Name: Protéomique de spectrométrie de masse guidée par lignée cellulaire dans l’embryon (grenouille) en développement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Découvrez la protéomique par spectrométrie de masse guidée par lignée cellulaire dans l'embryon de Xenopus laevis. Cette méthode permet d'analyser les événements développementaux avec une résolution spatiale et temporelle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous sommes reconnaissants à Jie Li (Université du Maryland, College Park) pour ses précieuses discussions sur la dissociation embryonnaire et le FACS. Nous remercions Vi M. Quach et Camille Lombard-Banek pour leur aide à la préparation des échantillons et à la collecte de données dans les études antérieures illustrant les applications protéomiques mises en évidence dans ce protocole. Certaines parties de ce travail ont été soutenues par la National Science Foundation sous le numéro d’attribution IOS-1832968 CAREER (à P.N.), les National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R35GM124755 (à P.N.), le programme de partenariat entre l’Université du Maryland et le National Cancer Institute (à P.N.) et les bourses de recherche de la COSMOS Club Foundation (à A.B.B. et L.R.P.).

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ce protocole permet de caractériser l’expression des protéines dans les lignées cellulaires identifiées chez les embryons de l’espèce Xenopus . Issue du SGRH, la méthodologie combine une spécificité exquise dans l’identification moléculaire, une capacité de détection multi-protéines sans sondes moléculaires (généralement des centaines à des milliers de protéines différentes) et une capacité de quantification. L’adaptabilité aux outils et flux de travail classiques en (neuro)biologie cellulaire et développemental...

