Name: Imagerie de la migration des neutrophiles dans la peau de souris pour étudier le remodelage de la membrane subcellulaire dans des conditions physiologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez la microscopie sous-cellulaire intravitale pour visualiser le remodelage membranaire des neutrophiles en migration dans la peau de souris. Cette technique révèle les dynamiques de membrane en temps réel.

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Cette recherche a été soutenue par le programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

<ol><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
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<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Malgré des décennies de progrès dans le domaine de la migration cellulaire et du remodelage membranaire, très peu d’études ont utilisé l’IVM pour visualiser les caractéristiques subcellulaires chez les animaux vivants. Les procédures décrites dans ce protocole constituent un outil puissant pour obtenir de nouvelles connaissances sur la migration des neutrophiles chez les animaux vivants et plus particulièrement sur le remodelage de la membrane plasmique au cours de ce processus. Cette approche permet d’étudier la migration des neutrophiles dans des conditions physiologiques compte tenu de la complexité inhérente au microenvironnement tissulaire. En effet, l’utilisation du MPM permet de visualiser de multiples caractéristiques dans le tissu de l’hôte en utilisant une combinaison de souches de souris exprimant des marqueurs fluorescents sélectionnés, le marquage de tissus exogènes, l’excitation de la fluorescence endogène et les signaux générés par SHG ou THG12,13.
Un problème potentiel à prendre en compte dans cette procédure est les photodommages. Même si la MPM est généralement plus sûre que la microscopie confocale en ce qui concerne le photoblanchiment et la phototoxicité, des précautions doivent être prises lors de l’imagerie des tissus vivants34. La phototoxicité peut considérablement entraver les résultats en créant des artefacts d’imagerie allant de petites taches brillantes à de plus grandes zones de tissus endommagés, soit en inhibant/stimulant une variété de voies intracellulaires. Pour prévenir la phototoxicité, la puissance du laser doit être maintenue au minimum et les contrôles appropriés doivent être conçus pour vérifier que les conditions physiologiques sont maintenues (p. ex., mesure du débit sanguin, sondes de stress oxydatif)35,36. De plus, dans cette procédure spécifique, qui implique la peau, les souches albinos sont fortement recommandées car la mélanine présente chez les animaux à pelage foncé est plus sensible à la phototoxicité 36,37,38.
Parmi les principales limites de la procédure figurent le système de microscope utilisé et la nature des neutrophiles. Bien que l’utilisation du MPM augmente considérablement la profondeur de l’imagerie tissulaire par rapport à d’autres techniques de microscopie optique (par exemple, confocale, disque rotatif), la capacité de visualiser la dynamique subcellulaire dans l’oreille est limitée aux couches les plus externes du tissu (80-100 μm). Cela est dû à la diffusion intense de la lumière produite par l’épaisse couche ECM, ce qui rend difficile l’étude de la migration dans les couches plus profondes. Une autre limitation est le fait que les neutrophiles ont une durée de vie très courte et ne peuvent pas être conservés en culture assez longtemps pour effectuer des techniques d’édition de gènes. Cela peut être surmonté en manipulant des souris pour produire des neutrophiles dépourvus de gènes spécifiques ou hébergeant des mutations sélectionnées, ce qui augmente bien sûr les coûts et la durée de la recherche.
Les procédures décrites ici, bien qu’elles soient conçues pour étudier la dynamique membranaire, peuvent être adaptées pour répondre à toute question de biologie cellulaire, non seulement dans les neutrophiles, mais aussi dans d’autres types de cellules immunitaires et de cellules migratrices. Les informations recueillies par l’IVM à faible grossissement sur les comportements cellulaires (par exemple, le phénotype migratoire, la vitesse cellulaire et la directionnalité22) peuvent être complétées et corrélées avec des informations mécanistes acquises par ISMic sur le repositionnement des organites, la sécrétion de protéines, l’endocytose, la dynamique nucléaire, la dynamique du calcium, l’organisation du cytosquelette et la nétose. L’utilisation de manipulations pharmacologiques et/ou génétiques peut mettre en évidence le rôle de voies moléculaires spécifiques dans le processus d’intérêt, ce qui en fait une approche unique et très puissante.

