Name: Purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Apprenez à purifier les protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères. Cette méthode permet d'étudier les rôles de l'ubiquitination dans la régulation de la fonction protéique en conservant les modes de liaison.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81972624) à D.L.

REMARQUE: Les cellules H1299 ont été aimablement fournies par la Banque de cellules souches de l’Académie chinoise des sciences et se sont révélées négatives pour la contamination par les mycoplasmes.
1. Culture cellulaire
<ol><li>Pour la culture initiale, placer 1 x 106 cellules de lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire humain, H1299 dans une boîte de Petri de 10 cm avec 10-12 mL de milieu RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% d’additif glutamine, 1% de pyruvate de sodium et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Maintenir les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2. Divisez les cellules tous les 2-3 jours selon le moment où elles atteignent 80% à 90% de confluence.</li>
	<li>Un jour avant la transfection, préparer 6-9 x 10 6 cellules pour trois boîtes de Petri et plaquer 2-3 x 106 cellules dans une seule boîte de Petri de 10 cm contenant 10-12 ml de milieu pour obtenir une confluence de 70%-90% pendant la transfection. REMARQUE: Les cellules HEK293T peuvent également être utilisées pour purifier les protéines ubiquitinées en raison de leur efficacité de transfection élevée et de leur niveau d’expression protéique.</li>
</ol>2. Transfection plasmidique
<ol><li>Ajouter 1,5 mL de milieu sérique réduit dans trois tubes centrifugés de 15 mL.</li>
	<li>Ajouter l’ADN plasmidique prêt pour la transfection dans chaque tube pour faire les dilutions comme suit. Tube 1 : 1 μg de plasmide Flag-p53, 12 μg de vecteur vide ; Tube 2 : 1 μg de plasmide Flag-p53, 3 μg de plasmide His-HA-Ub (HH-Ub) et 9 μg de vecteur vide ; Tube 3 : 1 μg de plasmide Flag-p53, 3 μg de plasmide HH-Ub et 9 μg de plasmide Mdm2. Ajouter un total de 0,2 μg de plasmide de protéine fluorescente verte (GFP) à chaque tube pour surveiller l’efficacité de la transfection. NOTE: Une expérience pilote doit être effectuée pour déterminer les quantités optimales de plasmides nécessaires pour obtenir une expression efficace des protéines cibles dans les cellules.</li>
	<li>Ajouter 78 μL de réactif de transfection des liposomes à 4,5 mL de milieu sérique réduit dans un autre tube de centrifugation pour diluer les liposomes. Bien mélanger en agitant le tube et laisser reposer pendant 5 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Ajouter 1,5 mL de la solution de liposomes diluée dans chaque tube de l’étape 2.2 contenant 1,5 mL de la solution d’ADN dilué. Bien mélanger et réticuler les plasmides avec les liposomes pendant au moins 20 minutes à TA. Utilisez un rapport ADN plasmidique: liposome de 1:2 (μg:μL) pour chaque transfection.</li>
	<li>Jeter le milieu original des boîtes de Petri et ajouter 9 ml de milieu sérique réduit dans chaque boîte. Ajouter 3 mL du mélange liposome-ADN à chaque plat et mélanger la solution en secouant doucement la plaque d’avant en arrière 3x, puis à gauche et à droite 3x pour une répartition uniforme du mélange dans la plaque.</li>
	<li>Culture des cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2. Remplacez le milieu après 4-6 h et continuez à cultiver les cellules pendant 24-36 h.</li>
</ol>3. Collecte de cellules
<ol><li>Après 24-36 h, traiter les cellules avec MG132 à une concentration finale de 10 μM pendant 4-6 h. REMARQUE: MG132 est un aldéhyde peptidique qui bloque efficacement l’activité protéolytique du complexe protéasome 26S. Les quantités de protéines ubiquitinées avec des chaînes de polyubiquitine liées à la lysine-48 (K48) peuvent être augmentées après que les cellules sont traitées avec MG132 ou d’autres inhibiteurs du protéasome.</li>
	<li>Jeter le milieu, laver les cellules 2x (en prenant soin de ne pas rincer les cellules) avec une solution saline tamponnée au phosphate glacé (PBS) et aspirer les cellules avec des pipettes sérologiques.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS à la boîte, retirer les cellules en grattant avec un grattoir propre et transférer la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation. Centrifuger à 700 x g pendant 5 min pour recueillir les pastilles cellulaires.</li>
</ol>4. Purification des protéines ubiquitinées dans des conditions non dénaturantes
<ol><li>Préparer le tampon de lyse Flag (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM éthylène diamine tétraacétique acide (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosyl et 10% glycérol) fraîchement complété avec un cocktail inhibiteur de protéase avant utilisation.</li>
	<li>Ajouter 800 μL de tampon de lyse Flag glacé aux cellules de chaque tube, mélanger les cellules à l’aide d’un oscillateur vortex ou d’un pistolet à pipette, puis incuber le mélange sur un rotateur à 4 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Soumettre le mélange à 5-10 brèves impulsions d’ultrasons. Effectuez les ultrasons sur la glace à une fréquence de sonication de 20 kHZ et une amplitude de 80% avec chaque impulsion d’une durée de 1 s. Incuber le mélange sur un rotateur à 40 tours par minute (tr/min) à 4 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons ultrasoniques à 8 000 x g pendant 20-30 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifugeux.</li>
