Name: Absorption de dose de l’exposition aux composés à base de platine et de ruthénium chez le poisson-zèbre par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif avec des applications plus larges (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Découvrez une méthode ICPMS pour quantifier l'absorption de platine et de ruthénium chez Danio rerio. Cette technique valide les relations dose-réponse en toxicologie environnementale et pharmacologique.

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Financement : NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. De plus, Brittany Karas est soutenue par la bourse de formation T32NS115700 du NINDS, NIH. Les auteurs remercient Andreia Valente et la Fondation portugaise pour la science et la technologie (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) pour la fourniture de PMC79.

La souche AB de poisson-zèbre (Danio rerio) a été utilisée pour toutes les expériences (voir la table des matériaux), et le protocole d’élevage (#08-025) a été approuvé par le Rutgers University Animal Care and Facilities Committee.
1. Élevage de poisson-zèbre
<ol><li>Élever et maintenir le poisson-zèbre dans un système d’habitat aquatique en recirculation sur un cycle de lumière:10 h d’obscurité de 14 h.<ol>
<li>Purifier l’eau du robinet municipale par filtration au sable et au carbone pour obtenir de l’eau du système de pêche. Maintenir l’eau du système aquatique à 28 °C, <0,05 ppm de nitrite, <0,2 ppm d’ammoniac et pH entre 7,2 et 7,7.</li>
		<li>Nourrissez le poisson-zèbre avec un régime de kystes Artemia éclos, de crevettes en saumure et de flocons de poisson.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Protocole dose-réponse du poisson-zèbre (Figure 1)
<ol><li>Préparer une solution d’eau d’œuf de poisson zèbre, soit un milieu E3, soit de l’eau d’œuf à base de sel de mer de stock à une concentration de 60 μg/mL dissoute dans de l’eau désionisée18. Évitez l’utilisation de bleu de méthylène. REMARQUE: Grâce à l’ICPMS, une interférence isobare de l’eau d’œuf de poisson zèbre a été identifiée pour les oxydes de strontium, qui se chevauchaient avec un isotope du ruthénium. Un rinçage minutieux des larves avant l’analyse en aval a amélioré ce problème. Le milieu E3 peut être un choix plus facile pour certains en raison de la composition exclusive des sels de mer commerciaux.</li>
	<li>Dissoudre le métal ou les composés à base de métal dans de l’E3 ou de l’eau d’œuf. Vortex pour briser tout matériau d’agrégat et homogénéiser la solution. REMARQUE: Dans l’expérience décrite ci-dessous, le PMC79 et le cisplatine ont été dissous à des concentrations maximales de 12,4 mg / L et 60 mg / L avec une concentration maximale de 0,5% de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour résister à la précipitation.<ol>
<li>Diluer les métaux lourds ou les composés à base de métaux, tels que le PMC79 et le cisplatine, avec de l’E3 ou de l’eau d’œuf, en préparant au moins 5 doses de concentration.<ol>
<li>Commencez par de faibles concentrations de solutions mères dans un véhicule pur (c.-à-d. DMSO), puis diluez avec de l’E3 ou de l’eau d’œuf. Examinez attentivement les concentrations finales du véhicule. REMARQUE: Certains composés à base de métaux, tels que le cisplatine, se dégradent rapidement et leurs solutions doivent être fraîches quotidiennement. ATTENTION : Manipulez les métaux lourds et les agents chimiothérapeutiques avec soin. Examinez la fiche signalétique (FS) spécifique pour le métal d’intérêt. Le cisplatine peut provoquer une irritation des yeux et de la peau, être mortel s’il est avalé et peut entraîner une toxicité dans les reins, le sang, les organes hématopoïétiques et les tissus fœtaux. Évitez de respirer des vapeurs et le contact avec les yeux, la peau et les vêtements. Portez des gants et des vêtements imperméables, ainsi que des lunettes de sécurité ou des lunettesde protection 19.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Installez des bassins de reproduction l’après-midi avant l’expérience dans le rapport idéal de 2 femelles pour 1 mâle avec un diviseur en place entre les sexes20.<ol>
<li>Tirez sur le séparateur lorsque les lumières s’allument pour le cycle du matin.</li>
		<li>Laissez le poisson-zèbre se reproduire. REMARQUE: La durée de la reproduction dépend du stade d’exposition initial requis. Pendant 3 h après la postfertilisation, permettre la reproduction pendant environ 2 h. Les œufs atteindront 3 HPF après le nettoyage et la ségrégation des œufs.</li>
		<li>Déplacez le poisson reproducteur dans un aquarium propre.</li>
		<li>Recueillez les œufs en versant l’eau du réservoir à travers une passoire.</li>
		<li>Inverser la passoire au-dessus d’une boîte de Pétri et utiliser un flacon de gicleurs rempli d’E3 ou d’eau d’œuf pour rincer les œufs dans le plat.</li>
		<li>Nettoyez le plat de la nourriture et des déchets avant l’utilisation expérimentale.</li>
	</ol></li>
	<li>Randomiser environ vingt embryons de 3 HPF par dose dans des flacons de verre individuels à l’aide d’une pipette de transfert et d’une petite quantité d’eau.</li>
	<li>Une fois que tous les embryons sont dans des flacons, retirez toute l’eau d’œuf et remplacez-la par une solution posologique suffisante pour qu’il y ait environ 1 pouce de solution au-dessus de la hauteur de l’œuf. REMARQUE: La nécessité de la déséchorionation doit être soigneusement examinée. Voir la section de discussion pour plus de détails.</li>
	<li>Observez quotidiennement les embryons pour détecter les lésions ou la létalité. En raison du développement rapide du poisson-zèbre embryonnaire, obtenez des images quotidiennes à l’aide de n’importe quelle configuration de microscope / caméra à fond clair pour identifier les lésions mineures entre les jours.</li>
