Name: Une approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Découvrez la micro-électrophorèse sur gel à gradient de température pour détecter rapidement l'édition de l'ARN sans séquençage. Cette méthode portable et économique identifie les substitutions de bases uniques avec une grande reproductibilité.

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Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (17H02204 et 18K19288). Ruchika a été soutenu financièrement par le gouvernement japonais (bourse MEXT). Nous remercions Mme Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) et le Dr Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) pour leur aide dans les expériences liées à l’électrophorèse.

1. Optimisation du fragment cible
NOTE: Quatre gènes modifiés ont été utilisés dans le développement de ce protocole, y compris deux gènes nucléaires (AT2G16586 et AT5G02670) d’A. thaliana, et les gènes codant pour la protéine fluorescente bleue (BFP) et la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) exprimée dans les cellules HEK293.
<ol><li>Pour identifier les fragments de gènes avec différents profils de fusion, représentant des régions modifiées ou non éditées, générez des courbes de fusion prédites à l’aide de l’outil Web uMelt HETS, une extension du logiciel uMelt original13. REMARQUE: Cet outil prédit les formes des courbes de fusion pour les produits hétéroduplex et homoduplex.</li>
	<li>Pour chaque gène cible, concevez trois paires de fragments de gènes (300-324 bp de longueur). Chaque paire comprend un fragment avec un site édité et un fragment de type sauvage correspondant avec un site non édité, situé à l’extrémité 5'-terminal, à la position médiane ou à l’extrémité 3'-terminale.</li>
	<li>Sélectionnez la paire non modifiée/modifiée qui a montré la différence maximale entre les régions de fusion sur l’axe d’hélicité pour une analyse plus approfondie. Pour l’analyse μTGGE, synthétiser le fragment de gène sélectionné par amplification PCR, comme décrit à la rubrique 2 ci-dessous.</li>
	<li>Concevez les amorces avant et arrière à l’aide du logiciel DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) et vérifiez à l’aide de l’outil NCBI Primer-BLAST.</li>
	<li>Diluer les amorces dans un tampon TE (10 mM de Tris-HCl contenant 1 mM d’EDTA· Na2) et les conserver à une concentration de 100 pmol/μL. Avant utilisation, diluer chaque apprêt à une concentration de 10 pmol/μL à l’aide d’eau distillée.</li>
</ol>2. Extraction de l’ARN et amplification RT-PCR du fragment cible
<ol><li>Extraction de l’ARN<ol>
<li>Extraire l’ARN total de la source des gènes modifiés et non édités à l’aide de méthodes standard, telles que l’extraction TRIzol14 ou des kits disponibles dans le commerce.</li>
		<li>Effectuer la synthèse de l’ADNc correspondant à l’aide d’un protocole RT-PCR standard tel que décrit à l’étape 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transcription inverse<ol>
<li>Ajouter 1 μL d’amorce oligo(dT), 1 μL de mélange de dNTP de 10 mM, 10 μL d’ARN total et 10 μL d’eau distillée stérile dans un tube de microcentrifugation sans nucléase.</li>
		<li>Chauffer le mélange à 65 °C pendant 5 min puis incuber sur de la glace pendant au moins 1 min.</li>
		<li>Recueillir le contenu du tube par centrifugation à la vitesse maximale (12 000 x g) pendant 2-3 s, et ajouter 4 μL de tampon ReverTra Ace 5x, 1 μL de 0,1 M TNT et 1 μL de transcriptase inverse M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) (200 U/μL, Table des matières).</li>
		<li>Mélanger en pipetant doucement vers le haut et vers le bas. Si vous utilisez des amorces aléatoires, incuber le tube à 25 °C pendant 5 min.</li>
		<li>Incuber le tube à 55 °C pendant 60 min, puis inactiver la réaction en chauffant à 70 °C pendant 15 min, dans un bain sec numérique/bloc chauffant.</li>
		<li>Mesurer la concentration d’ADNc à l’aide d’un spectrophotomètre et la stocker à -25 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplification par PCR et séquençage de confirmation des produits
	<ol>
<li>Ajouter les réactifs suivants à un tube de microcentrifugation sans nucléase : 4 μL de 5x tampon de polymérase Taq, 2 μL de mélange dNTP de 2 mM, 2 μL de 25 mMMgCl2, 1,6 μL de l’ensemble d’amorce (avant et arrière; chacun 10 mM), 2 μL de gabarit d’ADNc, 0,1 μL de polymérase Taq (2,5 U/μL) et 8,3 μL d’eau distillée stérile (volume final, 20 μL).</li>
		<li>Effectuer la PCR dans les conditions de cycle suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 2 min ; 35 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 2 min, de recuit à une température appropriée (en fonction de l’ensemble d’apprêt spécifique utilisé) pendant 30 s et d’extension à 72 °C pendant 2 min; puis une dernière prolongation à 72 °C pendant 7 min.</li>
