Name: Système de culture tridimensionnel sans sérum pour cellules souches de la glande lacrymale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Découvrez une méthode de culture sans sérum pour enrichir les cellules souches de la glande lacrymale chez la souris BALB/c. Ce protocole permet leur expansion à long terme et leur différenciation en cellules acineuses et ductales pour la régénération tissulaire.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 31871413) et deux programmes de science et technologie du Guangdong (2017B020230002 et 2016B030231001). Nous sommes vraiment reconnaissants aux chercheurs qui nous ont aidés pendant l’étude et aux membres du personnel travaillant dans le centre animalier pour leur soutien dans les soins aux animaux.

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
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<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
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<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Il existe des méthodes bien établies pour l’isolement et la culture in vitro de cellules souches lacrymales pour la culture de cellules souches lacrymales et la réparation des lésions LG. Shatos et al.17 et Ackermannet al. 6 cellules souches lacrymales cultivées et sous-cultivées avec succès de rats et de souris par des méthodes de culture 2D, respectivement, permettant de transplanter des cellules souches lacrymales pour le traitement de l’ADD. Des études...

Les cellules souches des glandes lacrymales (LGSC) maintiennent le renouvellement cellulaire des glandes lacrymales (LG) et sont la source de cellules acineuses et canalaires. Par conséquent, la transplantation de LGSC est considérée comme une approche alternative pour traiter les lésions inflammatoires graves et la sécheresse oculaire aqueusement déficiente (ADD)1,2,3. Plusieurs méthodes de culture ont été appliquées pour enrichir les LGSC. Tiwari et al. ont séparé et cultivé des cellules LG primaires à l’aide de collagène I et de gel matriciel complété par plusieurs facteurs de croissance; cependant, les cellules LG n’ont pas pu être cultivées en continu4. En utilisant une culture bidimensionnelle (2D), des cellules souches dérivées de LG de souris ont été isolées par You et al.5 et Ackermann et al. 6, qui exprime les gènes marqueurs des cellules souches /progénitrices, Oct4, Sox2, Nanog et nestin, et pourrait être sous-cultivé. Cependant, il n’y a pas d’indication claire que ces cellules peuvent se différencier en cellules acineuses ou canalaires, et il n’y a pas d’expérience de transplantation pour vérifier le potentiel de différenciation in vivo.
Récemment, des cellules c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- ont été isolées à partir de LG de souris par cytométrie en flux, s’exprimant des marqueurs de cellules progénitrices LG, tels que Pax6 et Runx1, et différenciées en canaux et acini in vitro. Chez les souris atteintes d’ADD, l’injection orthotopique avec ces cellules pourrait réparer les LG endommagés et restaurer la fonction sécrétoire des LG2. Cependant, le nombre de cellules souches isolées par cette méthode était faible et il n’existe pas de conditions de culture appropriées pour l’expansion des LGSC isolés. En résumé, un système de culture approprié doit être mis en place pour isoler et cultiver efficacement les LGSC adultes avec une expansion stable et continue pour l’étude des LGSC dans le traitement de l’ADD.
Les organoïdes dérivés de cellules souches ou de cellules souches pluripotentes sont un groupe de cellules qui sont histologiquement similaires aux organes apparentés et peuvent maintenir leur propre renouvellement. Après que l’organoïde de l’intestin de souris a été cultivé avec succès par Sato et al. en 20097, des organoïdes d’autres organes ont été cultivés successivement, sur la base du système de culture de Sato, tels que la vésicule biliaire8, le foie9, le pancréas10, l’estomac11, le sein12, le poumon13, la prostate14 et la glande salivaire15 . En raison de la forte proportion de cellules souches adultes avant la différenciation cellulaire en culture organoïde, la méthode de culture organoïde tridimensionnelle (3D) est considérée comme optimale pour l’isolement et la culture de cellules souches adultes de LG.
Un système de culture LGSC de souris adultes a été établi dans la présente étude en optimisant la méthode de culture 3D sans sérum. Il est prouvé que les LGSC cultivés à partir de souris normales et ajoutées ont montré une capacité stable d’auto-renouvellement et de prolifération. Après la transplantation dans les LG de souris ADDED, les LGSC ont colonisé les LG altérés et amélioré la production de larmes. De plus, des LGSC fluorescents rouges ont été isolés à partir de souris ROSA26mT/mG et cultivés. Ce travail fournit une référence fiable pour l’enrichissement en LGSC in vitro et l’autogreffe LGSC en application clinique pour la thérapie ADDED.

