouvelle méthode pour implanter des gels de fibrine à la surface pulmonaire d’une souris vivante afin d’explorer comment le microenvironnement spécifique aux poumons module l’angiogenèse et la régénération alvéolaire chez la souris adulte.

Implantation de fibrine Gel sur la souris Lung pour étudier l&#39;angiogenèse pulmonaire spécifique

Les progrès des technologies des biomatériaux permettent le développement de constructions tridimensionnelles de type multicellulaire. Nous avons développé des protocoles d’électrofilage pour produire trois échafaudages individuels afin de cultiver les principales cellules structurelles des voies respiratoires afin de fournir un modèle 3D in vitro de la paroi bronchiole des voies respiratoires.

Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle du mur Airway

Sténose de la greffe constitue un obstacle critique en remplacement de tissu conçu des voies respiratoires. Afin d’étudier les mécanismes cellulaires qui sous‑tendent la sténose, nous utilisons un modèle murin de remplacement trachéale tissu machiné avec ensemencé la moelle osseuse des cellules mononucléaires (BM-MNC). Ici, nous détaillons notre protocole, y compris la fabrication d’échafaudages, BM-MNC isolement, semis de la greffe et l’implantation.

Ensemencement et Implantation d’un greffon biosynthétique de trachéale tissulaire dans un modèle murin

L’objectif de ce protocole est d’exécuter une co-culture dynamique de macrophages humains et de myofibroblastes dans des échafaudages tubulaires électrospunés pour étudier la régénération tissulaire entraînée par les matériaux, à l’aide d’un bioréacteur qui permet le découplage de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique.

Un bioréacteur multi-cue pour évaluer la capacité inflammatoire et régénératrice des biomatériaux sous écoulement et étirement

Ce protocole présente une méthode pour la culture et la croissance 3D de cellules de type améloblaste en microgravité afin de maintenir leur forme allongée et polarisée ainsi que l’expression protéique spécifique de l’émail. Les conditions de culture pour la culture de constructions d’ingénierie parodontale et d’organes pulmonaires en microgravité sont également décrites.

Propagation de cellules et d’organes dentaires et respiratoires en microgravité

Le présent protocole décrit les cellules alvéolaires de type 2 dérivées de cellules souches pluripotentes de type 2 induites par l’homme (iAT2s). Ces cellules peuvent être cultivées en tant que sphères auto-renouvelées en culture 3D ou adaptées à la culture d’interface air-liquide (ALI).

Génération de sphères 3D et de cultures d’interface air-liquide 2D de cellules épithéliales pluripotentes de type 2 dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Les progrès récents dans les protocoles de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme permettent la dérivation par étapes de types de cellules spécifiques à un organe. Ici, nous fournissons des étapes détaillées pour la maintenance et l’expansion des cellules basales des voies respiratoires dérivées de l’iPSC et leur différenciation en épithélium mucociliaire dans des cultures d’interface air-liquide.

Génération de cultures d’interface air-liquide de cellules épithéliales des voies respiratoires à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole décrit la génération d’organoïdes à partir de cellules épithéliales alvéolaires A549 et de fibroblastes pulmonaires MRC-5 sur un échafaudage hydrogel à matrice extracellulaire, suivie de l’intégration dans des gels de collagène 3D et d’une exposition à une contrainte mécanique à l’aide d’un bioréacteur d’étirement cellulaire pour étudier la mécanobiologie alvéolaire.

Génération d’organoïdes alvéolaires A549/MRC-5 intégrés en collagène 3D à l’aide d’un bioréacteur mécanique à étirement cellulaire

Découvrez un bioréacteur guidé par imagerie pour la manipulation des tissus des voies respiratoires. Cette méthode permet l'élimination contrôlée de l'épithélium endogène et la distribution homogène de cellules exogènes sur la trachée de rat.

Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie

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