		<li>Pour purifier les produits de PCR, ajouter 2 U d’exonucléase I et 0,5 U de phosphatase alcaline de crevette (ExoSAP). Incuber le tube dans un cycleur thermique à 37 °C pendant 1 h, puis à 80 °C pendant 15 min, puis maintenir à 4 °C jusqu’à l’étape suivante.</li>
		<li>Pour le séquençage de confirmation, ajouter 11,5 μL d’eau distillée stérile, 2,5 μL d’apprêt avant ou arrière et 1 μL de produits PCR (avec ExoSAP) à un nouveau tube de microcentrifugation. REMARQUE: Utilisez les services de séquençage de l’ADN (par exemple, Eurofins Genomics) pour l’analyse du séquençage.</li>
		<li>Pour valider la spécificité des produits PCR, effectuez le séquençage avec des amorces avant et arrière. Les paires d’amorces utilisées dans l’analyse représentative sont données dans le tableau 1.</li>
		<li>Diluer les produits PCR purifiés à une concentration de 200 ng/μL avec de l’eau désionisée. Ensuite, mélangez 6 μL du produit purifié avec 3 μL de colorant à chargement de gel 6x dans un tube de 250 μL et augmentez le volume total à 12 μL avec de l’eau stérile. Conservez le produit PCR (à -25 °C) jusqu’à ce qu’il soit prêt à procéder avec μTGGE comme décrit ci-dessous.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse μTGGE
REMARQUE: L’analyse μTGGE est effectuée à l’aide d’un système miniaturisé et économique. La figure 2 présente une vue d’ensemble du système complet, y compris les cassettes en gel, le support de cassette en gel, la plate-forme d’électrophorèse horizontale sur gel, l’alimentation et le système d’imagerie sur gel.
<ol><li>Assemblage des cassettes de gel<ol>
<li>La cassette de gel utilisée pour l’analyse μTGGE est illustrée à la figure 2A. La conception se compose de trois plaques de gel de 1 pouce: une plaque de gel inférieure, une plaque de gel supérieure et une plaque de séparation. Sandwich la plaque de gel supérieure entre les deux autres plaques et assembler dans le support de cassette de gel pour la polymérisation du gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de gel de polyacrylamide<ol>
<li>Ajouter 7,2 g d’urée dans un tube de 50 mL et dissoudre dans 10 mL d’eau stérile. Chauffer l’échantillon au micro-ondes pendant 20 à 30 s, puis le ramener à température ambiante (RT).</li>
		<li>Ajouter à la solution 3 mL de tampon 5x Tris/borate/EDTA (TBE) (Table des matériaux), 2,25 mL d’acrylamide/bis à 40 % (p/v) (19:1), 75 μL de persulfate d’ammonium 10x et 15 μL de tétraméthyléthylènediamine.</li>
		<li>Versez immédiatement la solution de gel dans le support de cassette de gel lentement, en évitant la formation de bulles d’air.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Génération de profils de fusion à l’aide de l’unité μTGGE<ol>
<li>Utilisez la version miniaturisée et économique de l’appareil μTGGE illustré à la figure 2 avec un gradient de température (25-65 °C) fixé perpendiculairement à la direction de la migration de l’ADN.</li>
		<li>Faire tremper les tampons tampons d’électrophorèse supérieurs et inférieurs (0,5 cm x 2,5 cm) dans 2 mL de tampon 1x TBE.</li>
		<li>Placez la cassette de gel dans l’unité de la chambre d’électrophorèse horizontale et positionnez les tampons tampons supérieurs et inférieurs en conséquence, comme illustré à la figure 2.</li>
		<li>Ensuite, chargez 10 μL du produit PCR dans le puits central (plus long) et 1 μL du produit PCR dans chaque puits latéral.</li>
		<li>Après 1 min d’attente, branchez l’unité d’alimentation et alimentez 100 V pendant 12 min à un gradient de température linéaire de 25 à 65 °C.</li>
		<li>Une fois l’exécution terminée, retirez la cassette et retirez le couvercle supérieur en verre.</li>
		<li>Versez 300 μL de 10x SYBR Gold sur le gel. Visualisez les profils de fusion à l’aide de la lampe de poche LED bleue installée dans le dispositif électrophorétique de la taille d’une paume. REMARQUE: Un fichier souple de l’image de gel doit être enregistré pour le calcul du score de similitude de modèle (PaSS).</li>
		<li>Répétez chaque expérience électrophorétique 3x pour confirmer la reproductibilité des données.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Calculs PaSS
REMARQUE: Les calculs sont effectués à l’aide du logiciel μTGGE Analyzer.
<ol><li>Téléchargez et ouvrez le logiciel.</li>
	<li>Ouvrez le fichier JPEG contenant l’image gel. Notez que le logiciel n’acceptera que les fichiers au format JPEG.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Cadre et sélectionnez la zone appropriée (cadre) de l’image gel.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Correction de coordonnées et ajoutez deux points de référence, comme illustré à la figure 1B.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Ajout de points d’entité et ajoutez des points d’échantillonnage comme illustré à la figure 1B. Enregistrez ensuite les données d’image de gel traitées au format μTGGE (*.tgg).</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Exemple et sélectionnez l’option Rechercher des points simples pour comparer deux images ou plus.</li>
</ol>