La migration cellulaire dirigée est un événement critique qui se produit au cours de différents processus physiologiques et pathologiques, notamment le développement, la réponse immunitaire, la réparation des tissus et l’initiation, la progression et la dissémination de la tumeur 1,2. Ce processus repose sur des signaux chimiotactiques extracellulaires spécifiques détectés par leurs récepteurs apparentés au niveau de la membrane plasmique, puis traduits en signaux intracellulaires complexes. Ces voies, à leur tour, activent la migration cellulaire par le biais d’une série de réponses, notamment l’activation locale du cytosquelette, le trafic et le remodelage membranaires, et la polarisation cellulaire3. Deux types distincts de migration cellulaire ont été bien caractérisés : le mésenchymateux et l’amiboïde4. La migration mésenchymateuse est relativement lente (<1 μm/min), repose sur une forte adhésion entre les cellules et la matrice extracellulaire (MEC) et dépend de la dégradation de la matrice induite par les métalloprotéases. En revanche, la migration amiboïde, une caractéristique des cellules immunitaires qui réagissent rapidement aux signaux inflammatoires, est plus rapide (>10 μm/min) et utilise de faibles adhérences pour naviguer dans l’ECM. Quelle que soit la modalité, la migration cellulaire nécessite un remodelage constant de la membrane plasmique, ce qui entraîne la génération de structures protrusives au bord d’attaque des cellules, qui sont étroitement coordonnées avec la rétraction de la membrane à l’arrière1.
Pour démêler les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces processus subcellulaires, il est fondamental de visualiser la dynamique des membranes dans les cellules en migration à une résolution temporelle et spatiale appropriée. De plus, le remodelage membranaire étant fortement influencé par les propriétés du microenvironnement tissulaire entourant les cellules migratrices, il est crucial d’imager ce processus directement dans le tissu natif, au sein d’animaux vivants. Ceci est accompli en utilisant la microscopie intravitale (IVM)5. La toute première imagerie IVM a été réalisée il y a ~200 ans, lorsque l’extravasation des leucocytes a été visualisée à l’aide d’un simple microscope trans-illumination6 et par la suite, l’IVM a été utilisée principalement sur des organismes modèles semi-transparents, tels que le poisson zèbre et la drosophile 7,8. Au cours des deux dernières décennies, la MIV a été utilisée avec succès pour étudier les processus cellulaires chez les souris, les rats et les grands mammifères tels que les porcs 5,9. Cela a été rendu possible grâce à 1) des développements significatifs en microscopie confocale et multiphotonique (MP) et 2) à l’essor de la technologie d’édition de gènes telle que CRISPR-Cas9, qui a permis l’ingénierie rapide d’une variété de modèles animaux pour exprimer des protéines et des rapporteurs marqués par fluorescence. En outre, la visualisation des cellules individuelles et de leur microenvironnement au cours de processus tels que l’initiation tumorale, la migration cellulaire et la réponse immunitaire a été rendue possible par d’autres formes de marquages exogènes, telles que l’introduction systémique de colorants pour marquer le systèmevasculaire10,11, et l’excitation de molécules endogènes, telles que le collagène par génération de seconde harmonique (SHG)10, 12 et les fibres nerveuses par génération de troisième harmonique (THG)11,13. Enfin, une amélioration des techniques pour minimiser les artefacts de mouvement dus au rythme cardiaque et à la respiration a conduit au développement de la microscopie subcellulaire intravitale (ISMic), qui a permis aux chercheurs d’imager et d’étudier plusieurs événements subcellulaires directement chez des animaux vivants à un niveau de résolution similaire à ceux observés in vitro 14,15,16,17 . Parmi les exemples d’ISMic, citons l’étude de la dynamique du cytosquelette pendant l’exocytose 14,15,16,17 et l’endocytose15, le remodelage dynamique du cytosquelette pendant la migration cellulaire17,18, la localisation et le métabolisme mitochondriaux19,20 et la signalisation calcique dans le cerveau 21.
Ce protocole détaille les différentes étapes et procédures permettant d’étudier le remodelage de la membrane cellulaire à une résolution subcellulaire lors de la migration des neutrophiles dans la peau de l’oreille d’une souris vivante à l’aide d’ISMic. Cette approche est basée sur les protocoles22,23 décrits précédemment et adaptée pour obtenir une résolution spatiale et temporelle plus élevée.