Notre compréhension de la différenciation cellulaire et de la genèse des tissus et des organes est le résultat de décennies de criblages ciblés élaborés de gènes et de leurs produits. Accroître notre connaissance de toutes les biomolécules et de leurs quantités lors d’événements cellulaires importants aiderait à démêler les mécanismes moléculaires qui contrôlent la structuration spatiale et temporelle du plan corporel des vertébrés. Les technologies permettant l’amplification moléculaire et le séquençage sont maintenant en mesure de rendre compte régulièrement d’un grand nombre de gènes et de transcrits à l’appui d’études fondées sur des hypothèses dans la recherche biologique fondamentale et translationnelle. Pour comprendre les systèmes en développement, une relation complexe entre la transcription et la traduction plaide en faveur de l’analyse directe de multiples protéines et de leurs modifications post-traductionnelles. La protéomique globale utilisant des systèmes biologiques in vitro, tels que les cellules souches pluripotentes induites, a commencé à délimiter les mécanismes d’induction tissulaire 1,2. Dans les organismes complexes, tels que l’embryon de vertébrés, le développement repose sur les gradients morphogènes dans le contexte de l’espace et du temps3. Il s’ensuit que l’acquisition de connaissances sur les changements protéomiques à mesure que les cellules se différencient pour former des tissus spécialisés, tels que les tissus neuraux, offre une clé pour débloquer des programmes moléculaires contrôlant le développement normal et défectueux et guider les thérapies de prochaine génération.
La grenouille à griffes vertébrée d’Afrique du Sud (Xenopus laevis) est un modèle bien établi en biologie cellulaire et développementale, neuro- et régénérative. Le prix Nobel de physiologie ou médecine 4,5 de Sir John Gurdon en 2012 pour la découverte de la pluripotence du noyau somatique a souligné l’importance de ce modèle pour les découvertes en études fondamentales et translationnelles. Les embryons Xenopus se développent à l’extérieur de la mère, facilitant ainsi la manipulation directe des cellules, des clones cellulaires et de l’expression génique à différents stades de développement. La pigmentation asymétrique et les divisions cellulaires stéréotypées ont permis de cartographier des cartes de devenir reproductibles à partir de l’embryon de stade 7,8 à 16-6 et 32 cellules. Pour la protéomique basée sur la spectrométrie de masse à haute résolution (SGRH), les avantages supplémentaires du modèle comprennent une taille relativement grande (~1 mm de diamètre), qui donne une teneur abondante en protéines pour l’analyse (~130 μg chez les embryons au stade de clivage précoce, ~10 μg de teneur en protéines dans les cellules individuelles de l’embryon à 16 cellules)9,10.
À l’heure actuelle, le SGRH est la principale technologie de choix pour la détection des protéines. Cette technologie permet la détection et la quantification directes, sensibles et spécifiques de multiples, généralement des centaines, voire des milliers de protéines différentes11. La protéomique ascendante du SGRH comporte une série d’étapes interconnectées. Après l’extraction de l’échantillon de cellule/tissu, les protéines sont digérées avec une enzyme protéolytique, telle que la trypsine (protéomique ascendante). Les peptides résultants sont séparés en fonction de leurs différentes propriétés physico-chimiques, y compris l’hydrophobicité (chromatographie liquide en phase inverse, LC), la charge nette (chromatographie par échange d’ions), la taille (chromatographie d’exclusion de taille) ou la mobilité électrophorétique (électrophorèse capillaire, CE). Les peptides sont ensuite chargés (ionisés), généralement à l’aide d’une ionisation par électronébulisation (ESI), et les ions peptidiques sont détectés et séquencés par fragmentation en phase gazeuse par HRMS en tandem. Les données peptidiques résultantes sont mises en correspondance avec le protéome de l’organisme étudié. Avec l’intensité du signal d’ions peptidiques spécifiques aux protéines (protéotypiques) corrélée à la concentration, la quantification des protéines peut être effectuée sans marquage ou sur la base du marquage (quantification multiplexage). La protéomique du SGRH fournit une riche source d’information sur l’état moléculaire du système à l’étude, ce qui permet de générer des hypothèses et des études fonctionnelles de suivi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Figure 1 : Protéomique spatio-temporellement évolutive permettant la protéomique HRMS guidée par lignée cellulaire dans l’embryon (grenouille) en développement. (A) Visualisation de l’échantillon (1) à l’aide d’un stéréomicroscope (2) pour l’injection d’une cellule identifiée (encadré), à l’aide d’une micropipette fabriquée (3) sous contrôle par un étage de translation (4). (B) Prélèvement subcellulaire de la cellule D 11 gauche identifiée dans un embryon à16 cellules. (C) Dissection d’une cellule D 11 entière à partir d’un embryon à16 cellules. (D) Traçage fluorescent (vert) des descendants D111 gauche et droit d’un embryon à 32 cellules pour guider la dissection de l’ectoderme neural (NE) dans la gastrule (stade 10) et isolement du tissu descendant du têtard à l’aide de FACS. Barres d’échelle : 200 μm pour les embryons, 1,25 mm pour le flacon. Les figures ont été adaptées avec la permission des références 15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Le protocole présenté ici permet de quantifier un grand nombre de protéines dans des cellules/tissus identifiés dans des embryons de X. laevis en développement basés sur le SGRH. L’approche s’appuie sur une identification cellulaire précise, des cartes de destin cellulaire reproductibles et des méthodologies établies pour suivre les lignées cellulaires dans ce modèle biologique 6,7,8. Comme le montre la figure 1, nous étudions les protéomes de cellules individuelles en utilisant la dissection de cellules entières ou le microéchantillonnage capillaire pour aspirer le contenu cellulaire. Le suivi de la lignée d’une cellule nous permet d’étudier l’évolution spatio-temporelle du protéome lorsque les cellules forment des tissus pendant la gastrulation. La descendance cellulaire est marquée par fluorescence par injection d’un fluorophore conjugué à du dextrane inerte ou à l’ARNm pour la protéine fluorescente (p. ex. protéine fluorescente verte, ou GFP). La descendance marquée est isolée aux moments de développement souhaités. Pendant la gastrulation, les clones cellulaires étroitement regroupés peuvent être isolés par dissection. Après gastrulation, les clones cellulaires peuvent être distribués dans l’embryon en raison des mouvements migratoires et peuvent être isolés des tissus dissociés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Les protéines de ces cellules et tissus sont mesurées par protéomique ascendante utilisant HPLC ou CE pour la séparation et ESI tandem HRMS pour l’identification. La protéomique HRMS guidée par lignée cellulaire est évolutive à différentes tailles de cellules et lignées au sein de l’embryon et est spécifique, sensible et quantitative. À travers des exemples sélectionnés présentés ici, nous démontrons également que ce protocole est évolutif et largement adaptable à différents types de cellules et de lignées cellulaires.