Name: Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Découvrez comment évaluer l'ubiquitylation du substrat par une ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères. Cette méthode utilise des lignées HEK293T et l'immunoprécipitation pour étudier les interactions ligase-substrat impliquées dans le cancer et les troubles neurologiques.

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REMARQUE : La figure 1 présente un aperçu du protocole de dosage de l’ubiquitylation dans les cellules de mammifères.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg"> Graphique 1. Vue d’ensemble de la procédure de dosage de l’ubiquitylation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
1. Culture cellulaire
<ol><li>Cultiver la lignée cellulaire HEK293T dans une boîte de culture traitée par TC de 100 mm jusqu’à une confluence de 80 % à 90 % dans les milieux de croissance (DMEM (Modified Eagle’s Medium) de Dulbecco enrichi en 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et de pénicilline (100 unités), de streptomycine (100 μg) et de L-glutamine (0,292 mg/mL)). Incuber la culture à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5 % de CO2.</li>
	<li>Pour passer les cellules, aspirer le milieu de la boîte de culture à l’aide d’une pipette sérologique. Lavez les cellules une fois avec 1 mL de solution saline stérilisée 1x tamponnée au phosphate (PBS 1x).</li>
	<li>Détachez les cellules en ajoutant 1 mL de solution de trypsine/EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique). Incuber le plat à 37 °C pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules à l’aide d’une pipette sérologique dans 2 mL de milieu de croissance.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube frais et propre de 15 mL et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Retirez le surnageant en le versant soigneusement. Remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 3 mL de milieu de croissance en pipetant de haut en bas pour obtenir une suspension cellulaire homogène.</li>
	<li>Transférer 1 mL de la suspension cellulaire dans une boîte de culture traitée par TC de 100 mm contenant 9 mL de milieu de croissance. REMARQUE: Si les cellules sont dans de bonnes conditions, chaque plat de culture de HEK293T, dans lequel la confluence est de 80% à 90%, peut générer trois plats de culture avec une confluence de 80% 2 jours après le passage.</li>
</ol>2. Transfection cellulaire
REMARQUE: Il n’est pas recommandé de transfecter la culture cellulaire si la confluence atteinte est inférieure à 80%.
<ol><li>Avant la transfection, certifier si les cellules sont exemptes de contamination et à une confluence adéquate pour les transfections transitoires.</li>
	<li>Pour chaque échantillon de transfection, préparer les complexes ADN-polyéthylène (PEI 1 μg/μL à pH 7,2) comme suit :<ol>
<li>Diluer 3 μg de chaque plasmide dans 100 μL d’opti-MEM I milieu sérique réduit sans supplémentation et mélanger doucement en pipetant la solution de haut en bas. NOTE: Ici, les cellules ont été transfectées avec 4 μg de chaque plasmide: vecteur vide (pcDNA3) ou FLAG-Fbxo7 construits et UXT-V2-HA, avec ou sans 6xHis-myc-ubiquitine. La teneur totale en ADN était de 12 μg.</li>
		<li>Décongeler l’Î.-P.-É. à TA et l’ajouter à la solution en suivant une proportion de 3 μL d’Î.-P.-É. par 1 μg d’ADN. Homogénéiser la solution en pipetant de haut en bas. Ensuite, incubez-le pendant 15 min à TA pour permettre la formation de complexes ADN-PEI. REMARQUE : La proportion optimale du volume de l’Île-du-Prince-Édouard par quantité d’ADN diffère selon la lignée cellulaire sélectionnée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajoutez le volume total de complexes ADN-PEI à chaque plat contenant la culture cellulaire et mélangez-le doucement en berçant la plaque d’avant en arrière. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5 % de CO2.</li>
	<li>Remplacez le milieu de croissance après 5 h, car une exposition prolongée à l’Île-du-Prince-Édouard peut être toxique pour les cellules HEK293T. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5% de CO2 pendant 36 h.</li>
</ol>3. Lyse cellulaire et immunoprécipitation
<ol><li>Après la période d’incubation et 6 h avant la lyse cellulaire, traiter les cellules transfectées avec 10 μM de l’inhibiteur du protéasome MG-132. Encore une fois, incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5% de CO2.</li>