	<li>À la fin de la dose-réponse (4 à 5 jours après la fécondation [dpf], conformément à la ligne directrice21 de l’Organisation de coopération et de développement économiques [OCDE],), mélanger 3 à 5 larves avant l’euthanasie pour un échantillonnage composite. Euthanasier par refroidissement rapide par congélation instantanée dans de l’azote liquide. REMARQUE: L’euthanasie par surdosage de MS-222 ou de méthanesulfonate de tricaïne peut potentiellement interférer avec l’analyse ICPMS en aval. Les méthodes d’euthanasie à refroidissement rapide sont encouragées pour ce protocole afin de réduire la possibilité d’interférence.</li>
	<li>Effectuez 3 lavages de tissu avec de l’eau de haute pureté (comme l’osmose inverse) pour éliminer l’excès de composé de l’extérieur du tissu.</li>
	<li>Déplacez les échantillons dans des tubes centrifuges en polypropylène de 15 mL résistants aux acides et aux micro-ondes. Veillez à éliminer tout excès d’eau car tout liquide restant peut diluer l’acide nitrique et, par conséquent, le potentiel oxydant de l’acide lors de la dégradation des tissus. REMARQUE: À ce stade, les tissus peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à une analyse plus approfondie. Pour les métaux naturellement abondants, le nettoyage des tubes dans un bain d’acide nitrique à 5% avant utilisation améliorera les niveaux de fond ambiant.</li>
</ol>3. Digestion des tissus et évaluation de l’ICPMS (Figure 2)
<ol><li>Ajouter environ 0,25 mL aux tubes centrifuges en polypropylène de 15 mL pour un maximum de 10 larves (~100 μg) d’acide nitrique de haute pureté (69 %). Ultrasons pendant 1 h pour prédigérer les échantillons en utilisant les paramètres suivants: sortie de bain à ultrasons: 85 W; 42 kHz ± 6 %; plage de température: 19-27 °C. ATTENTION : Portez une protection auditive pendant la sonication. L’acide nitrique provoque de graves brûlures des voies respiratoires, des yeux et de la peau. Portez un équipement de protection complet et travaillez dans la hotte ou dans des endroits suffisamment ventilés. Il peut être inflammable avec d’autres matériaux. L’acide nitrique doit être manipulé exclusivement dans une hotte pour éviter l’exposition aux vapeurs produites pendant la digestion. Ne pas inhaler ou ingérer.<ol>
<li>Effectuer de courts cycles de digestion des tissus (intervalles de 5 minutes) dans un digesteur à micro-ondes sans danger pour les acides jusqu’à ce que tous les tissus soient visiblement oxydés (c.-à-d. solution uniforme jaune clair). REMARQUE: Le protocole micro-ondes du tableau 1 est recommandé d’être effectué trois fois et comprend un intervalle de refroidissement de 5 minutes entre chaque étape de chauffage.</li>
		<li>Surveillez attentivement l’intégrité des tubes pour éviter la rupture et effectuez de courtes rotations dans la centrifugeuse (313 × g pendant 1 min) entre les cycles pour déplacer la condensation acide vers le fond du tube. REMARQUE: Si le tissu est difficile à digérer (en particulier les chorions), 30% de peroxyde d’hydrogène de haute pureté peut être utilisé après la digestion acide. Utilisez le peroxyde d’hydrogène (6,75 mL) pour diluer la concentration d’acide à 3,5 % et laissez les échantillons reposer toute la nuit dans une hotte aspirante. Le peroxyde d’hydrogène se décompose en H2O et convient à l’analyse ICPMS. De plus, les métaux de remplacement peuvent mieux se dissoudre dans l’acide chlorhydrique ou un mélange d’acide chlorhydrique et d’acide nitrique (c.-à-d. aqua regia). Le peroxyde d’hydrogène est nocif s’il est avalé et cause de graves lésions oculaires. Portez une protection de la peau et des yeux22,23.</li>
	</ol></li>
	<li>Une fois que le tissu est visiblement oxydé (c.-à-d. solution uniforme et jaune clair), diluer les échantillons dans une hotte à 3,5 % d’acide nitrique à l’aide de 6,75 mL d’eau de haute pureté et de vortex pour bien mélanger. REMARQUE: À ce stade, les échantillons peuvent être conservés à température ambiante. Cette étape n’est pas nécessaire si du peroxyde d’hydrogène a été ajouté pour faciliter la digestion à l’étape 3.1.</li>
	<li>Effectuer une courbe d’étalonnage en 7 points appariée par matrice (plage de concentration de 0,001 à 10 ppb) à l’aide d’un étalon élémentaire certifié (c.-à-d. Pt ou Ru, selon le dosage) avec le métal d’intérêt et les isotopes optimaux pour tenir compte de toute interférence isobare potentielle.<ol>
<li>En utilisant une concentration en stock de l’étalon élémentaire aqueux certifié (Ru, Pt = 1000 ppb), prenez une aliquote de 0,1 mL et pipetez dans un nouveau tube de centrifugeuse de 15 mL. Diluer avec de l’acide nitrique à 3,5 % jusqu’à un volume final de 10 mL pour produire une solution étalon à 10 ppb.</li>
		<li>À l’aide de la crosse de 10 ppb, effectuer les dilutions en série suivantes : solutions étalons de 0,1, 1,0 et 5,0 ppb dans de l’acide nitrique à 3,5 %.</li>
		<li>À l’aide de la crosse 0,1, effectuer les dilutions en série suivantes : 0,001, 0,005 et 0,01 ppb dans des solutions étalons à 3,5 % d’acide nitrique.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer l’instrument ICPMS (voir le Tableau des matériaux) pour l’analyse des échantillons comme suit:<ol><li>Avant de démarrer l’instrument, assurez-vous que la vanne de gaz Argon est ouverte, que tous les tubes sont bien connectés et que l’acide nitrique propre à 5% est ouvert pour rincer les tubes et la verrerie entre les analyses d’échantillons.</li>