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Figure 2 : Le flux de travail bioanalytique. La micro-dissection et l’aspiration capillaire, ou FACS, ont facilité l’échantillonnage de la teneur en protéines cellulaires et clonales. Épuisement des protéines vitellines abondantes et séparation par électrophorèse capillaire (EC) ou chromatographie liquide à nanoflux (LC) sensibilité à l’identification améliorée (ID) à l’aide de la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) par ionisation électronébulaire (ESI). La quantification a révélé une dysrégulation, fournissant de nouvelles informations pour des études basées sur des hypothèses en conjonction avec les informations disponibles à partir de l’ontologie génique (GO). Les chiffres ont été adaptés avec la permission de la référence15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Acétonitrile (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0492</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Colonne analytique</td><td>Thermo Scientific</td><td>164941</td><td></td></tr><tr><td>Microbalance analytique</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XSE105DU</td><td></td></tr><tr><td>Plateforme de fractionnement automatique des peptides</td><td>Agilent</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Capillaries</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en borosilicate (pour la fabrication d’émetteurs)</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de spin C18 (pour le dessalage)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Caméra pour surveiller l’électronébulisation</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>EO-2018C</td><td></td></tr><tr><td>Combretastatin A4</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7744</td><td></td></tr><tr><td>Commercial CESI system</td><td>AB SCIEX</td><td>CESI(</td><td></td></tr><tr><td>Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td><td>VWR</td><td>97061-492</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasine D</td><td>Millipore Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 488 ; 10 000 MW, anionique, fixable</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D22910</td><td></td></tr><tr><td>Diothiothreitol</td><td>Fisher</td><td>Scientific FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62786AP</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence source lumineuse</td><td>Lumencore</td><td>AURA III</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBing microcentrifugeuse&nbsp ; tubes : protéine</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur (-20 &deg ; C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>97-926-1&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur (-80 &deg ; C)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TSX40086A</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en silice fondue</td><td>Molex</td><td>1088150596</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td>Benchmark</td><td>BSH300</td><td></td></tr><tr><td>Système de chromatographie liquide à haute pression</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystème</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation haute tension</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse haute résolution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spectromètre</td><td></td>de masse</tr><tr><td>HPLC capuchons</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-40A</td><td></td></tr><tr><td>Flacons HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-11</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur, par exemple Cols de cygne</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC122275000</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de microcapillaire</td><td>Suttor Instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropippette</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de données MS, logiciel commercial</td><td>d’analyse de données ProteomeDiscoverer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS, opensource</td><td>MaxQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>non-idet 40 substitut</td><td>Millipore Sigma</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>boîte de Pétri 60 mm et 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 10 &micro ; L lit Zip-tips (pour le dessalage)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines d’acide bicinchoninique Pierce</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Dosage quantitatif des peptides colorimétriques Pierce</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI90058</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind flacons</td><td>Eppendorf</td><td>0030108434 , Centrifugeuse réfrigérée 0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>réfrigéré</td> Eppendorf <td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td>PR505755R/3721</td><td></td></tr><tr><td>Léthionate de sodium</td><td>Millipore Sigma</td><td>220078</td><td></td></tr><tr><td>pyrophosphate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221368-100G</td><td></td></tr><tr><td>Flacon BGE en acier inoxydable</td><td>Flacons</td> d’échantillons en acier inoxydable sur <td></td><td></td>mesure</tr><tr><td>Stéréomicroscope sur mesure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(objectif 10x)</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1270, SZX18</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>97063-790</td><td></td></tr><tr><td>Pompes à seringues (2)</td><td>Appareil Harvard 704506</td><td></td><td></td></tr><tr><td>seringues (étanches aux gaz) : 500&ndash ; 1000 et micro ; L</td><td>Hamilton</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert (en plastique, jetables)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Trap Column</td><td>Thermo Scientific</td><td>164750</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (solution 1 M)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ22638AP</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur sous vide capable de fonctionner à 4&ndash ; 10 &deg ; C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Eau (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Eau (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Platine de traduction XYZ</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZ Sur</td><td></td><td></td><td></td> mesure</tr></tbody></table>