	<li>Aliquote 80 μL (1/10) de la cellule extraire et mélanger avec 20 μL de 5x tampon de charge de dodécylsulfate de sodium (SDS). Faire bouillir les échantillons à 98 °C pendant 5 min, laisser refroidir sur de la glace pendant 2 min et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation. Utilisez ces échantillons comme groupe d’entrée pour surveiller l’expression des protéines.</li>
	<li>Ajouter 30 μL de billes conjuguées à des anticorps anti-Flag M2 (Flag/M2) aux extraits cellulaires restants et incuber sur un rotateur à 4 °C pendant au moins 4 h ou toute la nuit.</li>
	<li>Centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C pour recueillir les billes. Ajouter 1 ml de tampon de lyse Flag glacé aux billes et mélanger en retournant le tube plusieurs fois.</li>
	<li>Centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C pour recueillir les billes. Répétez l’étape 4.7 pendant 4 à 6 fois.</li>
	<li>Ajouter 40 μL de peptides Flag à une concentration finale de 200 ng/μL aux billes et incuber sur un rotateur à 4 °C pendant 2 h pour éluer les protéines liées.</li>
	<li>Centrifuger à 1 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifugeux.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de 5x tampon de chargement SDS, faire bouillir le mélange à 98 °C pendant 5 min, refroidir sur de la glace pendant 2 min et conserver à -20 °C pour le Western blot. Vous pouvez également stocker l’éluat de l’étape 4.10 directement à -80 °C pour d’autres expériences en aval. REMARQUE: La quantité de protéines ubiquitinées purifiées peut être augmentée en augmentant le nombre de cellules et les quantités de plasmides transfectés. Une stratégie de marquage des épitopes peut être adaptée pour purifier les complexes cellulaires qui se lient spécifiquement à p53 ubiquitiné dans des conditions de purification natives. En co-exprimant Flag-p53, mdm2 et HA-ubiquitine, le complexe protéique p53 ubiquitiné peut être immunoprécipité par une agarose séquentielle conjuguée à l’anticorps Flag et HA provenant de cellules de mammifères. Pour conserver les partenaires de liaison des protéines p53 ubiquitinées, le tampon de lyse BC100 moins strict (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glycérol, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 et 1x inhibiteur de protéase) doit être utilisé pendant le processus de purification. L’éluat du peptide HA est soumis à la spectrométrie de masse pour identifier tous les partenaires qui se lient spécifiquement à p53 ubiquitiné.</li>
</ol>5. Purification des protéines ubiquitinées dans des conditions de dénaturation
<ol><li>Ajouter 1 mL de PBS glacé aux granulés de cellules obtenus à l’étape 3.3 et mélanger uniformément. Aliquote 100 μL (1/10 volume) de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge comme échantillon d’entrée.</li>
	<li>Centrifuger à 700 x g pendant 5 min à 4 °C pour recueillir les pastilles de cellule. Ajouter 80 μL de tampon de lyse Flag à l’échantillon d’entrée, mélanger les cellules à l’aide d’un oscillateur vortex ou d’un pistolet à pipette et lyser les cellules sur de la glace pendant 1 h.</li>
	<li>Centrifuger à 8 000 x g pendant 20-30 min à 4 °C. Aliquote 80 μL du surnageant dans un nouveau tube microcentrifugeux.</li>
	<li>Ajouter 20 μL de tampon de chargement FDS 5x au surnageant, faire bouillir à 98 °C pendant 5-10 min, refroidir sur de la glace pendant 2 min et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Centrifuger les 900 μL restants de la suspension cellulaire à 700 x g pendant 5 min à 4 °C pour recueillir la pastille de cellule. Ajouter 1 mL de tampon ubiquitine 1 (tampon UB 1; guanidine-HCI 6 M, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) et0,2% Triton X-100, fraîchement complété avec 10 mM β-mercaptoéthanol et 5 mM imidazole) aux pastilles cellulaires et mélanger plusieurs fois en pipetant de haut en bas pour répartir uniformément les cellules. NOTE: La concentration d’imidazole peut varier de 5 mM à 20 mM pour diminuer la liaison protéique non spécifique sur la résine chargée de nickel. Le tampon ubiquitine contient du chlorhydrate de guanidine, qui inactive à la fois les ligases et les DUB. β-mercaptoéthanol est un liquide clair et incolore avec une odeur forte et désagréable semblable à celle des œufs pourris. Une solution à forte concentration causera de graves dommages aux muqueuses, aux voies respiratoires supérieures, à la peau et aux yeux. Portez des gants et des lunettes de protection et opérez dans la hotte.</li>
	<li>Soumettre les lysats cellulaires à 10-20 cycles d’ultrasons jusqu’à ce que la solution ne soit plus visqueuse. Effectuez les ultrasons sur la glace à une fréquence de sonication de 20 kHZ et une amplitude de 80% avec chaque impulsion d’une durée de 1 s. Centrifuger à 8 000 x g pendant 20-30 min à TA et transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.</li>
	<li>Ajouter 30 μL de résine chargée de nickel au surnageant et incuber sur un rotateur réglé à 15 tr/min pendant 4 h ou toute la nuit à TA. Centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à TA pour recueillir les billes.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon UB 1, incuber en rotation dans un agitateur pendant 10 min à TA et centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à TA pour recueillir les billes.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon ubiquitine 2 (tampon UB 2; urée 8 M, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) et 0,2% Triton X-100) aux billes, incuber en rotation dans un agitateur pendant 10 min à TA et centrifuger à 1 500 x g pendant2min pour recueillir les billes. Répétez cela une fois de plus.</li>