		<li>Vérifiez l’état de la torche et des cônes, et assurez-vous que la boîte de torche est bien verrouillée et que le tube de drainage de la chambre de pulvérisation est correctement connecté à la péripompe.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel (voir la table des matériaux).</li>
		<li>Vérifiez les lectures de vide et assurez-vous que toutes les turbopompes fonctionnent à 100%.</li>
		<li>Cliquez sur DÉMARRER dans la fenêtre État du système de contrôle du plasma pour lancer la séquence de démarrage, allumer la pompe à plasma, le refroidisseur de plasma, purger le nébuliseur et allumer le plasma. Attendez que le plasma soit allumé et stable lorsque la fenêtre d’état indique que la séquence de démarrage est terminée. À ce stade, observez les points verts de la fenêtre État du système qui indiquent que tous les blocs d’alimentation sont allumés.</li>
		<li>Dans la barre de menus, cliquez sur Contrôler |'échantillonneur automatique dans le menu déroulant. Entrez dans la position du rack d’échantillonneur automatique pour le tube contenant 5% d’acide nitrique. Laissez l’acide pénétrer dans le plasma.</li>
		<li>Dans la barre de menus, cliquez sur Scans | Aimant dans le menu déroulant. Dans la fenêtre MagnetScan , tapez 115 dans la position de masse du marqueur et cliquez sur Entrée. Laissez l’aimant balayer sur toute la plage de masse pendant 115po (114,6083 à 115,3749) pendant 30 minutes pendant que l’instrument se réchauffe.</li>
		<li>Après 30 minutes, utilisez la commande d’échantillonneur automatique pour passer à la position d’une solution de réglage multi-éléments de 1 ppb. Aspirez la solution d’accord et accordez l’instrument pour optimiser la lecture du signal. Réglez la position de la torche (X, Y, Z) de manière à ce que la torche soit alignée avec le centre des cônes et le débit du nébuliseur (~ 30 psi) dans la fenêtre de contrôle Plasma . Effectuez les ajustements nécessaires dans la fenêtre Réglage de l’optique ionique pour la source, le détecteur et l’analyseur.</li>
		<li>Une fois la lecture du signal optimisée (~1,2 × 106 comptes/s pour 1 ppb sur 115In), cliquez sur Arrêter dans la fenêtre Magnet Scan .<ol>
<li>Cliquez sur Calibrer l’aimant et sélectionnez Basse résolution dans la fenêtre contextuelle.</li>
			<li>Cliquez sur OK et ouvrez le fichier « Étalonnage de masse (basse résolution).smc » pour calibrer l’aimant. REMARQUE: L’étalonnage de l’aimant mesurera les nombres / s et ajustera une courbe à travers la plage de masse suivante: 7Li à 238U.</li>
			<li>Cliquez sur Enregistrer | Permet d’appliquer l’étalonnage actuel de l’aimant aux analyses. Si vous mesurez des échantillons inconnus avec une vaste gamme de concentrations, effectuez un étalonnage de détecteur pour comparer les signaux de comptage d’impulsions ioniques à de faibles concentrations aux signaux ioniques atténués produits à des concentrations plus élevées. Analysez les échantillons une fois le réglage et l’étalonnage terminés.</li>
		</ol></li>
		<li>Dans la barre de menus, cliquez sur Acquisition de données.<ol>
<li>Cliquez sur Configuration de la méthode dans le menu déroulant. Utilisez une méthode existante fournie par le fabricant ou créez une méthode basée sur les éléments d’intérêt. Si nécessaire, ajustez le mode d’analyse, le temps d’arrêt, le délai de commutation, le nombre de balayages/cycles, la résolution, le mode de détection et la masse de stationnement pour les réglages du déflecteur.</li>
			<li>Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les paramètres de la méthode. Optimisez les paramètres pour chaque métal et isotope. Voir le tableau 2 pour les paramètres de fonctionnement spécifiques utilisés dans cette étude.</li>
		</ol></li>
		<li>Dans la barre de menus, cliquez sur Acquisition de données.<ol>
<li>Cliquez sur Batch Run dans le menu déroulant. Vous pouvez également cliquer sur l’icône BATCH sous la barre de menus. Importez les paramètres de lot à partir d’une feuille de calcul ou créez une séquence dans la fenêtre Exécution par lots . Entrez le type d’échantillon, la position du rack d’échantillonneur automatique, le temps de transfert, le temps de lavage, les répliques, l’ID d’échantillon et le fichier de méthode.</li>
		</ol></li>
		<li>Organisez le traitement du lot dans l’ordre suivant : solutions étalons pour la courbe d’étalonnage (0,001-10 ppb Pt ou Ru), suivies d’une norme de contrôle de la qualité, puis d’échantillons inconnus. REMARQUE : Les solutions standard sont mesurées en nombre(s) sur l’ICPMS, et une régression linéaire est ajustée à travers les normes avec un écart type relatif (DSR) > 0,999. Les inconnues sont également mesurées en nombre/s et résolues pour la concentration en ppb à l’aide de la régression linéaire de la courbe d’étalonnage, y = mx + b. Le traitement des données peut également être effectué à l’aide du logiciel référencé.</li>
		<li>Surveiller la dérive de l’instrument et la reproductibilité des échantillons en incluant une norme de contrôle de la qualité de 0,5 ppb tous les 5 à 10 échantillons. REMARQUE: Les normes de contrôle de la qualité appropriées doivent être un matériau de référence étalon certifié différent de l’étalon utilisé dans la courbe d’étalonnage.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Watts</td>
			<td>Pouvoir</td>
			<td>Compte-rendu</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>50%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>75%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>0%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>75%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Protocole de digestion par micro-ondes pour la masse tissulaire larvaire. Des échantillons larvaires de poisson-zèbre ont été digérés dans 0,25 mL d’acide nitrique. Ce tableau a été modifié par rapport à 24.