protéomique de spectrométrie de masse guidée par lignée cellulaire dans l’embryon (grenouille) en développement

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

La caractérisation des événements moléculaires lorsque les cellules donnent naissance à des tissus et des organes permet de mieux comprendre le développement normal et de concevoir des remèdes efficaces contre les maladies. Les technologies permettant l’identification et la quantification précises de divers types et d’un grand nombre de protéines fourniraient encore des informations manquantes sur les mécanismes moléculaires orchestrant le développement des tissus et des organismes dans l’espace et le temps. Ici, nous présentons un protocole basé sur la spectrométrie de masse qui permet de mesurer des milliers de protéines dans des lignées cellulaires identifiées dans des embryons Xenopus laevis (grenouille). L’approche s’appuie sur des cartes reproductibles du devenir cellulaire et des méthodes établies pour identifier, marquer, suivre et échantillonner par fluorescence les cellules et leur descendance (clones) à partir de ce modèle de développement des vertébrés. Après avoir recueilli le contenu cellulaire à l’aide de micro-échantillonnage ou isolé des cellules par dissection ou tri cellulaire activé par fluorescence, les protéines sont extraites et traitées pour une analyse protéomique ascendante. La chromatographie liquide et l’électrophorèse capillaire sont utilisées pour fournir une séparation évolutive pour la détection et la quantification des protéines avec la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS). Des exemples représentatifs sont fournis pour la caractérisation protéomique des cellules destinées au tissu neural. La protéomique HRMS guidée par lignée cellulaire est adaptable à différents tissus et organismes. Il est suffisamment sensible, spécifique et quantitatif pour examiner la dynamique spatio-temporelle du protéome au cours du développement des vertébrés.

Ce protocole a permis l’étude des protéines dans des cellules individuelles et leurs lignées lorsqu’elles établissent des tissus dans des embryons de X. laevis. La figure 1 illustre l’une de ces applications de l’approche pour étudier les protéines dans les cellules du tissu neural et l’ectoderme neural nouvellement induit dans l’embryon. Comme le montre la figure 1A, le flux de travail bioanalytique a intégré les outils traditionnels de la biologie cel...

Nous décrivons ici une caractérisation protéomique basée sur la spectrométrie de masse de lignées cellulaires avec des destins tissulaires connus chez l’embryon vertébré Xenopus laevis .

Protéomique de spectrométrie de masse guidée par lignée cellulaire dans l’embryon (grenouille) en développement

