Évaluation d’un biomarqueur fiable dans un modèle murin de septicémie induit par ligature et ponction
9 décembre 2022
Ce protocole présente les détails opératoires de la ligature et de la ponction des cæcaux (CLP) dans un modèle murin de septicémie. CLP est l’une des techniques les plus largement utilisées pour créer un modèle animal de septicémie. Par conséquent, un protocole CLP normalisé est nécessaire pour obtenir des résultats de recherche fiables.
L’objectif principal de cette étude est d’utiliser un modèle murin de ligature des cæcaux et de la septicémie induite par ponction pour évaluer un biomarqueur sanguin fiable de la septicémie. La ligature et la ponction des cæcales, ou CLP en abrégé, est un modèle cliniquement pertinent de septicémie. CLP est un modèle couramment utilisé dans la recherche sur la septicémie.
L’histone citrullinée H3, ou CitH3, provient de la NETosis induite par la septicémie. Notre étude précédente démontre que CitH3 est un biomarqueur diagnostique fiable de la septicémie. Sélectionnez les souris C57BL/6 mâles.
Peser la souris et anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane à 1,5%. Fixez la souris sur un coussin chauffant. Appliquez une crème dépilatoire sur l’abdomen et ne laissez pas plus d’une minute avant de retirer la crème et les cheveux.
Préparer des instruments chirurgicaux stériles adaptés à la chirurgie des rongeurs. Désinfectez la peau abdominale avec de l’iode au moins trois fois. Couvrez la zone chirurgicale opératoire avec la draperie chirurgicale stérile appropriée.
Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour faire une incision d’environ deux centimètres dans la paroi abdominale, le long de la linea alba. Identifier et isoler le caecum hors de la cavité péritonéale avec une pince à épiler stérile. Ligate 75 volume du caecum avec suture de soie 4-0.
Ne ligaturez pas les vaisseaux sanguins mésentériques. À noter, un pourcentage différent de caecum ligaturé détermine la gravité de la septicémie. 25 % conduit à une septicémie de bas grade, 50 % conduit à la septicémie de grade moyen et 75 % conduit à une septicémie de haut grade.
Percer le caecum par une perforation traversante avec une aiguille de calibre 21 au milieu entre l’extrémité de la queue et la ligature. Pressez doucement les matières fécales hors du caecum par des trous de pénétration. À noter, la quantité de matières fécales pressées dans la cavité péritonéale doit être constante, car les matières fécales déterminent également la gravité de la septicémie.
Replacez doucement le caecum ainsi que les matières fécales dans la cavité abdominale. Fermez la couche musculaire abdominale et la couche de peau avec une suture de soie 6-0. Désinfectez l’incision avec de l’iode.
L’injection de kétoprofène, cinq milligrammes par kilogramme, doit être effectuée sur le quadrant inférieur gauche de l’abdomen pour éviter le caecum. Placez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à récupération complète. La souris est logée dans une pièce à température contrôlée et a libre accès à la nourriture et à l’eau.
Les animaux seront euthanasiés par surdose de dioxyde de carbone avec des symptômes de septicémie, pertinents pour nos critères d’évaluation prédéfinis basés sur notre étude présentée. Les souris sont divisées au hasard en groupe placebo, groupe CLP et groupe de traitement CLP plus Cl-amidine ou YW3-56. Les souris du groupe simulé reçoivent toutes les procédures CLP, à l’exception de la ligature du caecum et de la ponction.
Prélever le sang périphérique 24 heures après l’opération et préparer le sérum par centrifugation. La concentration de CitH3 a été déterminée par transfert Western et un kit ELISA développé par l’unité. Comme le montre la figure deux, aucun CitH3 n’a été détecté dans le groupe fictif.
Les taux de CitH3 étaient élevés après l’insertion de CLP, ce qui a été atténué par l’inhibition de la PAD de manière significative. Sur la base de nos données, nous concluons que le CitH3 circulant est un biomarqueur diagnostique fiable de la septicémie.
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Aperçu
Ce protocole présente les détails opératoires de la ligature et perforation du caecum (CLP) dans un modèle murin de sepsie. La CLP est l'une des techniques les plus couramment utilisées pour créer un modèle animal de sepsie, ce qui nécessite un protocole standardisé afin d'obtenir des résultats de recherche fiables.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Recherche sur la septicémie
Contexte
- La ligature et la perforation du caecum (CLP) constituent un modèle cliniquement pertinent du sepsis.
- La CLP est couramment utilisée dans la recherche sur le sepsis.