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<li>Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298">https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298</a> (2014).</li>
<li>Karas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+screening+method+for+transition+metal-based+anticancer+compounds+using+zebrafish+embryo-larval+assay+and+inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).</li>
<li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+%28FET%29+with+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Toxicology+%26+Pharmacology%3A+CBP%22%5BJournal%5D)">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).</li>
<li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement%3A+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li>
<li>Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+alkylating+activity+in+zebrafish+causes+resistance+to+chorionic+degradation+and+inhibition+of+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis.</a> Aquatic Toxicology. 229, 105656(2020).</li>
</ol>

Il n’y a aucun conflit d’intérêts à divulguer par l’un des auteurs.

Le protocole décrit ici a été mis en œuvre pour déterminer l’administration et l’absorption de médicaments anticancéreux à base de métal contenant du Pt ou du Ru. Bien que ces méthodes aient déjà été publiées, ce protocole traite de considérations et de détails importants pour adapter cette méthodologie à une gamme de composés. Le protocole de l’OCDE, associé à la digestion des tissus et à l’analyse ICPMS, nous a permis de déterminer que le PMC79 était plus puissant que le cisplatine et entraînait une accumulation tissul...

Les métaux et les composés à base de métaux continuent d’avoir une pertinence pharmacologique et toxicologique. La prévalence de l’exposition aux métaux lourds et son impact sur la santé ont augmenté de façon exponentielle les recherches scientifiques depuis les années 1960 et ont atteint un niveau record en 2021. Les concentrations de métaux lourds dans l’eau potable, la pollution atmosphérique et l’exposition professionnelle dépassent les limites réglementaires mondiales et demeurent un problème pour l’arsenic, le cadmium, le mercure, le chrome, le plomb et d’autres métaux. De nouvelles méthodes pour quantifier l’exposition environnementale et analyser le développement pathologique continuent d’être très demandées 1,2,3.
Inversement, le domaine médical a exploité les propriétés physiochimiques de divers métaux pour le traitement clinique. Les médicaments à base de métaux ou les médicaments à base de métaux ont une riche histoire d’usages médicinaux et ont montré une activité contre une gamme de maladies, avec le plus grand succès que les agents chimiothérapeutiques4. Le plus célèbre des métallodicaments, le cisplatine, est un médicament anticancéreux à base de Pt considéré par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) comme l’un des médicaments essentiels au monde5. En 2010, le cisplatine et ses dérivés Pt ont eu un taux de réussite allant jusqu’à 90% dans plusieurs cancers et ont été utilisés dans environ 50% des schémas de chimiothérapie 6,7,8. Bien que les agents chimiothérapeutiques à base de Pt aient eu un succès irréfutable, la toxicité limitant la dose a mis en branle des études sur des médicaments alternatifs à base de métaux avec une administration et une activité biologiques raffinées. Parmi ces alternatives, les composés à base de Ru sont devenus lesplus populaires 9,10,11,12.
De nouveaux modèles et de nouvelles méthodes sont nécessaires pour suivre le rythme des besoins en matière d’études pharmacocinétiques et toxicocinétiques sur les métaux. Le modèle du poisson-zèbre se situe à l’intersection de la complexité et du débit, étant un vertébré à haute fécondité avec 70% d’homologie génétique conservée13. Ce modèle a été un atout en pharmacologie et en toxicologie, avec des criblages approfondis pour divers composés pour la découverte de plomb, l’identification de cibles et l’activité mécaniste 14,15,16,17. Cependant, le criblage à haut débit des produits chimiques repose généralement sur des expositions à l’eau. Étant donné que l’absorption peut varier en fonction des propriétés physicochimiques du composé en solution (c.-à-d. photodégradation, solubilité), cela peut constituer une limitation majeure de la corrélation entre l’administration de la dose et la réponse.
Pour surmonter cette limitation de la comparaison de la dose aux vertébrés plus élevés, une méthodologie a été conçue pour analyser les concentrations de métaux traces dans le tissu larvaire du poisson-zèbre. Ici, les courbes dose-réponse des critères d’évaluation létaux et sublétaux ont été évaluées pour le cisplatine et de nouveaux composés anticancéreux à base de Ru. La létalité et l’éclosion retardée ont été évaluées pour des concentrations nominales de 0, 3,75, 7,5, 15, 30 et 60 mg/L de cisplatine. L’accumulation de Pt dans le tissu de l’organisme a été déterminée par l’analyse ICPMS, et l’absorption par l’organisme des doses respectives était de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 et 461,9 ng (Pt) par organisme. De plus, les larves de poisson zèbre ont été exposées à 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/L de PMC79. Ces concentrations ont été déterminées analytiquement pour contenir 0, 0,17, 0,44, 0,66 et 0,76 mg/L de Ru. Ce protocole a également permis de distinguer les concentrations de Pt séquestré dans le chorion des larves par rapport au tissu du poisson zèbre. Cette méthodologie a permis de fournir des données fiables et robustes pour comparer l’activité pharmacocinétique et toxicocinétique entre un agent chimiothérapeutique bien établi et un nouveau composé. Cette méthode peut être appliquée à une large gamme de métaux et de composés à base de métaux.