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Cette approche guidée par la lignée permet l’analyse protéomique d’événements développementaux importants avec une résolution spatiale et temporelle chez l’embryon de vertébrés transmettant des informations qui ne seraient pas accessibles par des mesures d’embryons entiers. Cette approche peut être facilement étendue à l’étude des protéines, des métabolites et des transcrits de différentes cellules embryonnaires au fur et à mesure qu’elles se différencient au cours du développement. Cette méthode peut faire progresser notre compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent le développement normal et de la maladie, y compris les mécanismes d’induction tissulaire et d’engagement du devenir cellulaire au cours du développement précoce.Utilisez une boucle capillaire pour guider chaque embryon dans un puits et positionnez-les doucement de manière à ce que la cellule ciblée d’intérêt soit perpendiculaire à la micro-aiguille. Suivez les cartes du devenir tissulaire de Xenopus laevis pour identifier la cellule précurseur de la lignée d’intérêt. Utilisez deux pinces à aiguiser pour retirer délicatement la membrane vitelline entourant l’embryon.Isoler les cellules individuelles de l’embryon par dissection manuelle à l’aide de forceps. Commencez par installer l’aiguille d’injection contenant la solution de traceur de lignée. Montez l’aiguille de micro-injection dans un support de micro-pipette contrôlé par un micromanipulateur multi-axes.Connectez le porte-micro-pipette à un micro-injecteur et remplissez l’aiguille avec le traceur de lignée en appliquant une pression négative. Calibrez l’aiguille et ajustez la taille de l’extrémité de l’aiguille et le temps d’injection pour fournir environ un nanolitre de la solution de traceur de lignée mesurée dans l’huile minérale. Assurez-vous que la taille des gouttelettes injectées est exacte et ajustez les paramètres de l’injecteur si nécessaire.Inonder le plat d’argile de micro-injection avec une solution à 3% fCAL et transférer environ 10 embryons dans le plat d’argile à l’aide d’une pipette de transfert. Injecter aux cellules d’intérêt environ un nanolitre de dextrane fluorescent ou 200 picogrammes d’ARNm GFP. À l’aide d’un stéréomicroscope, confirmez le succès du marquage cellulaire.Assurez-vous que seule la cellule prévue est injectée. Jeter les embryons contenant des cellules blessées ou mal étiquetées conformément aux politiques institutionnelles. Transférer les embryons injectés dans une boîte de Pétri contenant 0,5x la solution de Steinberg.Cultivez-les entre 14 et 25 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de développement souhaité. Transférer trois à cinq embryons dans une boîte de gélose contenant 0,2x la solution de Steinberg pour les microdissections. Utilisez une pince pour disséquer le clone marqué de l’embryon.Recueillir le tissu disséqué avec une pipette de 0,5 à 10 microlitres et le déposer dans un fichier de microcentrifugeuse. À l’aide d’une pipette, aspirer le milieu entourant le tissu prélevé afin de limiter la présence de sels dans l’échantillon afin d’éviter toute interférence avec l’analyse du SGRH. Congeler immédiatement les cellules isolées en plaçant le flacon d’échantillon sur de la glace sèche ou de l’azote liquide.Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse par spectrométrie de masse. Pour le traitement d’échantillons unicellulaires par CE, dénaturez les protéines en chauffant l’échantillon à 60 degrés Celsius pendant environ 15 minutes. Ensuite, équilibrez l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes et ajoutez de la trypsine aux échantillons pour la digestion.Pour l’analyse par NanoLC, lyser jusqu’à cinq tissus disséqués dans 50 microlitres de tampon de lyse. Faciliter le processus en pipetant l’échantillon de haut en bas. Pour traiter les tissus disséqués, incuber le lysat à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, enduisez les débris cellulaires et les plaquettes vitellines à quatre degrés Celsius par centrification à 4 500 RCF. Transférer le surnageant dans un flacon de microcentrifugation propre et ajouter 10% de SDS pour obtenir une concentration finale de 1% SDS dans le lysat. Pour les tissus, ajouter 0,5 molaire de dithiothréitol au lysat pour obtenir une concentration finale d’environ 25 millimolaires.Ensuite, incuber le lysat pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius pour réduire chimiquement les liaisons disulfure dans les protéines. Ajouter 0,5 molaire d’iodoacétamide pour obtenir la concentration finale d’environ 75 millimolaires dans le lysat et incuber le mélange pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter 0,5 molaire de dithiothréitol identique au volume initial pour éteindre les réactifs restants de la réaction d’alkylation.Précipiter les protéines dans l’acétone pendant la nuit comme décrit dans le protocole texte et se reconstituer dans 0,5 molaire de bicarbonate d’ammonium. Ajouter la trypsine pour la digestion des échantillons et incuber les flacons à 37 degrés Celsius. Pour séparer les peptides à l’aide de CE, reconstituer la protéine digérée dans un à deux microlitres de l’échantillon de solvant.Vortex de l’échantillon mixte et centrifusion à 10 000 RCF pendant deux minutes à quatre degrés Celsius pour injecter les débris cellulaires. Initialisez l’instrument CE-ESI en rinçant le capillaire CE avec le BGE. Placer un microlitre d’échantillon dans le flacon d’échantillon et injecter un à 10 nanolitres de l’échantillon dans le capillaire de séparation CE par injection hydrodynamique.Transférer l’extrémité d’entrée du capillaire de séparation CE dans le BGE. Commencez la séparation électrophorétique en augmentant progressivement la tension de séparation CE à partir de la terre. Des potentiels de 20 à 28 kilovolts avec un courant inférieur à 10 microampères assurent des performances instrumentales stables et reproductibles pour l’analyse.Pour séparer à l’aide de Nano LC, remettre en suspension l’échantillon peptidique en phase mobile A.La concentration et le volume d’injection de l’échantillon dépendent du système LC et de la colonne disponibles. Transférer l’échantillon dans un flacon LC. Charger environ 200 nanogrammes à deux microgrammes d’échantillon de peptide dans la colonne analytique C18 et séparer les peptides à un débit de 300 nanolitres par minute en utilisant l’élution de gradient comme décrit dans le manuscrit du texte.À l’aide d’une caméra, vérifiez le débit de liquide à travers l’émetteur de pulvérisation électrique et inspectez visuellement l’installation pour détecter d’éventuelles fuites. Acquérir des événements de spectrométrie de masse et séquencer les peptides comme décrit dans le manuscrit textuel. Des différences génétiques translationnelles ont été détectées entre des cellules D11 disséquées à partir de différents embryons à l’aide de CE-ESI-HRMS.Des clones cellulaires disséqués marqués par lignée ont été analysés par LC-HRMS. L’analyse de la voie des protéines a montré une translation des protéines régulée à la hausse et un métabolisme énergétique dans l’organisateur de Spemann avec le neuroectoderme. Le neuroectoderme prodeum a été enrichi en protéines associées au transport nucléaire de la cargaison de protéines dans la cellule, indiquant probablement des événements en aval suivant la signalisation.L’analyse d’enrichissement des fonctions moléculaires a indiqué une régulation positive dans l’initiation de la traduction, la liaison à l’ARN et la liaison du complexe protéasome, suggérant un rôle pour le renouvellement dynamique des protéines développant l’organisateur de Spemann. Ne sélectionner que des embryons stéréotypés pour ce protocole afin d’améliorer la reproductibilité et l’interprétation des résultats. Les tissus disséqués doivent être transférés dans un flacon et immédiatement congelés contenant le plus minimum de tampon possible pour minimiser la contamination par les sels tampons.Cette approche nous a permis d’étudier la dynamique des protéines dans les cellules identifiées et les lignées cellulaires dans les embryons vivants. Les nouvelles informations que nous avons obtenues sur la production temporelle spatiale de protéines importantes dans les tissus en développement nous ont permis de concevoir des expériences ciblées pour évaluer leur fonction biologique.