<table><tbody><tr><td>Tubes de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de 27 G</td><td>Kendall</td><td>827112</td><td></td></tr><tr><td>27 G Set de perfusion à ailettes</td><td>Terumo</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 30x</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1,05 NA, </td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO40XS</td><td>1.23 NA, Insert à l’huile de silicone</td></tr><tr><td>60 mm Falcon</td><td></td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 6 mL</td><td>Kendall</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>Acépromazine (10 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse ACK</td><td>Qualité Biologique</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>ET</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Crépine à cellules 40 &micro ; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td>Logiciel de visualisation/analyse d’images</td></tr><tr><td>Logiciel Fluoview Software</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Logiciel d’acquisition</td></tr><tr><td>FVB souris</td><td>souche Jackson</td><td>N/A</td><td>Fvb</td></tr><tr><td>background Gas Anesthesia system</td><td>Patterson veterinary</td><td>07-8915712</td><td>Link 7 model</td></tr><tr><td>Green Cell tracker</td><td>Thermo</td><td>C2925</td><td>Solubilisé en culture cellulaire grade DMSO pour atteindre une concentration de 1 mM (1000x)</td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (sans Ca2+, Mg2+)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M pH 7.3</td><td>Qualité Biologique</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Logiciel de visualisation/analyse d’images</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>généré en laboratoire</td><td>N/A</td><td>C57BL/6J arrière-plan</td></tr><tr><td>Micromanipulateur manuel</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MatWorks</td><td>N/A</td><td>Logiciel d’analyse</td></tr><tr><td>mtomato souris strain</td><td>générée en laboratoire</td><td>N/A</td><td>mT/mG, FVB background</td></tr><tr><td>Multiphoton</td><td>laser Spectra Physics</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton Microscope</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 10 &micro ; Seringue L</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33 G aiguille</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage d’objectif</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de chauffage d’objectif</td><td>Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Major</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur d’oxygène</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sans Ca2+, Mg2+)</td><td>Qualité Biologique</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Qualité Biologique</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage de scène</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de chauffage de scène</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>Ruban chirurgical</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Pilote de seringue</td> hypoallergénique <td>Appareil Harvard</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Coussins chauffants</td><td>Parkland Scientific</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>Pompe chauffante</td><td>Parkland Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/mL)</td><td>Vet</td><td>one 13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie de la migration des neutrophiles dans la peau de souris pour étudier le remodelage de la membrane subcellulaire dans des conditions physiologiques

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

L’étude du recrutement et de la fonction des cellules immunitaires dans les tissus a été un domaine très actif au cours des deux dernières décennies. Les neutrophiles sont parmi les premières cellules immunitaires à atteindre le site de l’inflammation et à participer à la réponse immunitaire innée lors d’une infection ou d’une lésion tissulaire. Jusqu’à présent, la migration des neutrophiles a été visualisée avec succès à l’aide de divers systèmes expérimentaux in vitro basés sur une stimulation uniforme, ou une migration confinée sous agarose, ou canaux micro-fluidiques. Cependant, ces modèles ne récapitulent pas le microenvironnement complexe que rencontrent les neutrophiles in vivo. Le développement de techniques basées sur la microscopie multiphotonique (MPM), telles que la microscopie subcellulaire intravitale (ISMic), offre un outil unique pour visualiser et étudier la dynamique des neutrophiles à des résolutions subcellulaires dans des conditions physiologiques. En particulier, l’oreille d’une souris anesthésiée vivante offre un avantage expérimental pour suivre la migration interstitielle des neutrophiles en temps réel en raison de sa facilité d’accès et de l’absence d’exposition chirurgicale. ISMic fournit la résolution optique, la vitesse et la profondeur d’acquisition nécessaires pour suivre les processus cellulaires et, plus important encore, subcellulaires en 3D au fil du temps (4D). De plus, l’imagerie multimodale du microenvironnement interstitiel (c’est-à-dire les vaisseaux sanguins, les cellules résidentes, la matrice extracellulaire) peut être facilement réalisée en utilisant une combinaison de souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents sélectionnés, un marquage exogène via des sondes fluorescentes, une fluorescence intrinsèque tissulaire et des signaux générés par la seconde/troisième harmonique. Ce protocole décrit 1) la préparation des neutrophiles pour le transfert adoptif dans l’oreille de la souris, 2) différents paramètres pour une imagerie subcellulaire optimale, 3) des stratégies pour minimiser les artefacts de mouvement tout en maintenant une réponse physiologique, 4) des exemples de remodelage membranaire observé dans les neutrophiles à l’aide d’ISMic, et 5) un flux de travail pour l’analyse quantitative du remodelage membranaire dans les neutrophiles en migration in vivo.