	<li>Aspirer le milieu de chaque plat de culture à l’aide d’une pipette sérologique et le laver une fois avec 1 mL de 1x PBS. Détachez les cellules en ajoutant 1 mL de trypsine et en incubant le plat à 37 °C pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu de croissance.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube frais et propre de 15 mL et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à TA.</li>
	<li>Retirez le surnageant en le versant soigneusement. Remettre doucement la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon de lyse NP-40 glacé (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl et 1 % NP-40), complété par le cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase (10 mM NaF et 1 mM Na3VO4), et transférer la solution dans un microtube propre de 1,5 mL.</li>
	<li>Incuber le lysat cellulaire pendant 30 min sur de la glace. Après incubation, centrifuger les lysats cellulaires à 16 900 x g pendant 20 min à 4 °C.</li>
	<li>Pendant ce temps, équilibrez les perles d’agarose-anti-HA avec un tampon de lyse NP-40 glacé. Utilisez 15 μL de billes d’agarose-anti-HA pour chaque échantillon. Lavez les billes avec 200 μL de tampon de lyse NP-40 en les pulsant dans un tube de microcentrifugation à 3 000 x g pendant 1 min à 4 °C. Avec une pipette, aspirer et jeter le surnageant très soigneusement; répétez ce processus trois fois. Ensuite, gardez les perles équilibrées sur de la glace jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Après avoir centrifugé les lysats cellulaires, récupérez le surnageant. Quantifier la teneur en protéines du lysat total à l’aide de la méthode de Bradford16.</li>
	<li>S’assurer que chaque échantillon soumis à l’immunoprécipitation présente une quantité égale de protéines. Incuber le volume nécessaire de lysat cellulaire avec les billes d’agarose-anti-HA équilibrées pendant 4 h, en tournant doucement dans un incubateur rotatif à 4 °C, ce qui permet à l’UXT-V2-HA de se lier aux billes d’agarose-anti-HA.</li>
	<li>Recueillir les billes d’agarose-anti-HA en les pulsant dans un tube de microcentrifugation à 3 000 x g pendant 1 min à 4 °C. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant. Lavez les billes trois fois avec un tampon de lyse cellulaire NP-40 glacé et deux fois avec un tampon FLAG/HA glacé (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl et 0,1 % NP-40).</li>
	<li>Après le lavage final, retirer soigneusement tout le surnageant à l’aide d’une pipette et éluer la protéine polyubiquitylée avec le peptide HA (300 μg/mL) dilué sur un tampon FLAG/HA. Incuber les billes d’agarose-anti-HA avec du peptide HA pendant 1 h à 4 °C dans une plate-forme agitatrice à bascule.</li>
	<li>Faire tourner les billes à 3 000 x g pendant 2 min à 4 °C et pipeter soigneusement le surnageant contenant les protéines polyubiquitinées. Si nécessaire, conservez l’éluat dans un microtube frais et propre à -20 °C.</li>
	<li>Résoudre les éluats et les lysats cellulaires dans 10% de SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide)17 et immunoblotting.</li>
	<li>Dans cette étude, un transfert humide WB a été effectué. Pour ce type de transfert, placez le gel dans un sandwich de transfert composé de papier filtre-gel-membrane-papier filtre, amortissez-le avec des tampons et pressez-le ensemble par une grille de support. Placez ce système verticalement dans un réservoir rempli de tampon de transfert et entre des électrodes en acier inoxydable / fil de platine. Le transfert a lieu pendant 90 min à 150 V dans un tampon de transfert humide (glycine 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% Méthanol). REMARQUE: Puisque les extraits cellulaires ont été quantifiés (étape 3.7), exécutez une SDS-PAGE avec une quantité égale de protéines pour chaque échantillon. En outre, pour résoudre l’éluat, exécutez des volumes égaux de chaque échantillon.</li>
	<li>Sondez la membrane de l’immunoblot à l’aide d’anticorps sélectionnés 11. Assurez-vous qu’un signal de frottis est détecté dans l’éluat du substrat polyubiquitylé tiré dans le processus IP en utilisant un anticorps anti-myc dans les échantillons contenant la ligase E3 de type sauvage, le substrat et le myc-ub. Dans le lysat cellulaire (entrée), assurez-vous que le signal du substrat choisi, de la protéine Fbxo7, des protéines ubiquitylées et d’une protéine d’entretien ménager (par exemple, GAPDH et β-actine) est détecté pour garantir la même quantité de protéines dans chaque voie. REMARQUE: La dilution pour chaque anticorps utilisé a été préparée conformément aux instructions du fabricant.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