<table><tbody><tr><td>Animal(Souris)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal B/C</td><td>Centre de recherche sur les animaux modèles de l’Université</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Centre d’animaux de laboratoire de l’Université</td><td></td><td></td>Sun Yat-sen</tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>Centre de recherche sur les animaux modèles de l’Université</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>Modèle du Centre de Recherche Animale de l’Université</td><td></td><td></td> de Nanjing</tr><tr><td>Equipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Déshydrateur automatique</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage de sang</td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL Système d’imagerie gel</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain électrique pour bain-marie</td><td>Technologie Yiheng Appareil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d’électrophorèse</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument de PCR quantitative à fluorescence</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trancheuse de tissus congelés</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse horizontale</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micrographie à balayage lamellaire laser</td><td>Carl Zeiss Réservoir d’azote</td><td></td><td></td></tr><tr><td>liquide</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basse température élevée centrifugeuse rapide</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre ultraviolet Nanodrop Thermo</td><td></td><td>mesure Concentration</td><td></td>d’ARN</tr> Machine à <tr><td>trancher la paraffine</td><td>Amplificateur Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Testeur de pH</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg ; C Réfrigérateur</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oscillateur thermostatique de culture</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument d’encastrement de paraffine tissulaire</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;-80&deg ; C Réfrigérateur à ultra-basse température</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;-20&deg ; C Réfrigérateur à ultra-basse température</td><td>Système de</td> purification d’eau ultra <td></td><td></td></tr><tr><td>pure</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>u>Réactif</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expérimentation animale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>Humain FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Gel matriciel)</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Tête murine</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Souris Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>Souris EGF</td><td>Femelle PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Spondine R 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine (TI)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>Dérivé de Glycine max ; peut inhiber la trypsine, la chymotrypsine et la plasminase dans une moindre mesure. Un mg inhibera 1,0 à 3,0 mg de trypsine.</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>&nbsp ; T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049<</td><td></td></tr><tr><td>strong>HE coloration & Immunomarquage</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-IgG souris Thermo</td><td></td><td>A-21202</td><td>Dilution utilisée : IHC) 2 &mu ; g/mL, (IF) 0,2 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-Lapin IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21206</td><td>Dilution utilisée : (IHC) 2 &mu ; g/mL, (IF) 2 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 âne anti-Souris IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10037</td><td>Dilution utilisée : (IHC) 2 &mu ; g/mL, (IF) 2 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 âne anti-Lapin IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10042</td><td>Dilution usagée : (IHC) 2 &mu ; g/mL, (IF) 4 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorps anti-AQP5 de lapin</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>Dilution utilisée : (IHC) 1 &mu ; g/mL, (IF) 0,1 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-E-cadhérine Anticorps anti-cadhérine de rat</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>Dilution utilisée : (IF)&nbsp ; 5 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-kératine14 anticorps de lapin</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>Dilution utilisée : (IHC) 1 &mu ; g/mL, (IF) 2 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td> anticorps de lapin <td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Dilution utilisée : (IHC) 1 &mu ; g/mL, (IF) 1 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorps anti-mCherry souris</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>Dilution utilisée : (IHC) 2 &mu ; g/mL, (IF) 2 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorps anti-mCherry rabbit</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>Dilution utilisée : (IF)&nbsp ; 2 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>C6H8O7</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>DAB Kit (20x)</td><td>CWBIO</td><td>CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>Montage fluorescent Medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps IgG anti-souris de chèvre (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Dilution utilisée : 2 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorps IgG anti-lapin de chèvre (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>Dilution utilisée : 2 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Hématoxyline</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>Histogel (Hydrogel d’enrobage)</td><td>Thermo</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr><tr><td>30 % H2O2</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>KD10</td><td></td></tr> Solution <tr><td>de peroxyde d’hydrogène à 30</td> % <td>Guangzhou Chemistry</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na3C6H5O7.2H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td>Neutral balsam</td><td>SHANGHAI</td><td>YIYANG YY-Neutral balsam</td><td></td></tr><tr><td>Non-immunized Goat Serum</td><td>BOSTER</td><td>AR0009</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium tribasique dihydraté</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.T.C. Compound</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>DINGGUO</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Guangzhou Chimie</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR & qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Alcool</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sangon Biotech</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO-Taq</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNA polymérase</td><td>TAKARA</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview (acide nucléique colorant)</td><td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td>Vector Construction & Transfection cellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXID-Ampicilline</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de plasmide sans endotoxines</td><td>Thermo</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide Lipo3000 Kit de transfection</td><td>Thermo</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LR Kit de réaction</td><td>Thermo</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de plasmide</td><td>TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr><tr><td>Trans5&alpha ; Cellule chimiquement compétente</td><td>TRANSGEN</td><td>CD201-01</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td></td> <td>OXID-Yeast</td><td></td></tr> <tr><td>Extrait</td><td>OXID-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amorces et séquence</td><td>Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer : AQP5 Sequence : F : CATGAACCCAGCCCGATCTT R : CTTCTGCTCCCCCCCCCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer : &beta ;-actin Sequence : F : AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R : AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer : Epcam Sequence : F : CATTTGCTCCAAACTGGCGT R : TGTCCTTGTCGGTTTTCTTCGG</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer : Krt5 Sequence : F : AGCAATGGCGTTCTGGAGG R : GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer : Krt14 Sequence : F : CGGACCAAGTTTGAGACGGA R : GCCACCTCCTCGTGGTTC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer : Krt19 Sequence : F : TCTTTGAAAACACTGAACCCTG R : TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer : Ltf Sequence : F : CACATGCTGTCGTATCCCGA R : CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer : Nestin Sequence : F : GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R : GACCTCTAGGGTCCGTCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer : P63 Sequence : F : TCCTATCACGGGAAGGCAGA R : GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 lentivirus vecteur à charge</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mCherry</td><td>Xiaofeng Qin laboratoire, Université</td><td></td><td></td> Sun Yat-sen</tr></tbody></table>