Ici, deux ensembles de résultats différents sont présentés pour illustrer l’IVM classique et l’ISMic qui fournissent respectivement une résolution cellulaire et subcellulaire. Dans le premier exemple, les neutrophiles ont été purifiés à partir d’une souris de type sauvage (WT), marqués avec Cell Tracker Green pour colorer le cytoplasme, et injectés dans une souris transgénique exprimant une protéine fluorescente ciblant la membrane plasmique (souris mTomato, également connue sous le nom de mT/mG33, Figure 1 et Movie 1 et Movie 2). Cette souris receveuse a permis de visualiser des caractéristiques structurelles dans le tissu de l’oreille telles que les vaisseaux sanguins, les cellules résidentes et les follicules pileux (Figure 1C et Vidéo 1) via une approche basée sur la MIV (étape 6.8.1). Les fibres de collagène, révélées par SHG (détecté à la moitié de la longueur d’onde de l’excitation), ont été disposées en un réseau complexe dans le derme, où les neutrophiles ont été injectés. Le long du bord des follicules pileux (HF), une couche de cellules épithéliales (c’est-à-dire des kératinocytes) a été observée. Parfois, des artefacts provenant de poils résiduels entraînant une dépression locale de la peau ont été visualisés (H). Les lésions induites par le laser ont été facilement visualisées en raison de leur forte auto-fluorescence détectée dans tous les canaux et par les altérations de l’arrangement du collagène (Figure 1D). Une vue plus complète de l’architecture 3D de la peau et de la localisation des neutrophiles injectés peut être appréciée dans la vidéo 1, qui dépeint un empilement Z de la peau des couches externe à interne et un rendu de volume 3D. L’imagerie en accéléré a montré que les neutrophiles échantillonnaient la peau de l’oreille et interagissaient avec l’ECM et le tissu de l’hôte (vidéo 2). L’imagerie à cette résolution et l’acquisition d’une pile Z toutes les 30 s permettent d’effectuer le suivi des cellules et la mesure des paramètres de motilité (c’est-à-dire la vitesse et la directionnalité), mais une analyse précise et détaillée du remodelage de la membrane est difficile à cette résolution.
Dans le deuxième exemple, le remodelage membranaire a été évalué via l’approche ISMic (étape 6.8.2) à l’aide de neutrophiles exprimant mGFP purifiés à partir de souris LyzM-cre mT/mG et injectés dans des animaux WT (Figure 2A, organigramme expérimental). À l’aide du protocole ISMic (vidéo 3 et images fixes de la figure 2B) et lors d’une lésion laser, un remodelage dynamique de la membrane plasmique est observé pendant la migration, et la formation de saillies membranaires sur le bord d’attaque et la rétraction de l’arrière des cellules sont clairement visualisées (figure 2 et vidéo 3). Les séquences en accéléré mises en évidence dans le film 3 révèlent la complexité des interactions avec l’ECM. En effet, les neutrophiles migrent dans l’espace interstitiel en se déplaçant soit le long des fibres, soit dans les espaces entre elles. Enfin, des aspects quantitatifs tels que les changements de courbure et les changements de surface à l’avant et à l’arrière des cellules ont été quantifiés pour chaque point temporel. En utilisant la cellule décrite dans la figure 2B à titre d’exemple, la dynamique locale de la membrane plasmique a été analysée à l’aide d’un pipeline algorithmique (voir étape 7) basé sur l’identification de 100 points limites sous-jacents à la surface de la cellule (Figure 3A). Les changements dans la courbure locale (figure 3B) et dans la zone soulignée par les protubérances de la membrane plasmique (figure 3C) ont été calculés pour chaque point limite et rapportés pour chaque période sous forme de kymographes (figure 3D, E). L’avant et l’arrière des cellules conservent une courbure plus élevée que le côté des cellules (Figure 3D) ; Les changements de zone négatifs (rétractions, régions bleues) sont plus apparents