L’ubiquitylation est une modification post-traductionnelle essentielle qui régule les niveaux de plusieurs protéines et joue un rôle crucial dans de nombreuses voies de signalisation et processus biologiques, assurant un environnement intracellulaire sain. Le système ubiquitine-protéasome (UPS) est l’un des principaux axes de la recherche pharmaceutique récente, offrant la possibilité de stabiliser les suppresseurs de tumeurs ou d’induire la dégradation des produits oncogènes22. Par exemple, la pr...

Les modifications post-traductionnelles (PTM) sont un mécanisme important concernant la régulation des protéines, qui est essentielle pour l’homéostasie cellulaire. L’ubiquitylation des protéines est une modification dynamique et complexe qui crée un assortiment de différents signaux entraînant plusieurs résultats cellulaires chez les organismes eucaryotes. L’ubiquitylation est un processus réversible consistant en la fixation d’une protéine d’ubiquitine contenant 76 acides aminés au substrat, se produisant dans une cascade enzymatique composée de trois réactions distinctes1. La première étape est caractérisée par l’activation de l’ubiquitine, qui dépend d’une hydrolyse de l’ATP pour former une ubiquitine liée au thioester de haute énergie entre l’ubiquitine C-terminus et le résidu de cystéine présent dans le site actif de l’enzyme E1. Par la suite, l’ubiquitine est transférée à l’enzyme E2 formant un complexe semblable à un thioester avec l’ubiquitine. Par la suite, l’ubiquitine est fixée de manière covalente au substrat par l’E2, ou plus souvent, par l’enzyme E3, qui reconnaît et interagit avec le substrat 2,3. Parfois, des enzymes E4 (facteurs d’allongement de la chaîne ubiquitine) sont nécessaires pour favoriser l’assemblage de la chaîne multiubiquitine3.
L’ubiquitine a sept résidus de lysine (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63), permettant la formation de chaînes de polyubiquitine qui génèrent des liaisons distinctes pour produire différentes structures tridimensionnelles qui vont être reconnues par plusieurs protéines effectrices 4,5. Par conséquent, le type de chaîne de polyubiquitine introduit dans le substrat est essentiel pour décider de son devenir cellulaire 6,7,8. De plus, le substrat pourrait également être ubiquitiné par ses résidus N-terminaux appelés N-dégrons. Les ubiquitine-ligases E3 spécifiques sont responsables de la reconnaissance du N-degron, permettant la polyubiquitylation du résidu de lysine9 à proximité.
De nos jours, il existe plus de 40 substrats différents spécifiques au SCF caractérisés. Parmi ceux-ci, les principaux régulateurs de plusieurs voies biologiques, y compris la différenciation et le développementcellulaires ainsi que la survie et la mort cellulaires, peuvent être trouvés 10,11,12,13. Ainsi, l’identification de substrats spécifiques de chaque ubiquitine-ligase E3 est essentielle pour concevoir une carte complète des différents événements biologiques. Même si l’identification de véritables substrats est biochimiquement difficile, l’utilisation de méthodes basées sur la biochimie est très appropriée pour évaluer la spécificité de la chaîne et la distinction entre mono- et polyubiquitylation14. Cette étude décrit un protocole complet pour le dosage de l’ubiquitylation utilisant la lignée cellulaire de mammifères HEK293T surexprimant le substrat UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) avec le complexe E3 ubiquitine-ligase SCF (Fbxo7). L’UXT-V2 est un cofacteur essentiel pour la signalisation NF-κB, et une fois que cette protéine est renversée dans les cellules, elle inhibe l’activation NF-κB induite par le TNF-α11. Ainsi, pour détecter l’UXT-V2 polyubiquitylé, l’inhibiteur du protéasome MG132 est utilisé puisqu’il a la capacité de bloquer l’activité protéolytique de la sous-unité 26S du complexe protéasome15. En outre, l’extrait cellulaire est soumis à une IP à petite échelle pour purifier le substrat, en utilisant un anticorps spécifique immobilisé en résine d’agarose pour une détection ultérieure par WB à l’aide d’anticorps sélectionnés. Ce protocole est très utile pour valider l’ubiquitylation du substrat dans l’environnement cellulaire, et il peut également être adapté à différents types de cellules de mammifères et à d’autres complexes E3 ubiquitine-ligase. Cependant, il est nécessaire de valider le substrat testé par un test d’ubiquitylation in vitro, car les deux protocoles se complètent en ce qui concerne l’identification de véritables substrats.