<table><tbody><tr><td>AB Strain Zebrafish (Danio reri)</td><td>Zebrafish International Resource Center</td><td>Wild-Type AB</td><td>Wild-Type AB Zebrafish</td></tr><tr><td>ACS Grade Nitric</td><td>Acid VWR BDH Chemicals</td><td>BDH3130-2.5LP</td><td>Acide nitrique (68-70 %) ; utilisé pour fabriquer 10 % HNO3 solution de bain acide pour tremper/pré-conditionner les tubes de centrifugeuse</td></tr><tr><td>Aquatox Fish Diet (Flake)</td><td>Zeigler Bros, Inc.</td><td></td><td>Nourriture en flocons à mélanger dans un rapport de 1:4 d’Aquatox Fish Diet à TetraMin Tropical Flakes et à utiliser comme aliment</td></tr><tr><td>Kystes d’artémias, artémias</td><td>PentairAES</td><td>BS90</td><td>Œufs d’artémias vendus en 15 ozz, boîtes emballées sous vide à éclore et à utiliser comme aliment</td></tr><tr><td>ASX-510 Échantillonneur automatique pour ICPMS</td><td>Teledyne CETAC</td><td></td><td>Échantillonneur automatique avec mouvement XYZ modulable, station de rinçage fluide et sonde de dimension intérieure de 0,3 mm. Compatible avec le logiciel Nu AttoLab pour les analyses de lots programmables. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>CL 2</td><td>Thermo Scientific CL 2 Centrifugeuse de paillasse compacte avec plage de vitesse variable jusqu’à 5200 tr/min ; utilisée pour amener l’échantillon et le condensat acide au fond du tube de centrifugation au-delà des intervalles de digestion par micro-ondes ; facilite la rétention des échantillons</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td>VWR</td><td>21008-105</td><td>Tubes à centrifuger en polypropylène ultra haute performance avec bouchon plat ; volume de 15 ml ; étanche à fond</td></tr> <tr>conique<td>Classe A Flacons filetés en verre transparent Fisherbrand</td><td></td><td>03-339-25B</td><td>Flacons individuels en verre pour le confinement de l’exposition</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8418</td><td>Solvant ou véhicule pour composés hydrophobes</td></tr><tr><td>Mélangeur vortex à vitesse fixe</td><td>VWR</td><td>10153-834</td><td>Mélangeur Vortex ; utilisé pour homogénéiser l’échantillon après digestion et dilution acides</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène de haute pureté</td><td>Merk KGaA, EDM Millipore</td><td>1.07298.0250</td><td>Suprapur Peroxyde d’hydrogène (30 %) ; utilisé pour la digestion d’échantillons</td></tr><tr><td>Acide nitrique de haute pureté</td><td>EDM Millipore</td><td>NX0408-2</td><td>Omni Trace Ultra Nitric Acid (69 %) ; utilisé pour la digestion d’échantillons</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Spectrum Brands, Inc.</td><td>Océan Instantané&reg ; La</td><td>solution aqueuse d’œuf de sel de mer contient du sel de mer de mer d’océan avec une concentration finale de 60 & micro ; g/ml</td></tr><tr><td>Mars X Microwave Digestion System</td><td>CEM, Matthews, NC</td><td></td><td>Système de digestion acide par micro-ondes utilisé pour digérer et homogénéiser des échantillons dans des conditions uniformes. Pour cette méthodologie, la méthode de digestion en récipient ouvert a été réalisée à l’aide de tubes à centrifuger en polypropylène à usage unique de faible puissance (300 W).</td></tr><tr><td>Solution multi-éléments 3</td><td>SPEX CertiPREP</td><td>CLMS-3</td><td>contient 10 mg/L Au, Hf, Ir,, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn dans 10 % de HCl/1 % de HNO3 ; utilisé comme étalon de contrôle qualité pour les analyses Pt et Ru</td></tr> Nu <tr><td>Instruments Spectromètre de masse à plasma à couplage inductif haute résolution AttoM (HR-ICP-MS)Nu</td> <td>Instruments/Amatek</td><td></td><td>Spectromètre de masse à plasma à plasma à double focalisation à double focalisation avec système de fente flexible à basse et haute résolution et système de détection de plage dynamique. Le traitement et la quantification des données sont effectués à l’aide du logiciel compagnon NuQuant.</td></tr><tr><td>Solution étalon de platine (Pt), NIST 3140</td><td>National Institute of Standards and Technology</td><td>3140</td><td>Préparée à partir d’une ampoule contenant 9,996 mg/g de Pt dans 10 % de HCl ; utilisée comme étalon de contrôle de la qualité pour les analyses de Pt</td></tr> Solution <tr><td>étalon de platine (Pt), monoélément</td><td>Étalons de haute pureté</td><td>100040-2</td><td>Contient 1000 mg/L de Pt dans</td></tr> une <tr><td>solution étalon de chlorhydrate de ruthénium (Ru)</td> à 5 %, <td>étalons</td> <td>de haute pureté monoélément100046-2</td><td>Contient 1000 mg/L de Ru dans 2 % de HCl</td></tr><tr><td>TetraMin Tropical Flakes</td><td>Tetra</td><td>77101</td><td>Aliment en flocons à mélanger dans un rapport de 1:4 entre Aquatox Fish Diet et TetraMin Tropical Flakes et utilisé comme aliment</td></tr><tr><td>Acide nitrique de qualité Trace Metal</td><td>VWR BDH Chemicals</td><td>87003-261</td><td>Aristar Plus Acide nitrique (67-70 %) ; utilisé pour la solution de rinçage dans ASX-510 Échantillonneur automatique</td></tr><tr><td>Bain-marie à ultrasons</td><td>VWR</td><td>B2500A-DTH</td><td>Bain-marie à ultrasons utilisé pour faciliter la digestion acide avant la digestion par micro-ondes</td></tr></tbody></table>

absorption de dose de l’exposition aux composés à base de platine et de ruthénium chez le poisson-zèbre par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif avec des applications plus larges

Dose Uptake of Platinum- and Ruthenium-based Compound Exposure in Zebrafish by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry with Broader Applications

Les métaux et les composés à base de métaux comprennent de multiples xénobiotiques pharmaco-actifs et toxicologiques. De la toxicité des métaux lourds aux agents chimiothérapeutiques, la toxicocinétique de ces composés a une pertinence à la fois historique et moderne. Le poisson-zèbre est devenu un organisme modèle attrayant pour élucider la pharmacocinétique et la toxicocinétique dans les études d’exposition environnementale et de traduction clinique. Bien que les études sur le poisson-zèbre aient l’avantage d’être plus performantes que les modèles de rongeurs, le modèle comporte plusieurs contraintes importantes.
L’une de ces limitations est inhérente au schéma posologique à base d’eau. Les concentrations d’eau de ces études ne peuvent pas être extrapolées pour fournir des dosages internes fiables. Les mesures directes des composés à base de métaux permettent une meilleure corrélation avec les réponses moléculaires et biologiques liées aux composés. Pour surmonter cette limitation pour les métaux et les composés à base de métaux, une technique a été développée pour digérer le tissu larvaire du poisson zèbre après exposition et quantifier les concentrations de métaux dans les échantillons de tissus par spectrométrie de masse plasmatique à couplage inductif (ICPMS).
Les méthodes ICPMS ont été utilisées pour déterminer les concentrations métalliques de platine (Pt) du cisplatine et du ruthénium (Ru) à partir de plusieurs nouveaux agents chimiothérapeutiques à base de Ru dans les tissus du poisson-zèbre. De plus, ce protocole distinguait les concentrations de Pt qui étaient séquestrées dans le chorion de la larve par rapport au tissu du poisson-zèbre. Ces résultats indiquent que cette méthode peut être appliquée pour quantifier la dose de métal présente dans les tissus larvaires. En outre, cette méthode peut être ajustée pour identifier des métaux ou des composés à base de métaux spécifiques dans un large éventail d’études d’exposition et de dosage.