à l’arrière des cellules qu’au bord d’attaque où les changements de zone positifs sont plus importants (protubérances, régions rouges) (Figure 3E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg"> Figure 1 : MIV des neutrophiles dans la peau de l’oreille de souris. (A) Schéma de l’installation de l’oreille sur la platine du microscope. (B) Organigramme expérimental. (C) Image représentative de la peau de l’oreille d’une souris mTomato injectée avec des neutrophiles marqués par fluorescence, avec différentes projections. Follicule pileux (HF), vaisseau sanguin (VB), épiderme (E), derme (D), couche de cellules basales (BCL) et artefact pileux (en raison d’un poil résiduel à la surface de la peau, H). (D) Image représentative de la peau d’une souris après une lésion au laser stérile : canal bleu (à droite), canaux vert et rouge (au milieu), image fusionnée (à gauche). Une lésion est visible à gauche de l’image par une forte émission d’autofluorescence dans les canaux vert et rouge ainsi qu’une perturbation de l’ECM observée par la formation d’un trou dans les fibres de collagène-I. En C et D, en vert : neutrophiles ; Rouge : tissu hôte de la souris ; Cyan : Collagène-I SHG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg"> Figure 2 : Time-lapse de la migration d’un neutrophile mGFP dans l’oreille d’une souris WT. (A) Organigramme expérimental. (B) Images fixes représentatives du film 3. (C) Rendu volumique de la même cellule pour visualiser l’organisation 3D de la membrane. La zone de haute dynamique membranaire est illustrée par une flèche (rouge pour la rétraction et bleue pour la saillie). (D) Visualisation en gros plan et inclinée du volume de la cellule rendue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg"> Figure 3 : Pipeline d’analyse pour la quantification de la dynamique membranaire collecté à l’aide d’ISMic. (A) Détermination du contour cellulaire et répartition des points limites (100 points limites) entre deux trames consécutives pour les neutrophiles mGFP décrits à la figure 2B. (B) Les limites colorées représentent la courbure locale de la membrane déterminée pour chaque point limite. (C) Changements de zone locale entre deux images consécutives (actuelle : bleue, et suivante : rouge). Les zones vertes représentent les résultats de suivi du mouvement local de la membrane. Les flèches jaunes indiquent la direction générale du déplacement de la membrane. (D) Kymographe de la courbure des limites de la cellule au fil du temps. L’axe vertical représente les indices des points limites, où 1 et 100 représentent l’arrière de la cellule en fonction de sa direction de migration. (E) Kymographe de changement d’aire locale reflétant la saillie de la membrane (rouge) et la rétraction de la membrane (bleu) de la cellule au fil du temps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Vidéo 1 : Visualisation de neutrophiles marqués en vert dans l’oreille d’une souris mTomato à l’aide de la MIV. Rouge : Tissu de souris hôte mTomato. Cyan : Collagène-I SHG ; Vert : neutrophile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>
Vidéo 2 : MIV de neutrophiles migrant dans la peau d’une oreille de souris mTomato. Les vidéos sont des projections d’intensité maximale d’une pile d’images acquises pendant 27 minutes avec une fréquence d’images de 5 images/s. Rouge : Tissu de souris hôte mTomato. Cyan : Collagène-I SHG ; Vert : neutrophile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>
Vidéo 3 : ISMic du remodelage membranaire lors de la migration des neutrophiles dans une oreille de souris WT. Les vidéos sont des projections d’intensité maximale d’une pile d’images acquises pendant 8 min avec une fréquence d’images de 10 images/s. Rouge : Tissu de souris hôte mTomato. Cyan : Collagène-I SHG ; Vert : mGFP neutrophile ; Vert clair : neutrophiles rendus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>