<table><tbody><tr><td>Microtube de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture traitée TC de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 15 mL Plaque</td><td>de</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>de 96 puits</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>Perles d’agarose-anti-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>Anticorps anti-IgG anti-Souris IgG</td></tr><tr><td>Souris Anti Lapin</td><td>Seracare</td><td>5220-0337</td><td>Anticorps IgG Anti-Actine Chèvre</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>Dilution utilisée : 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorps Anti-Fbxo7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>Dilution utilisée : 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps Anti-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>Dilution utilisée : 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Myc</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2272</td><td>Dilution utilisée : 1:1000</td></tr><tr><td>Réactif Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>Incubateur de cellules d’albumine sérique bovine</td></tr><tr><td></td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 x g pendant 5 min</td></tr><tr><td>PH-mètre numérique ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CRV</td><td>Glycémie</td></tr><tr><td>fœtale élevée</td><td>Gibco</td><td>F4135</td><td>Filtrat d’utilisation antérieure</td></tr><tr><td>Peptide HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline rotateur</td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrane buvard nitrocellulose</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600016</tr><tr><td>NP40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Microscopes OPTIKA</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>Pour l’expression des mammifères</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp ; Gracieusement offert par le Dr Marcelo Dam&aacute ; </td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag (N-terminal). Enzymes de restriction : EcoRI et XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&Delta ; F-box</td><td>&nbsp ; Gracieusement offert par le Dr Marcelo Dam&aacute ; </td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag (N-terminal). Enzymes de restriction : EcoRI et XhoI. et Delta ; 335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA</td><td>&nbsp ; Gracieusement offert par le Dr Marcelo Dam&aacute ; </td><td></td> rio <td>Tag HA (C-terminal). Enzymes de restriction : EcoRI et XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin</td><td>&nbsp ; Gracieusement offert par le Dr Marcelo Dam&aacute ; </td><td></td><td>rio Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Enzymes de restriction : EcoRI et KpnI</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>Pour obtenir un 1x PBS, diluez le 10x PBS dans de l’eau ultrapure</td></tr><tr><td>Polyéthylénimine (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur à bascule</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>système SDS-PAGE</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur de solutions</td><td>Phoenix Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (TrypLe Express)</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Western Blotting Luminol</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase e3 dans les lysats de cellules de mammifères

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

L’ubiquitylation est une modification post-traductionnelle qui se produit dans les cellules eucaryotes et qui est essentielle à la régulation de plusieurs voies biologiques, y compris la survie, la prolifération et la différenciation cellulaires. Il s’agit d’un processus réversible qui consiste en une fixation covalente de l’ubiquitine au substrat par une réaction en cascade d’au moins trois enzymes différentes, composées de E1 (enzyme d’activation de l’ubiquitine), E2 (enzyme conjuguant l’ubiquitine) et E3 (enzyme ubiquitine-ligase). Le complexe E3 joue un rôle important dans la reconnaissance et l’ubiquitylation du substrat. Ici, un protocole est décrit pour évaluer l’ubiquitylation du substrat dans les cellules de mammifères en utilisant la co-transfection transitoire d’un plasmide codant pour le substrat sélectionné, une ligase d’ubiquitine E3 et une ubiquitine marquée. Avant la lyse, les cellules transfectées sont traitées avec l’inhibiteur du protéasome MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) pour éviter la dégradation protéasomique du substrat. En outre, l’extrait cellulaire est soumis à une immunoprécipitation (IP) à petite échelle pour purifier le substrat polyubiquitylé en vue d’une détection ultérieure par transfert western (WB) à l’aide d’anticorps spécifiques pour l’étiquette ubiquitine. Par conséquent, un protocole cohérent et simple pour le dosage de l’ubiquitylation dans les cellules de mammifères est décrit pour aider les scientifiques à traiter l’ubiquitylation de substrats spécifiques et les ligas d’ubiquitine E3.