Ces résultats ont déjà été publiés24. Des études sur l’absorption tissulaire ont été menées avec des expositions à base d’eau de cisplatine et d’un nouveau composé anticancéreux à base de Ru, PMC79. La létalité et l’éclosion retardée ont été évaluées pour les concentrations nominales de cisplatine 0, 3,75, 7,5, 15, 30 et 60 mg/L de cisplatine. L’accumulation de Pt dans le tissu de l’organisme a été déterminée par l’analyse icPMS, et le tissu de l’organisme contenait des doses respectives de 0,05, ...

L’augmentation du taux d’analyses pharmacocinétiques et toxicocinétiques des métaux et des composés à base de métaux chez le poisson-zèbre peut être avantageuse pour les études de traduction environnementales et cliniques. La limitation de l’absorption inconnue d’exposition à l’eau a été surmontée en effectuant une analyse des métaux traces sur les tissus digérés du poisson-zèbre à l’aide de la spectrométrie de masse plasmatique à couplage inductif.

Absorption de dose de l’exposition aux composés à base de platine et de ruthénium chez le poisson-zèbre par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif avec des applications plus larges

Metals and metal-based compounds comprise multifarious pharmaco-active and toxicological xenobiotics. From heavy metal toxicity to chemotherapeutics, the ...