système de culture tridimensionnel sans sérum pour cellules souches de la glande lacrymale

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

La thérapie à base de cellules souches de la glande lacrymale (LG) est une stratégie prometteuse pour les maladies de la glande lacrymale. Cependant, l’absence d’une méthode de culture fiable et sans sérum pour obtenir un nombre suffisant de cellules souches LG (LGSC) est un obstacle à la poursuite de la recherche et de l’application. La méthode de culture tridimensionnelle (3D) sans sérum pour les LGSC de souris adultes est bien établie et montrée ici. Les LGSC pourraient être continuellement passés et induits à se différencier en cellules acineuses ou canalaires.
Pour la culture primaire lgsc, les LG de souris âgées de 6 à 8 semaines ont été digérées avec de la dispase, de la collagénase I et de la trypsine-EDTA. Au total, 1 × 104 cellules uniques ont été ensemencées dans 80 μL de matrice gel-milieu de cellules souches de glande lacrymale (LGSCM) dans chaque puits d’une plaque de 24 puits, prélaquée avec 20 μL de matrice gel-matrice LGSCM. Le mélange a été solidifié après incubation pendant 20 min à 37 °C, et 600 μL de LGSCM ajoutés.
Pour l’entretien des LGSC, les LGSC cultivés pendant 7 jours ont été désagrégés en cellules individuelles par dispase et trypsine-EDTA. Les cellules individuelles ont été implantées et cultivées selon la méthode utilisée dans la culture primaire LGSC. Les LGSC pourraient être passés plus de 40 fois et exprimer en continu les marqueurs de cellules souches / progénitrices Krt14, Krt5, P63 et nestin. Les LGSC cultivés dans LGSCM ont une capacité d’auto-renouvellement et peuvent se différencier en cellules acineuses ou canalaires in vitro et in vivo.

Établir un système de culture 3D sans sérum Dans cette étude, lgSCM contenant EGF, Wnt3A, FGF10 et Y-27632 pour les LGSC de souris a été développé, et les LGSC ont été isolés et cultivés avec succès par une méthode de culture 3D (Figure 1A). Un système de culture 3D sans sérum de LGSC de souris C57BL/6, de souris NOD/ShiLtJ, de souris BALB/c et de souris ROSA26mT/mG a été établi à l’aide de cette méthode16. Pour une souris mâle, 1,5-2 × ...

La méthode de culture tridimensionnelle sans sérum pour les cellules souches de la glande lacrymale adulte (LG) est bien établie pour l’induction de la formation d’organoïdes LG et la différenciation en cellules acineuses ou canalaires.

Système de culture tridimensionnel sans sérum pour cellules souches de la glande lacrymale

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Ce protocole fournit une stratégie avantageuse pour enrichir les cellules souches de la glande lacrymale pour la régénération et la reconstruction de la glande lacrymale. Les cellules souches des glandes lacrymales présentent une capacité d’expansion à long terme et un potentiel de différenciation. Le principal avantage de cette technique est que le milieu de culture des cellules souches de la glande lacrymale est sans sérum, ce qui montre l’énorme valeur pour la réparation de la glande lacrymale Commencez par obtenir une souris mâle BALB / c euthanasiée de six à huit semaines et coupez la peau derrière l’oreille pour exposer la glande lacrymale et le tissu conjonctif qui l’entoure.Décollez le tissu conjonctif par dissection contondante à l’aide d’une pince à épiler et retirez la glande lacrymale. Immergez les glandes lacrymales dans un plat de six centimètres avec quatre millilitres d’éthanol à 75% pendant 10 secondes et rincez immédiatement deux fois avec une solution de PBS de 10 millimolaires. Coupez les glandes lacrymales en petits fragments d’environ un millimètre cube.Transférez-les dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 millilitres et traitez les tissus avec 500 microl

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant&gt; 6 mois.