L’UXT (transcription exprimée de manière ubiquitaire) est une protéine de type préfoldine qui forme des complexes de repliement des protéines exprimés de manière omniprésente dans les tissus murins et humains tels que le cœur, le cerveau, les muscles squelettiques, le placenta, le pancréas, les reins et le foie18. Deux isoformes d’épissage d’UXT, nommées UXT-V1 et UXT-V2, ont été décrites comme remplissant des fonctions et des emplacements subcellulaires distincts. L’UXT-V1 est principalement loca...

Nous fournissons un protocole détaillé pour un test d’ubiquitylation d’un substrat spécifique et d’une ubiquitine-ligase E3 dans des cellules de mammifères. Les lignées cellulaires HEK293T ont été utilisées pour la surexpression des protéines, le substrat polyubiquitylé a été purifié des lysats cellulaires par immunoprécipitation et résolu dans SDS-PAGE. L’immunoblotting a été utilisé pour visualiser cette modification post-traductionnelle.

Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Ce protocole permet d’évaluer l’ubiquitylation d’un substrat spécifique par une ligase E3. Nous savons que la caractérisation de l’interaction ligase-substrat est cruciale pour comprendre leur fonction dans les cellules. Cette technique ne nécessite pas de réactifs coûteux ou d’équipement sophistiqué.Il a besoin de plasmides et de codage des gènes d’intérêt, de développement d’un test d’immunoprécipitation avec des lysats cellulaires et d’un transfert western pour détecter l’ubiquitylation du substrat. Plusieurs maladies humaines comme le cancer et les troubles neurologiques sont associées à un dérèglement de la ligase E3. Par conséquent, l’identification de l’ubiquitylation du substrat par une ligase E3 spécifique pourrait aider à traiter ou à diagnostiquer ces maladies.La démonstration de la procédure sera faite par Valentine Spagnol. Pour commencer, cultivez la lignée cellulaire HEK293T jusqu’à une confluence de 80 à 90% dans le milieu Eagles modifié de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal et 100 unités de pénicilline, 100 microgrammes de streptomycine et 0,292 milligrammes par millilitres de L-glutamine. Ensuite, incubez cette culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5% de dioxyde de carbone.Passage des cellules en aspirant le milieu de la boîte de culture à l’aide d’une pipette sérologique et lavez-les une fois avec un millilitre de PBS 1X stérilisé. Ensuite, détachez les cellules en ajoutant un millilitre de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique de trypsine et après cinq minutes d’incubation à 37 degrés Celsius, remettez ces cellules en suspension dans deux millilitres de milieu de croissance à l’aide d’une pipette sérologique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube frais et propre de 15 millilitres et centrifuger à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, retirez doucement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans trois millilitres de milieu de croissance en pipetant de haut en bas pour obtenir une suspension cellulaire homogène. Ensuite, transférez un millilitre de cette suspension cellulaire dans une boîte de culture de 100 millimètres traitée par TC contenant neuf millilitres de milieu de croissance. Avant la transfection, certifier si les cellules sont exemptes de contamination et à une confluence adéquate pour les transfections transitoires.Pour chaque échantillon de transfection, préparer les complexes ADN-polyéthylèneimine en diluant trois microgrammes de chaque plasmide dans 100 microlitres de milieu sérique réduit Opti-MEM 1 sans supplémentation et en le mélangeant doucement en pipetant la solution de haut en bas. Ensuite, décongelez l’ADN-polyéthylèneimine à température ambiante et ajoutez-le dans la solution en suivant une proportion de trois microlitres d’ADN-polyéthylèneimine pour un microgramme d’ADN. Homogénéiser la solution en pipetant de haut en bas.Ensuite, incubez-le pendant 15 minutes à température ambiante pour permettre la formation de complexes ADN-polyéthylèneimine. Ajouter le volume total de complexes ADN-polyéthylèneimine à chaque plat contenant la culture cellulaire et mélanger doucement en berçant la plaque d’avant en arrière. Ensuite, incubez ces cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire humidifié.Après l’incubation et six heures avant la lyse cellulaire, traiter les cellules transfectées avec un inhibiteur du protéasome 10 micromolaires MG132 et incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire humidifié. Ensuite, aspirez le milieu de chaque boîte de culture à l’aide d’une pipette sérologique et lavez les cellules une fois avec un millilitre de 1X PBS. Ensuite, détachez les cellules en ajoutant un millilitre de trypsine et incubez le plat à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Resuspensez les cellules dans un millilitre de milieu de croissance