<ol><li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114(2007).</li>
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<li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li>
<li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uMELT%3A+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+Reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li>
<li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+of+BFP%2C+a+point+mutant+of+GFP%2C+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304(2020).</li>
<li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+%28ADARs%29+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li>
<li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635(2021).</li>
<li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

L’édition de l’ARN joue un rôle important en biologie; cependant, les méthodes actuelles de détection de l’édition de l’ARN, telles que la chromatographie et le séquençage, présentent plusieurs défis en raison de leur coût élevé, de leurs exigences de temps excessives et de leur complexité. Le protocole décrit ici est une méthode simple, rapide et rentable de détection de l’édition de l’ARN qui utilise un système portable, microdimensionnel et basé sur TGGE. Ce système peut être utilisé pour différencier les gènes modifi...

Les variantes mononucléotidiques (SNV) dans l’ARN génomique, y compris les variantes A-to-I, C-to-U et U-to-C, peuvent indiquer des événements d’édition de l’ARN. Cependant, la détection des SNV dans l’ARN reste une tâche techniquement difficile. Classiquement, le rapport entre l’ARN modifié et l’ARN non modifié est déterminé par séquençage direct, réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel spécifique à l’allèle ou par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) dénaturante 1,2,3,4,5,6. Cependant, ces approches ne sont pas particulièrement rapides ou rentables, et leur faible précision, causée par des niveaux élevés de bruit, pose des goulots d’étranglement technologiques pour la détection du SNV à base d’ARN 7,8. Ici, nous décrivons un protocole basé sur l’électrophorèse sur gel à gradient de température (TGGE) pour identifier les polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP) comme une méthode alternative qui élimine le besoin d’approches de séquençage direct de l’ARN pour les analyses d’édition de l’ARN.
L’électrophorèse est une méthode privilégiée pour la séparation et l’analyse des biomolécules dans les laboratoires de sciences de la vie. TGGE permet la séparation de fragments d’ADN double brin de la même taille mais ayant des séquences différentes. La technique repose sur des différences liées à la séquence dans les températures de fusion des fragments d’ADN et les changements ultérieurs dans leurs mobilités dans les gels poreux avec un gradient de température linéairede 9,10. La fusion de fragments d’ADN génère des profils de fusion spécifiques. Une fois que le domaine avec la température de fusion la plus basse atteint la température correspondante à une position particulière dans le gel, la transition d’une structure hélicoïdale à une structure partiellement fondue se produit et la migration de la molécule s’arrêtera pratiquement. Par conséquent, TGGE utilise à la fois la mobilité (informations sur la taille) et les transitions structurelles induites par la température des fragments d’ADN (informations dépendantes de la séquence), ce qui en fait une approche puissante pour la caractérisation des fragments