	<li>Aux billes, ajouter 1 mL de PBS, incuber en rotation dans un agitateur pendant 10 min à TA et centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à TA pour recueillir les billes. Répétez cela une fois de plus.</li>
	<li>Éluer les protéines liées en incubant les billes avec 40 μL d’imidazole à une concentration finale de 0,5 M pendant 1 h à TA. Centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à TA.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un tube microcentrifuge propre, ajouter 10 μL de 5x tampon de chargement SDS, faire bouillir à 98 °C pendant 5 min, refroidir sur de la glace pendant 2 min et conserver à -20 °C pour le Western blot. Sinon, stockez l’éluat non traité à -80 °C pour d’autres expériences en aval.</li>
</ol>6. Détection de protéines ubiquitinées purifiées par transfert Western
<ol><li>Résoudre les échantillons des étapes 4.11 et 5.12 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), puis les transférer sur une membrane de nitrocellulose par transfert Western pour détecter les protéines cibles à l’aide des anticorps correspondants décrits18.</li>
	<li>En bref, incuber la membrane en immergeant dans 20 mL de solution bloquante contenant 5% de poudre de lait defat dans un tampon TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, fraîchement complété avec 0,1% Tween-20 avant utilisation) à TA pendant 1 h. Ensuite, incuber la membrane avec des anticorps primaires à TA pendant 2 h ou toute la nuit à 4 °C. Utilisez les anticorps suivants pour chaque série. Tous les anticorps primaires ont été utilisés à une dilution de 1:1000.<ol><li>Détecter la protéine p53 totale, y compris la protéine p53 ubiquitinée, à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-p53 après immunoprécipitation avec des billes d’agarose Flag/M2.</li>
		<li>Détecter les protéines p53 ubiquitinées avec un anticorps anti-HA ou anti-ubiquitine après immunoprécipitation avec des billes d’agarose Flag/M2.</li>
		<li>Détecter les protéines p53 ubiquitinées avec un anticorps monoclonal anti-p53 après extraction de résine chargée de nickel.</li>
		<li>Détecter la protéine ubiquitinée totale avec un anticorps anti-HA ou un anticorps anti-ubiquitine après l’extraction de la résine chargée de nickel.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber la membrane avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) à TA pendant 1 h après avoir lavé 3x avec un tampon TBST pendant 5 min chacun. Tous les anticorps secondaires ont été utilisés à une dilution de 1:3000. Ensuite, laver la membrane avec un tampon TBST 3x pendant 5 min chacune en agitant doucement.</li>
	<li>Démarrer le système d’imagerie par chimiluminescence pour détecter les signaux du Western blotting. Préparer la solution de substrat pour HRP en mélangeant les solutions A et B dans un rapport de 1:1.</li>
	<li>Placer la membrane de nitrocellulose dans la camera obscura face vers le haut et enduire la solution de substrat uniformément sur la membrane à l’aide d’un pistolet à pipetage. Sélectionnez la procédure d’exposition automatique pour capturer les signaux chimioluminescents et ajustez manuellement le temps d’exposition jusqu’à ce qu’un signal idéal soit acquis.</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+Structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li>
<li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li>
<li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li>
<li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery%3A+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li>
<li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+the+p53+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li>
<li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+and+Tumor+suppression%3A+It+takes+a+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li>
<li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li>
<li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+by+the+light%3A+The+growing+complexity+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li>
<li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+ubiquitination%3A+Mdm2+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+modifications%3A+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li>
<li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2%3A+Open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li>
<li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-+versus+polyubiquitination%3A+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li>
<li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+M+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual.+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition)</a>. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

L’ubiquitination joue un rôle essentiel dans presque tous les processus cellulaires physiologiques et pathologiques2. Ces dernières années, de grands progrès ont été réalisés dans la compréhension du rôle moléculaire de l’ubiquitine dans les voies de signalisation et de la façon dont les changements dans le système ubiquitine conduisent à différentes maladies humaines2. La purification des protéines ubiquitinées contribue à fournir un aperçu des rôles exacts de l’ubiquitina...