La migration des neutrophiles repose sur le remodelage rapide et continu de la membrane plasmique en réponse au chimioattractant et à ses interactions avec le microenvironnement extracellulaire. Il s’agit d’une procédure basée sur la microscopie subcellulaire intravitale pour étudier la dynamique du remodelage membranaire dans les neutrophiles injectés dans l’oreille de souris anesthésiées.

Imagerie de la migration des neutrophiles dans la peau de souris pour étudier le remodelage de la membrane subcellulaire dans des conditions physiologiques

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Cette méthode décrit une technique permettant d’étudier le remodelage membranaire pendant la migration des neutrophiles chez l’animal vivant à l’aide de la microscopie subcellulaire intravitale. Ce protocole offre une approche unique pour étudier la dynamique membranaire pendant la migration animale dans des conditions physiques, et pour ne pas impliquer le microenvironnement tissulaire. Cette technique peut être adaptée pour traiter le remodelage membranaire et le cytosquelette, le repositionnement dynamique des organes et le trafic membranaire dans différents types de cellules et de cellules migratrices.Pour commencer, ajoutez le colorant fluorescent vert à la suspension de neutrophiles, purifié de la souris de type sauvage dans 1,5 millilitre de tube recouvert de BSA. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante sous une légère agitation dans un rotateur de tube. Effectuez trois lavages à l’aide de HBSS, suivis d’une centrifugation à 400 fois G à température ambiante pendant cinq minutes, et de la remise en suspension de la pastille dans une solution saline équilibrée Hanks d’un millilitre.Placez cette suspension dans le tube revêtu de BSA dans un rotateur de tube sous une légère agitation jusqu’à la procédure d’injection. Avant l’injection, remettre en suspension la pastille cellulaire dans une solution saline pour atteindre une densité de 2 à 5 millions de cellules par 20 microlitres. Transférez l’animal anesthésié dans un coussin chauffant à 37 degrés Celsius pour maintenir sa température corporelle.Après avoir testé le réflexe de retrait de la patte, retirez les poils de l’oreille à l’aide d’une tondeuse fine pour optimiser la qualité de l’image. Placez l’animal sur le côté, tenez le bord de l’oreille et aplatissez-le le long du coussin chauffant à l’aide du ruban chirurgical, puis remplissez une seringue équipée d’une aiguille de calibre 33 avec la suspension des neutrophiles et montez-la sur un micromanipulateur. Déplacez doucement l’aiguille vers l’oreille et percez lentement la peau.Une fois que l’aiguille est à l’intérieur de la peau, poussez lentement le piston et délivrez deux à trois microlitres de suspension cellulaire. Après avoir soigneusement répété l’injection pour deux à trois zones différentes de l’oreille, retirez soigneusement le ruban chirurgical et laissez l’animal reprendre conscience sous surveillance. Laissez l’animal se reposer pendant une heure avant l’imagerie pour permettre aux tissus et aux cellules de se remettre de la procédure d’injection.Assurez-vous que le microscope est allumé et que la platine et les lentilles sont préchauffées à 37 degrés Celsius avant de placer l’animal anesthésié sur la platine du microscope. Couvrez le trou dans la scène avec une lamelle en verre. Déplacez l’animal anesthésié sur la scène avec précaution.Si l’imagerie est prévue pendant plus d’une heure, appliquez la pommade ophtalmique et fixez le système de perfusion à perfusion ailée. Placez une goutte de solution saline au centre de la lamelle et placez l’oreille injectée de neutrophiles par-dessus. Aplatissez doucement l’oreille à l’aide d’un coton-tige stérile au centre de la lamelle pour éliminer les poches d’air.Fixez l’oreille en appuyant doucement un bâton en bois sur le côté de l’oreille plus près de la tête de l’animal et en le verrouillant à l’aide de ruban adhésif. Trouvez ensuite une zone d’intérêt à l’aide de l’oculaire du microscope et passez en mode d’acquisition multiphotonique. Réglez la longueur d’onde d’excitation laser sur 900 à 930 nanomètres pour permettre l’acquisition simultanée de colorant fluorescent vert, de mTomato et de collagène-I.Réglez ensuite l’ensemble approprié de miroirs et de combinaisons de filtres sur les détecteurs pour collecter la lumière émise. Déterminez le paramètre le plus approprié à la configuration matérielle. Même si