- Des biomarqueurs fiables sont essentiels au diagnostic du sepsis.
- L'histone H3 citrullinée (CitH3) est associée à la NETose induite par le sepsis.
Objectif de l'étude
- Évaluer des biomarqueurs sanguins fiables de la sepsie à l'aide d'un modèle murin.
- Mettre en place un protocole CLP normalisé afin d'assurer la cohérence des recherches.
- Étudier le potentiel diagnostique de la CitH3 dans la sepsie.
Méthodes utilisées
- Sélection de souris mâles C57BL/6 pour l'étude.
- Induction d'un état de sepsie par ligature et ponction du cæcum.
- Évaluation des biomarqueurs sanguins après l'induction.
- Comparaison des niveaux de CitH3 pour évaluer la fiabilité diagnostique.
Résultats principaux
- Démonstration de la CitH3 comme biomarqueur diagnostique fiable.
- Protocole CLP standardisé produisant des résultats cohérents.
- Identification de la NETose induite par le sepsis dans le modèle.
- Validation du modèle murin pour les futures recherches sur le sepsis.
Conclusions
- Le modèle CLP est efficace pour l'étude du sepsis.
- La CitH3 constitue un biomarqueur prometteur pour le diagnostic du sepsis.
- Les protocoles standardisés améliorent la fiabilité de la recherche.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Des biomarqueurs précoces fiables sont essentiels pour réduire les risques dans la découverte de médicaments contre la septicémie et assurer une continuité translationnelle entre les modèles précliniques et la recherche clinique. Le modèle murin induit par CLP, combiné à la mesure quantitative de la CitH3, fournit une plateforme standardisée pour la validation ciblée et l'analyse mécanistique de la septicémie. Cette approche renforce la confiance prédictive et permet le tri des portefeuilles à des points critiques du processus de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet de tester rigoureusement des hypothèses sur la physiopathologie du sepsis à l’aide d’un modèle animal cliniquement pertinent.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles en quantifiant la CitH3 comme biomarqueur mécanistique de la NETose.
- Facilite la réduction des risques biologiques et la priorisation des cibles candidates en vue de développements ultérieurs.
Développement de tests et criblage
- Offre un système reproductible pour évaluer les thérapeutiques candidates ciblant les mécanismes du sepsis.
- Standardise la quantification des biomarqueurs grâce à des dosages ELISA et des immunotransferts western validés pour la CitH3.
- Permet une comparaison fiable des effets des interventions entre les groupes expérimentaux.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats des biomarqueurs précliniques avec les besoins diagnostiques cliniques pour le sepsis.
- Permet une continuité entre les découvertes issues des modèles animaux et les stratégies translationnelles de biomarqueurs chez l'humain.
- Réduit le risque de translation en établissant des critères d'évaluation solides et pertinents par rapport à la maladie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce modèle et ce flux de travail sur les biomarqueurs combinent la découverte précoce, l'identification de candidats thérapeutiques et la validation préclinique dans la recherche sur la septicémie.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses mécanistiques et l'élucidation des voies impliquées dans la NETose induite par la septicémie.
- Essais : Fournit des mesures quantitatives de la CitH3 pour le développement normalisé de tests et l'évaluation de composés.
- Analytique : Assure des mesures reproductibles de biomarqueurs afin de comparer l'efficacité des interventions et la gravité de la maladie.
- Recherche translationnelle : Facilite l'harmonisation des données précliniques de biomarqueurs avec les stratégies diagnostiques cliniques.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme normalisée et réutilisable pour la recherche continue sur la septicémie et l'évaluation thérapeutique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles de la septicémie.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation entre les équipes de recherche et les études.
- Valeur stratégique : Permet une meilleure prise de décision « aller/ne pas aller » et une utilisation plus efficace des capitaux en rendant possible un triage précoce guidé par des biomarqueurs.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et la progression des programmes contre la septicémie ajustées au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie animale, développement de tests de biomarqueurs et analyse quantitative.
- Suppose l'accès à des kits ELISA validés, à une infrastructure pour le western blot et à des installations animales standardisées.
- Exige une standardisation rigoureuse entre équipes des paramètres de la procédure CLP et des protocoles de mesure des biomarqueurs.
- L'adaptation à d'autres modèles de maladies ou espèces peut nécessiter une optimisation et une validation du protocole.
- Les limites incluent la variabilité du modèle selon la technique chirurgicale et la nécessité de critères d'aboutissement cohérents.