cell-lineage-guided-mass-spectrometry-proteomics-developing-frog

Research

Recherche

JoVE Journal

Chemistry

Chimie

Xenopus embryonnaire épithéliums sont un système modèle idéal pour étudier les comportements cellulaires tels que le développement de polarité et changer de forme lors de la morphogenèse épithéliale. Histologie classique d'échantillons fixe est de plus en plus complétée par des cellules vivantes imagerie confocale. Ici nous démontrons méthodes pour isoler les tissus de grenouilles et de visualiser en direct les cellules épithéliales et de leur cytosquelette des cellules vivantes en utilisant la...

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Le destin d'une cellule individuelle embryonnaire peut être influencé par des molécules héréditaires et / ou par des signaux provenant des cellules voisines. L'utilisation de cartes sort de l'embryon de Xenopus clivage stade, blastomères simples peuvent être identifiés pour la culture en vase clos pour évaluer les contributions des molécules héritées par rapport interactions cellule-cellule.

Les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

La question de savoir comment les organismes de réglementation et des états de la chromatine chromatine affecte le génome in vivo est essentielle à notre compréhension de la façon dont les premières décisions du destin cellulaire sont faites dans l'embryon en développement. ChIP-Seq-la méthode la plus populaire pour étudier les caractéristiques de la chromatine au niveau-est globale définie ici pour les embryons de xénope.