les cellules en migration peuvent être suivies avec des intervalles de 30 secondes à une minute, imagez les événements subcellulaires avec une vitesse plus élevée, d’au moins moins moins dix secondes d’intervalle.Dans l’approche classique de la microscopie intravitale, utilisez un objectif 30X et un scanner Galvo d’une taille d’image de 512 par 512 pixels pour suivre la migration cellulaire et étudier le tissu de la souris hôte, et réglez le déplacement de l’axe Z à l’aide de la platine motorisée avec une taille de pas de deux micromètres pour permettre l’imagerie d’un volume de 30 micromètres de profondeur toutes les 30 secondes. Dans l’approche de microscopie subcellulaire intravitale, utilisez une lentille 40X et un scanner de résonance avec une moyenne de trois fois pour imager le remodelage membranaire hautement dynamique à un grossissement et une résolution plus élevés. Réglez également le déplacement de l’axe Z à l’aide d’un piézo d’une taille de pas d’un micromètre, permettant une imagerie de volume profond de 20 micromètres toutes les quatre à cinq secondes.Induire une lésion laser stérile pour déclencher la migration des neutrophiles en focalisant un laser d’excitation de haute puissance sur une zone étroite de 20 par 20 micromètres pendant 10 secondes. Identifiez les lésions induites par le laser par ses puissants signaux autofluorescents apparaissant dans tous les canaux, et par l’altération de l’arrangement du collagène qui en résulte. Enregistrez les données à la fin de l’expérimentation pour des analyses plus approfondies.La souris réceptrice a permis de visualiser les caractéristiques structurelles du tissu de l’oreille telles que les vaisseaux sanguins, les cellules résidentes et les follicules pileux via une approche basée sur la microscopie intravitale. Les lésions induites par le laser ont été facilement visualisées en raison de leur forte autofluorescence détectée dans tous les canaux, et par les altérations de l’arrangement du collagène. Une vue complète de l’architecture tridimensionnelle de la peau et de la localisation des neutrophiles injectés représente un empilement Z de la peau des couches externe aux couches internes dans un rendu volumique tridimensionnel.L’imagerie en accéléré a montré que les neutrophiles échantillonnaient la peau de l’oreille et interagissaient avec la matrice intracellulaire et le tissu hôte. À l’aide de la microscopie subcellulaire intravitale, le remodelage dynamique de la membrane plasmique pendant la migration, la formation de saillies membranaires sur le bord d’attaque et la rétraction de l’arrière des cellules sont clairement visualisés. Les séquences time-lapse révèlent la complexité des interactions avec la matrice intracellulaire.La dynamique locale de la membrane plasmique a été analysée à l’aide d’un pipeline algorithmique basé sur l’identification de 100 points limites sous-jacents à la surface de la cellule. Les changements dans la courbure locale et la zone soulignée par les saillies de la membrane plasmique ont été calculés pour chaque point limite et rapportés pour chaque période sous forme de kymographes. L’avant et l’arrière des cellules conservent une courbure plus élevée que le côté des cellules.Les changements de zone négatifs sont plus apparents à l’arrière des cellules qu’au bord d’attaque, où les changements de zone positifs sont plus proéminents. Après l’imagerie, les tissus peuvent être collectés, fixés et traités pour la coloration afin d’évaluer davantage la cible d’intérêt et d’élucider les mécanismes. Cette procédure, conçue pour imager la dynamique membranaire, peut être adaptée pour répondre à des questions plus larges de biologie cellulaire dans différents types de cellules et de cellules migrantes dans leurs environnements respectifs.

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Découvrez la microscopie sous-cellulaire intravitale pour visualiser le remodelage membranaire des neutrophiles en migration dans la peau de souris. Cette technique révèle les dynamiques de membrane en temps réel.

Imagerie de la migration des neutrophiles dans la peau de souris pour étudier le remodelage de la membrane subcellulaire dans des conditions physiologiques (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie de la migration des neutrophiles dans la peau de souris pour étudier le remodelage de la membrane subcellulaire dans des conditions physiologiques

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