Le poisson-zèbre est un modèle attrayant, mais les scientifiques ne savent pas combien l’organisme absorbe avec le dosage à base d’eau. Nous avons développé une technique pour digérer les tissus après exposition et quantifier les métaux via ICPMS. Cette technique nous permet de quantifier et de valider avec précision la réponse dose à l’aide de l’ICPMS.Cette méthode a beaucoup de potentiel. Les expositions pharmacologiques ou environnementales aux métaux peuvent être appliquées du niveau cellulaire jusqu’à des systèmes d’organes entiers dans des modèles animaux. Ajouter environ 0,25 millilitre d’acide nitrique de haute pureté aux tubes centrifuges en polypropylène de 15 millilitres pour un maximum de 10 larves.Ultrasons pendant une heure pour prédigérer les échantillons. Pour les ultrasons, effectuez de courts cycles de digestion des tissus à intervalles de cinq minutes dans un digesteur à micro-ondes sans danger pour l’acide jusqu’à ce que tous les tissus soient visiblement oxydés, produisant une solution jaune uniforme et claire. Surveillez attentivement l’intégrité des tubes pour éviter toute rupture et effectuez de courtes rotations dans la centrifugeuse entre les cycles.Une fois que le tissu est visiblement oxydé, diluer les échantillons dans une hotte à 3,5% d’acide nitrique en utilisant 6,75 millilitres d’eau de haute pureté et de vortex pour bien mélanger. Ensuite, pour effectuer une courbe d’étalonnage à 7 points appariée par matrice pour tenir compte de toute interférence isobare potentielle. En utilisant une concentration en stock de l’étalon élémentaire certifié aqueux, prenez une aliquote de 0,1 millilitre et, par pipette, dans un nouveau tube de centrifugeuse de 15 millilitres.Diluer avec de l’acide nitrique à 3,5% jusqu’à un volume final de 10 millilitres pour produire 10 parties par milliard de solutions étalons. En utilisant les 10 parties par milliard de stock, faites les dilutions en série 0,1, 1,0 et 5,0 parties par milliard de solutions standard dans de l’acide nitrique à 3,5%. En utilisant le stock 0,1, faites les dilutions en série 0,001, 0,005 et 0,01 parties par milliard de solutions étalons dans de l’acide nitrique à 3,5%.Ensuite, avant de préparer l’instrument ICPMS pour l’analyse des échantillons, assurez-vous que la vanne de gaz argon est ouverte, que tous les tubes sont bien connectés et propres, que l’acide nitrique à 5% est ouvert pour le rinçage des tubes et de la verrerie entre les analyses d’échantillons. Vérifiez l’état de la torche et des cônes et assurez-vous que la boîte de la torche est bien verrouillée. Et le tube de drainage de la chambre de pulvérisation est correctement connecté à la péripompe.Ouvrez le logiciel, vérifiez les lectures de vide et assurez-vous que toutes les turbopompes fonctionnent à 100% Cliquez sur DÉMARRER dans la fenêtre d’état du système Plasma Control pour lancer la séquence de démarrage. Allumez la pompe à plasma et le refroidisseur de plasma, perchez le nébuliseur et allumez le plasma. Attendez que le plasma soit allumé et stable lorsque la fenêtre État indique que la séquence de démarrage est terminée.À ce stade, observez les points verts sur la fenêtre d’état du système qui indiquent que tous les blocs d’alimentation sont allumés. Dans la barre de menus, cliquez sur Contrôle, Échantillonneur automatique dans le menu déroulant. Entrez dans la position du rack d’échantillonneur automatique pour le tube contenant 5% d’acide nitrique, laissez l’acide pénétrer dans le plasma.Dans la barre de menus, cliquez sur Scans, Magnet dans le menu déroulant. Dans la fenêtre MagnetScan, tapez 115 dans la position de masse du marqueur et cliquez sur Entrée. Laissez l’aimant balayer la plage de masse pendant 30 minutes pendant que l’instrument se réchauffe.Après 30 minutes, utilisez la commande d’échantillonneur automatique pour passer à la position d’une solution de réglage multi-éléments d’une partie par milliard. Aspirez la solution d’accord et accordez l’instrument pour optimiser la lecture du signal. Ajustez la position de la torche pour les coordonnées X, Y, Z, de sorte que la torche s’aligne avec le centre des cônes et le débit du nébuliseur dans la fenêtre De contrôle du plasma.Effectuez les ajustements nécessaires dans la fenêtre Réglage