Snapshot échelle du génome des régulateurs de la chromatine et les États dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryons par Chip-Seq

Le manuscrit ici fournit un jeu simple de méthodes pour analyser la sécrétion et la diffusion de ligands marqués par fluorescence dans Xenopus. Ceci permet d'obtenir un contexte pour tester la capacité des autres protéines de modifier la distribution de ligand et en permettant des expériences qui peuvent donner un aperçu des mécanismes de régulation des gradients de morphogènes.

Utilisation de l&#39;analyse confocale<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Chargé d&#39;enquêter sur les modulateurs de Wnt et Shh morphogène Dégradés

Ce protocole présente un procédé pour effectuer, une seule cellule dans l'analyse quantitative in situ de l'expression des protéines à l'étude de la spécification lignée dans des embryons de pré-implantation de la souris. Les procédures nécessaires pour la collecte des blastocystes, entiers montage détection par immunofluorescence de protéines, l'imagerie d'échantillons sur un microscope confocal, et la segmentation nucléaire et l'analyse d'images sont décrites.

Analyse quantitative de l&#39;expression des protéines pour l&#39;étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d&#39;embryons

Les auteurs décrivent les étapes permettant d’échantillonnage rapide in situ d’une petite portion d’une cellule individuelle avec haute précision et une atteinte minimale à l’aide de base capillaire Microprélèvement, pour faciliter la caractérisation chimique d’une capture instantanée de l’activité métabolique dans embryons vivants à l’aide d’une cellule unique sur mesure électrophorèse capillaire et la plate-forme de la spectrométrie de masse.

Microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaires dans les embryons de grenouilles vivent (Xenopus laevis)

Ici nous avons présenté une méthode multiplexée de séquençage d'ARNm de cellules simples pour profiler l'expression de gène dans les tissus embryonnaires de souris. La méthode de séquençage de l'ARNm à cellule unique à base de gouttelettes (scRNA-Seq) combinée à des stratégies de multiplexage peut dresser le profil des cellules uniques à partir de plusieurs échantillons simultanément, ce qui réduit considérablement les coûts des réactifs et minimise les effets expérimentaux des lots.

Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris

Nous présentons un protocole en deux parties qui combine l’imagerie fluorescente de calcium avec l’hybridation in situ, permettant à l’expérimentateur de corréler des modèles de l’activité de calcium avec des profils d’expression de gène sur un niveau unicellulaire.

Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

La microscopie à fluorescence à base de feuilles de lumière est l’outil le plus précieux en biologie du développement. Un problème majeur dans les études comparatives est la variance ambiante. Notre protocole décrit un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée de plusieurs spécimens et, par conséquent, aborde cette question de manière proactive.

Imagerie en direct simultanée d’embryons d’insectes multiples dans des microscopes à fluorescence à feuille de lumière à base de chambre d’échantillonnage

Le poisson zèbre ciblant les électrophiles et les oxydants réactifs (Z-REX) est une méthode basée sur la biologie chimique pour l’étude de la signalisation réactive des petites molécules. Cette technique peut être appliquée à des poissons vivants de différents stades de développement. Ici, nous associons des tests standard chez le poisson zèbre avec Z-REX pour l’analyse de la voie de signalisation.

Surveillance des réponses de signalisation ciblée chez les larves de poisson-zèbre - Z-REX démasque les mécanismes précis des médicaments électrophiles et des métabolites

Un protocole efficace de perfusion sanguine rapide est présenté ici pour préparer des échantillons de tissus de grenouilles à griffes africaines pour des études transcriptomiques et protéomiques.

Perfusion sanguine rapide efficace chez Xenopus

Découvrez la protéomique par spectrométrie de masse guidée par lignée cellulaire dans l'embryon de Xenopus laevis. Cette méthode permet d'analyser les événements développementaux avec une résolution spatiale et temporelle.

Protéomique de spectrométrie de masse guidée par lignée cellulaire dans l’embryon (grenouille) en développement

Explorer plus de vidéos