Non enzymatique, sans sérum de culture de tissus de lésions mammaires pré-invasives pour la génération spontanée de mammospheres

La glande lacrymale (LG) est un organe de branchement qui produit les composants aqueux de larmes nécessaires pour le maintien de la vision et la santé oculaire. Nous décrivons ici murin LG dissection et ex vivo des techniques de culture de déchiffrer les voies impliquées dans le développement LG signalisation.

Manipuler le murin Glande lacrymale

Ici, nous rapportons un protocole pour développer un système tridimensionnel (3-D) à partir de cellules souches induites par l'homme-pluripotent (hiPSC) appelé le corps embryoïde sans sérum (SFEB). Ce modèle 3-D peut être utilisé comme une culture de tranche organotypique pour modéliser le développement cortical humain et pour l'interrogation physiologique des circuits neuronaux en développement.

Développer des corps embryoïdes libres de sérum dérivés dérivés de HiPSC pour l&#39;interrogation de cultures cellulaires souches 3-D à l&#39;aide de tests physiologiquement pertinents

Ce protocole présente une méthode simple en deux étapes afin de différencier les cellules souches épithéliales cornéennes limbique de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture acellulaire xeno - et chargeur. Les méthodes de culture cellulaire présentés ici permettent une production rentable, à grande échelle des cellules qualité clinique applicables à l’utilisation de la thérapie des cellules cornéenne.

Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole décrit une approche pour produire des hépatosphères à partir de cellules souches pluripotentes humaines à l'aide d'un système de culture défini et de l'auto-assemblage cellulaire. Ce protocole est reproductible dans un certain nombre de lignées cellulaires, rentable et permet la production d'hépatosphères humaines stables pour une application biomédicale.

Production sans sérum d'hépatosphères humaines tridimensionnelles à partir de cellules souches pluripotentes

Ce protocole décrit comment établir, maintenir, modifier génétiquement, différencier, caractériser fonctionnellement et transplanter des organoïdes des glandes lacrymales dérivés de tissus primaires de souris et humains.

Établissement, entretien, différenciation, manipulation génétique et transplantation d’organoïdes lacrymaux et humains

Ici, nous présentons un protocole démontrant l’utilisation de l’hydrogel comme cadre de culture cellulaire tridimensionnel (3D) pour la culture de cellules souches dérivées adipeuses (ADSC) et introduisant la photobiomodulation (PBM) pour améliorer la prolifération des ADSC dans le cadre de la culture 3D.

Culture cellulaire tridimensionnelle de cellules souches dérivées du tissu adipeux dans un hydrogel avec augmentation de la photobiomodulation

Ce protocole décrit une méthode optimisée pour dissocier les glandes lacrymales de souris âgées afin d’obtenir des cellules uniques viables pour le séquençage de l’ARN unicellulaire. La digestion enzymatique séquentielle et la manipulation douce préservent l’intégrité cellulaire, produisant des suspensions de haute qualité adaptées à l’isolement spécifique au type cellulaire et à l’analyse transcriptomique des changements associés au vieillissement dans les populations de glandes lacrymales.

Protocole pour la dissociation unicellulaire, le séquençage de l’ARN et l’isolement des cellules myoépithéliales et des fibroblastes des glandes lacrymales et salivaires âgées

Nous décrivons une plate-forme de puces à base pour la culture en trois dimensions des cellules de micro-bioréacteurs. Une puce peut accueillir jusqu'à 10 Mio. cellules qui peuvent être cultivées dans des conditions définies avec précision à l'égard de l'écoulement du fluide, etc pression d'oxygène dans une solution stérile, boucle de circulation fermée.

Chip à base de culture cellulaire tridimensionnelle dans perfusé micro-bioréacteurs

Homme lysat plaquettaire est une riche source de facteurs de croissance et d'un supplément puissant dans la culture cellulaire. Ce protocole présente le processus de préparation d'un grand bassin de lysat plaquettaire humaine en commençant à partir du plasma riche en plaquettes, effectuant plusieurs cycles gel-dégel et d'épuiser les fragments de plaquettes.

Préparation du Pooled lysat plaquettaire humain (pHPL) comme un supplément efficace pour animaux sans sérum humain cultures de cellules souches

Découvrez une méthode de culture sans sérum pour enrichir les cellules souches de la glande lacrymale chez la souris BALB/c. Ce protocole permet leur expansion à long terme et leur différenciation en cellules acineuses et ductales pour la régénération tissulaire.

Système de culture tridimensionnel sans sérum pour cellules souches de la glande lacrymale

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