et transférez la suspension cellulaire dans un microtube frais et propre de deux millilitres et centrifugez-la à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Une fois la centrifugation terminée, retirez le surnageant en le versant soigneusement et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon de lyse MP40 glacé complété par le cocktail d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase. Transférez ensuite cette solution dans un microtube propre de 1,5 millilitre.Incuber cette cellule lysat pendant 30 minutes sur de la glace, et après l’incubation, centrifuger la cellule lysats à 16 900 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Pendant ce temps, équilibrez les perles anti-HA d’agarose avec un tampon de lyse MP40 glacé. Utilisez 15 microlitres de perles anti-HA d’agarose pour chaque échantillon.Lavez les billes avec 200 microlitres de tampon de lyse MP40 en les pulsant dans un tube de microcentrifugation à 3 000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez et jetez soigneusement le surnageant avec une pipette et répétez ce processus trois fois. Ensuite, gardez les perles équilibrées sur de la glace jusqu’à utilisation.Après avoir centrifugé les lysats cellulaires, récupérer le surnageant et quantifier la teneur en protéines dans le lysat total en utilisant la méthode de Bradford pour s’assurer que chaque échantillon soumis à l’immunoprécipitation présente une quantité égale de protéines. Incuber le volume nécessaire de lysat cellulaire avec les billes anti-HA d’agarose équilibrées pendant quatre heures, en tournant doucement dans un incubateur rotatif à quatre degrés Celsius, ce qui permet à l’UXT-V2-HA de se lier aux billes anti-HA d’agarose. Recueillir les billes anti-HA d’agarose en les pulsant dans un tube de microcentrifugation à 3 000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius.Aspirer soigneusement et jeter le surnageant. Lavez les perles trois fois avec un tampon de lyse cellulaire MP40 glacé et deux fois avec un tampon FLAG HA glacé. Après le lavage final, retirez soigneusement tout le surnageant à l’aide d’une pipette et éluez la protéine poly-ubiquitylée avec 300 microgrammes par millilitre de peptide HA dilué sur le tampon FLAG HA.Incuber les billes anti-HA d’agarose avec du peptide HA pendant une heure à quatre degrés Celsius dans une plate-forme shaker à bascule. Ensuite, faites tourner les perles à 3 000 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius et retirez soigneusement le surnageant contenant les protéines poly-ubiquitinées. Si nécessaire, conservez l’éluant dans un microtube frais et propre à moins 20 degrés Celsius.Résoudre les éluants et les lysats cellulaires dans l’électrophorèse et l’immunoblotting en gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium à 10%. Pour effectuer un transfert humide Western blotting, placez le gel dans un sandwich de transfert composé de papier filtre, de papier filtre à membrane de gel, amortissez-le avec des tampons et pressez-le ensemble par une grille de support. Ensuite, placez ce système verticalement dans un réservoir rempli de tampon de transfert entre les électrodes en acier inoxydable ou en fil de platine.Le transfert se produit pendant 90 minutes à 150 volts dans un tampon de transfert humide. Enfin, sondez la membrane de l’immunoblot à l’aide d’anticorps anti-myc. La poly-ubiquitylation spécifique de l’UXT-V2-HA médiée par la protéine F-box 7 dans les cellules a été observée après avoir sondé l’éluant de l’immunoprécipitation anti-HA avec un anticorps anti-myc, qui détecte le myc-ub conjugué au substrat.La spécificité de l’anti-myc pour le substrat poly-ubiquitylé a été visualisée dans les voies un et deux, dans lesquelles un frottis de protéines poly-ubiquitylées n’a pas été détecté lorsque les cellules ont été co-transfectées avec la protéine F-box 7 et myc-ub en l’absence de plasmide UXT-V2-HA. De plus, aucun frottis correspondant à la poly-ubiquitination des protéines n’a été visualisé dans la combinaison de la protéine F-box 7 et de l’UXT-V2-HA sans le plasmide myc-ub. Lorsqu’un mutant de la protéine F-box 7 ou de la protéine F-box 7 de type sauvage à vecteur vide incapable d’assembler le SCF actif a été transecté en combinaison avec UXT-V2-HA et myc-ub, un fort signal de frottis d’UXT-V2 poly-ubiquitylé n’a été observé que pour la protéine F-box 7 de type sauvage, suggérant que l’UXT-V2 était poly-ubiquitylé par le complexe et les cellules de la protéine SCF F-box 7 par rapport aux témoins.Les étapes de monoprécipitation, y compris l’incubation des lysats cellulaires avec les billes équilibrées et l’élution des protéines immunoprécipitées, sont essentielles pour atteindre l’objectif de ce protocole. Après cette procédure, un test d’ubiquitylation in vitro doit être effectué pour confirmer la spécificité de l’ubiquitylation du substrat par la ligase E3.