d’ADN. Les points caractéristiques d’un motif de fusion TGGE, qui correspondent à trois transitions structurelles de la molécule d’ADN, sont le point de dissociation initiale du brin, le point de dissociation intermédiaire du brin et le point de dissociation finale du brin (Figure 1). Les variations de séquence au sein des domaines, même les différences de base unique, affectent la température de fusion, par conséquent, les molécules avec des séquences différentes montreront des modèles de fusion discrets (dénaturation) dans les analyses TGGE. Par conséquent, TGGE peut être utilisé pour analyser les SNV dans l’ARN génomique et peut être une méthode inestimable à haut débit pour détecter l’édition de l’ARN. Ce gain à haut débit est perdu lorsque le TGGE traditionnel à base d’électrophorèse sur gel est utilisé. Cependant, une version miniaturisée de TGGE, nommée microTGGE (μTGGE), peut être utilisée pour raccourcir le temps électrophorétique du gel et accélérer l’analyse avec une augmentation de 100 fois de la productivité11. La simplicité et la compacité de la méthode μTGGE ont été améliorées par l’introduction de PalmPAGE12, un système d’électrophorèse sur gel applicable sur le terrain, portable et abordable.
Ici, un nouveau protocole basé sur TGGE est utilisé pour examiner trois types de sites d’édition d’ARN (A-to-I, C-to-U et U-to-C) dans quatre gènes, dont deux provenant de tissus d’Arabidopsis thaliana et deux exprimés dans des cellules HEK293 de mammifères (Figure 1A). Le protocole intègre l’utilisation de PalmPAGE (matériel), un système portable pour la détection rapide de l’édition d’ARN, et uMelt (logiciel)13. Avec une durée d’exécution moyenne de 15 à 30 minutes, ce protocole permet une identification rapide, fiable et facile de l’édition de l’ARN sans avoir besoin d’approches de séquençage direct de l’ARN.

<table><tbody><tr><td>2U ExoI</td><td>Takara</td><td>2650A</td><td>Exonucléase I</td></tr><tr><td>40(v/v) %-acrylamide/bis (19:1)</td><td>Thermo fisher</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Mini spin</td><td>eppendorf</td><td>5452000034</td><td></td></tr><tr><td>Bain sec numérique / chauffage à bloc</td><td>Thermo fisher</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mélange maître de polymérases Gold Taq</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase LATaq</td><td>TAKARA</td><td>RR002A</td><td>Taq polymérase</td></tr><tr><td>micro-TGGE&nbsp ; Porte-cassette</td><td>BioSeeds Corp.</td><td>BS-GE-CH</td><td></td></tr><tr><td>Appareil micro-TGGE</td><td>Lifetech Corp.</td><td>TG</td><td></td></tr><tr><td>micro-TGGE gel cassette</td><td>BioSeeds Corp.</td><td>BS-TGGE-C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>Thermo fisher</td><td>ND-1000</td><td>Spectrophotomètre</td></tr><tr><td>Kit Plant Rneasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>TRT101</td><td>M-MLV (virus de la leucémie de Moloney Murine) transcriptase inverse</td></tr><tr><td>Kit Rneasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline des crevettes</td><td>Takara</td><td>2660B</td><td></td></tr><tr><td>Coloration en gel d’acide nucléique SYBR Gold</td><td>Thermo fisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TBE</td><td>Thermo fisher</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthyléndiléndiamine (TEMED)</td><td>Tesque de Nacalai</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>Urée, nucléase et protéase testés</td><td>Tesque de Nacalai</td><td>35940-65</td><td></td></tr></tbody></table>

une approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’arn

A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

L’édition de l’ARN est un processus qui conduit à des altérations de séquence posttranscriptionnelles dans les ARN. La détection et la quantification de l’édition de l’ARN reposent principalement sur les techniques de séquençage et de séquençage de l’ARN de Sanger. Cependant, ces méthodes peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps. Dans ce protocole, un système portable d’électrophorèse sur gel à gradient de microtempérature (μTGGE) est utilisé comme approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN. Le processus est basé sur le principe de l’électrophorèse, qui utilise des températures élevées pour dénaturer les échantillons d’acides nucléiques lorsqu’ils se déplacent sur un gel de polyacrylamide. Sur une plage de températures, un fragment d’ADN forme un gradient d’ADN entièrement double brin vers des brins partiellement séparés, puis vers un ADN simple brin entièrement séparé. Les sites d’ARN avec des bases nucléotidiques distinctes produisent différents profils de fusion dans les analyses μTGGE. Nous avons utilisé l’approche basée sur μTGGE pour caractériser les différences entre les profils de fusion de quatre fragments d’ARN modifiés et leurs fragments non édités (de type sauvage) correspondants. Les scores de similitude des modèles (PaSS) ont été calculés en comparant les modèles de bande produits par les ARN édités et non édités et ont été utilisés pour évaluer la reproductibilité de la méthode. Dans l’ensemble, la plate-forme décrite ici permet de détecter même des mutations de base unique dans les ARN de manière directe, simple et rentable. On s’attend à ce que cet outil d’analyse aide à de nouvelles découvertes en biologie moléculaire.

Utilisation de μTGGE pour identifier les changements de base nucléotidique unique dans les événements d’édition de l’ARN Quatre gènes modifiés ont été utilisés pour ce protocole (tableau 1), y compris le gène BFP produit dans les cellules HEK293 (avec l’édition de l’ARN C à U par les enzymes désaminases du complexe enzymatique d’édition de l’ARNm apolipoprotéine B; APOBEC115), le gène EGFP contenant le codon stop ocre (TAA) produit dans les cellules HEK293 (ave...

La détection rapide et la quantification fiable des événements d’édition de l’ARN à l’échelle génomique restent difficiles et reposent actuellement sur des méthodes de séquençage direct de l’ARN. Le protocole décrit ici utilise l’électrophorèse sur gel à gradient de microtempérature (μTGGE) comme méthode simple, rapide et portable de détection de l’édition de l’ARN.

Une approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

L’édition de l’ARN joue un rôle essentiel dans les maladies humaines. Les scientifiques trouvent une application infinie dans les médicaments. Ce protocole démontre l’application de la technologie d’électrophorèse à température portable en tant qu’approche non séquentielle pour l’identification rapide et fiable de la modification de l’ARN dans l’édition de l’ARN sans avoir besoin d’un séquençage direct de l’ARN.L’approche basée sur l’électrophorèse micro tTG a été utilisée pour caractériser les différences entre le profil de fusion de quatre fragments d’ARN modifiés et leurs fragments non édités correspondants. Les scores de similitude des modèles ont été utilisés pour évaluer la reproductibilité de la méthode. Cette plate-forme permet la détection de substitutions même à base unique dans les ARN, de manière directe, simple et rentable.On s’attend à ce que cet outil d’analyse aide à de nouvelles découvertes en biologie moléculaire Commencez par identifier des fragments de gènes avec différents profils de fusion et générez des courbes de fusion prédites à l’aide de l’outil Web Umelt HETS. Concevoir trois paires de 300 à 324 fragments de gènes de paires de bases pour chaque gène cibl

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En raison de la nature transitoire de pré-ARNm, il peut être difficile d'isoler et...

Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l&#39;homme pré-ARNm

Un test basé sur des ribozymes très sensibles, applicable au criblage à haut débit de produits chimiques ciblant le processus unique d’édition de l’ARN chez les pathogènes trypanosomatidés, est décrit dans cet article. Les inhibiteurs peuvent être utilisés comme outils pour l’analyse hypothétique du processus d’édition de l’ARN et, en fin de compte, comme thérapeutiques.

ARN catalyseur en tant que reporter pour le criblage de médicaments contre l&#39;ARN Édition dans trypanosomes

Nous décrivons ici un protocole visant à étudier l'impact de l'épissage aberrant sur la résistance aux médicaments dans les tumeurs solides et des cancers hématologiques. Pour cet objectif, nous avons analysé les profils transcriptomiques des modèles parentaux et résistants in vitro par l' ARN-seq et établi une méthode basée qRT-PCR pour valider les gènes candidats.

En utilisant l&#39;ARN-séquençage pour détecter de nouveaux variants d&#39;épissage associés à la résistance aux médicaments dans<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles de cancer

Le séquençage de prochaine génération (NGS) est un outil puissant pour la caractérisation génomique qui est limité par le taux élevé d’erreurs de la plateforme (~0.5–2.0%). Nous décrivons nos méthodes de séquençage de l’erreur-corrigé qui nous permettent d’éviter le taux d’erreur NGS et détecter les mutations aux fractions d’allèle variant aussi rares que 0,0001.

Détection des événements rares en utilisant l’erreur corrigée ADN et le séquençage de l’ARN

Ici nous présentons un protocole pour le clivage DNAzyme-dépendant de l'ARN. Cela permet une analyse rapide et dépendante du site de l'ARN 2'-O-méthylation. Cette approche peut être utilisée pour l'évaluation préliminaire ou majeure de l'activité du snoRNA.

Analyse Dépendante de DNAzyme de rRNA 2'-O-Methylation

Nous présentons un protocole détaillé de réparation de petite bibliothèque d'ARN avec moins de biais que les méthodes standard et une sensibilité accrue pour les ARN 2'-O-méthyle. Ce protocole peut être suivi à l'aide de réactifs faits maison pour économiser des coûts ou en utilisant des kits pour plus de commodité.

Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour une méthode de séquençage basée sur la LC-MS qui peut être utilisée comme méthode directe pour séquencer l’ARN court (&lt;35 nt par exécution) sans intermédiaire d’ADNc, et comme méthode générale pour séquencer différentes modifications nucléotidiques dans une seule étude avec une précision de base unique.

2D-HELS MS Seq : une méthode générale basée sur LC-MS pour le séquençage direct et de novo de mélanges d’ARN avec différentes modifications nucléotidiques

L’épissage alternatif (AS) et la polyadénylation alternative (APA) élargissent la diversité des isoformes de transcrits et de leurs produits. Ici, nous décrivons des protocoles bioinformatiques pour analyser les tests de séquençage d’ARN en vrac et de séquençage à 3' pour détecter et visualiser l’AS et l’APA variant selon les conditions expérimentales.

Identification d’un épissage alternatif et d’une polyadénylation dans les données de séquençage de l’ARN

La délivrance des éditeurs génomiques sous forme d’ARN est un moyen particulièrement puissant de modifier les génomes des cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères. L’objectif de ce protocole est de délivrer des éditeurs de génome sous forme d’ARNm dans les cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères, suivis d’un séquençage ciblé Illumina et d’une analyse afin de quantifier les résultats d’édition.

Édition génomique dans les cellules primaires de mammifères via électroporation de l’ARN éditeur

Quantitatives à haut débit, en temps réel, et sans étiquette de détection biomoléculaire (ADN, protéines, etc) sur...

Détection biomoléculaire employant le capteur interférométrique Réflectance Imaging (IRIS)

Découvrez la micro-électrophorèse sur gel à gradient de température pour détecter rapidement l'édition de l'ARN sans séquençage. Cette méthode portable et économique identifie les substitutions de bases uniques avec une grande reproductibilité.

Une approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN

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