de l’optique ionique pour la source, le détecteur et l’analyseur. Une fois la lecture du signal optimisée, cliquez sur Arrêter dans la fenêtre Magnet Scan, cliquez sur Calibrer l’aimant et sélectionnez une basse résolution dans la fenêtre contextuelle. Cliquez sur OK et ouvrez le fichier smc d’étalonnage de masse pour calibrer l’aimant.Cliquez sur Enregistrer, Utiliser pour appliquer l’étalonnage actuel de l’aimant aux analyses. Lorsque vous mesurez des échantillons inconnus avec une vaste gamme de concentrations, effectuez un étalonnage de détecteur pour comparer les signaux de comptage d’impulsions ioniques à de faibles concentrations aux signaux ioniques atténués produits à des concentrations plus élevées. Lancez l’analyse de l’échantillon en cliquant sur Acquisition de données, puis cliquez sur Configuration de la méthode dans le menu déroulant.Utilisez une méthode existante fournie par le fabricant ou créez une méthode basée sur les éléments d’intérêt. Si nécessaire, ajustez le mode d’analyse, le temps d’arrêt, le délai de commutation, le nombre de balayages et de cycles, la résolution, le mode de détection et la masse de stationnement pour les paramètres du déflecteur. Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les paramètres de la méthode.Optimisez les paramètres pour chaque métal et isotype. Dans la barre de menus, cliquez sur Acquisition de données. Cliquez sur Batch Run dans le menu déroulant.Vous pouvez également cliquer sur l’icône BATCH sous la barre de menus, importer les paramètres de lot à partir d’une feuille de calcul ou créer une séquence dans la fenêtre Batch Run. Entrez le type d’échantillon, la position du rack d’échantillonneur automatique, le temps de transfert, le temps de lavage, les répliques, l’ID d’échantillon et le fichier de méthode. Organisez l’exécution du lot pour obtenir des solutions standard pour la courbe d’étalonnage, suivie d’une norme de contrôle de la qualité, puis d’échantillons inconnus.Surveiller la dérive de l’instrument et la reproductibilité des échantillons en incluant une norme de contrôle de la qualité de 0,5 partie par milliard tous les 5 à 10 échantillons. Des études sur l’absorption tissulaire ont été menées avec des expositions à l’eau au cisplatine et à un nouveau composé anticancéreux à base de ruthénium PMC79. La létalité et l’éclosion retardée ont été évaluées pour les concentrations nominales de cisplatine.0, 3,75, 7,5 15, 30 et 60 milligrammes par litre de cisplatine. L’accumulation de platine dans les tissus de l’organisme a été déterminée par l’analyse ICPMS et le tissu de l’organisme contenait des doses respectives de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 et 461,9 nanogrammes par organisme. Un retard d’éclosion a été observé à toutes les concentrations de cisplatine.Après la déchorionation, les chorions ont été collectés et analysés séparément pour le platine. Les doses non létales de cisplatine utilisées pour les études de déchorionation ont déterminé que 93 à 96% de la dose totale délivrée de cisplatine s’étaient accumulées dans le chorion, la dose restante dans le tissu larvaire. Les larves de poisson zèbre ont été exposées à 0, 3,1, 6,2, 9,2 et 12,4 milligrammes par litre de PMC79.Ces concentrations ont été déterminées analytiquement pour contenir 0, 0,17, 0,44, 0,66 et 0,76 milligrammes par litre de ruthénium. Contrairement à ce cisplatine, l’éclosion retardée n’a pas été observée chez les larves exposées au PMC79. Les chorions n’ont pas été inclus dans l’analyse du ruthénium car ils se sont naturellement dégradés avant la collecte des larves.Le métal massif dans les tissus larvaires analysés à chaque concentration était de 0,19, 0,41 et 0,68 nanogramme de ruthénium par larve. Tous les réactifs ajoutés au protocole d’exposition donnent le potentiel d’interférences isobares. Dans la mesure du possible, envisagez des alternatives comme le refroidissement rapide par rapport à la tricaïne.Cette méthode permet de quantifier la dose de métal pour la toxicité, l’efficacité et les expériences à comparer avec des vertébrés supérieurs. Nous étions particulièrement enthousiastes à l’idée que notre dose seuil se situait dans un ordre de grandeur donné aux patients.

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