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L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Des mutations de gènes impliqués dans cette modification sont associés à différentes pathologies humaines. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en...

La détection des protéines ubiquitination

Cette vidéo montre la méthode in vitro de SUMOylation des protéines de substrat à l’aide d’une cascade enzymatique séquentielle. De plus, l’état SUMOylé de la protéine est identifié à l’aide de la technique d’électrophorèse et d’immunobuvardage.

Dosage de SUMOylation : une technique in vitro pour détecter l’état de SUMOylation des protéines de substrat par immunobuvardage

Contrairement à l’ubiquitine ligases, quelques ligase E3 SUMO ont été identifiés. Ce modifié in vitro SUMOylation protocole est capable d’identifier de nouveaux SUMO E3 ligases par un essai de reconstitution in vitro .

In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans les processus cellulaires et est étroitement coordonnée par la désubiquitination. Les défauts dans les deux réactions sous-tendent les pathologies humaines. Nous fournissons des protocoles pour mener la réaction d'ubiquitination et de deubiquitination in vitro utilisant des composants purifiés.

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

L'objectif de ce manuscrit est de présenter un aperçu des études biochimiques et fonctionnelles complètes des ligases d'ubiquitine E3 de type RING. Ce pipeline en plusieurs étapes, avec des protocoles détaillés, valide une activité enzymatique de la protéine testée et démontre comment lier l'activité à la fonction.

Caractérisation fonctionnelle des ligases d'ubiquitine RING-Type E3 In Vitro et In Planta

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

La présente étude fournit des protocoles détaillés de dosage d’ubiquitylation in vitro pour l’analyse de l’activité catalytique de l’ubiquitine ligase E3. Les protéines recombinantes ont été exprimées à l’aide de systèmes procaryotes tels que la culture d’Escherichia coli.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

L’ubiquitination est un régulateur critique des fonctions intracellulaires des protéines. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat dans les cellules de mammifères et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination. La surexpression des protéines dans HEK293T cellules a été induite par transfection transitoire, et des protéines ubiquitinées ont été détectées par analyse western blot.

Stratégies comparatives pour la détection de l’ubiquitination dans les lysats cellulaires de mammifères en utilisant SMAD2/SMURF2 comme modèle

Ce protocole décrit une méthode pour ubiquitiner Streptococcus pneumoniae en utilisant un lysat cellulaire de mammifère ou un complexe enzymatique d’ubiquitine pur, suivie d’un traitement avec un complexe protéique VCP/p97-UFD1-NPLOC4 purifié afin d’évaluer son activité bactériolytique, permettant l’étude des effecteurs immunitaires dépendants de l’ubiquitine.

In-vitro Reconstitution de l’ubiquitination bactérienne et élimination médiatisée par VCP/p97

Découvrez comment évaluer l'ubiquitylation du substrat par une ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères. Cette méthode utilise des lignées HEK293T et l'immunoprécipitation pour étudier les interactions ligase-substrat impliquées dans le cancer et les troubles neurologiques.

Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères

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