L’ubiquitine est une protéine conservée au cours de l’évolution de 76 acides aminés 1,2,3. L’ubiquitine se lie de manière covalente aux résidus de lysine sur les protéines cibles par des cascades impliquant des enzymes activatrices (E1), conjuguées (E2) et ligases (E3). L’ubiquitine est d’abord activée par l’enzyme E1, puis transférée aux enzymes conjuguées E2. Par la suite, E3 ubiquitin ligases interagit à la fois avec les enzymes E2 chargées d’ubiquitine et les protéines de substrat et médie la formation d’une liaison isopeptidique entre le C-terminal de l’ubiquitine et un résidu de lysine dans le substrat 1,2,3,4,5. L’ubiquitination implique la fixation de fractions ubiquitine à des résidus de lysine sur des protéines substrats ou à elle-même, conduisant à une monoubiquitination ou une polyubiquitination des protéines. Ce processus d’ubiquitination se produit intracellulaire chez les eucaryotes et régule une grande variété de processus biologiques. L’ubiquitination entraîne la dégradation des protéines du substrat via le système ubiquitine-protéasome 1,2,3,4,5. De plus, l’ubiquitination module la localisation subcellulaire des protéines, la formation de complexes protéiques et le trafic de protéines dans les cellules 3,5. Les fractions ubiquitine ligaturées sur les protéines substrat peuvent être éliminées par des enzymes déubiquitinantes (DUB)6,7. Notamment, les différentes façons dont les chaînes ubiquitines sont assemblées fournissent une myriade de moyens pour réguler divers processus biologiques 1,5. Les rôles exacts de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction des protéines du substrat restent incomplètement compris jusqu’à présent. La purification des protéines ubiquitinées contribue à l’élucidation des effets de l’ubiquitination des protéines sur une variété de processus cellulaires.
La protéine p53 est l’une des protéines suppressrices de tumeurs les plus importantes et présente des mutations génétiques ou une inactivation dans presque tous les cancers humains 8,9,10,11. La stabilité et l’activité de P53 sont délicatement régulées in vivo par des modifications post-traductionnelles, y compris l’ubiquitination, la phosphorylation, l’acétylation et la méthylation12,13. La protéine p53 a une demi-vie courte allant de 6 min à 40 min dans diverses cellules, ce qui résulte principalement de sa polyubiquitination et de sa dégradation protéasomale ultérieure10,12. La souris double minute 2 (Mdm2) est une ubiquitine ligase E3 de p53 qui se lie à l’extrémité N de p53 pour inhiber son activité transcriptionnelle12,14,15. Mdm2 favorise la polyubiquitination et la dégradation protéasomale de p53 pour contrôler sa stabilité et induit une monoubiquitination de p53 pour faciliter son exportation nucléaire12,14,15,16. Ici, l’ubiquitination p53 médiée par Mdm2 est utilisée comme exemple pour introduire une méthode de purification des protéines ubiquitinées à partir de cellules de mammifères en détail. Les régulateurs qui influencent le statut d’ubiquitination des protéines cibles peuvent être identifiés à l’aide de ce test d’ubiquitination in vivo lorsqu’ils sont surexprimés ou renversés / assommés dans des cellules de mammifères. En outre, les protéines ubiquitinées peuvent être utilisées comme substrats pour le test de déubiquitination in vitro. Un criblage à haut débit peut être effectué pour identifier des DUB spécifiques pour les protéines cibles en incubant des substrats ubiquitinés avec des DUB individuels. Les protéines ubiquitinées peuvent agir comme un échafaudage pour recruter des protéines de signalisation en aval dans les cellules. Un complexe protéique cible ubiquitiné peut être purifié par immunoprécipitation séquentielle dans des conditions de purification natives et identifié par spectrométrie de masse. Le protocole actuel peut être largement utilisé pour étudier les protéines cellulaires régulées par ubiquitination.
Plusieurs méthodes ont été établies pour purifier les protéines ubiquitinées, notamment l’utilisation d’ubiquitine marquée par affinité, d’anticorps ubiquitine, de protéines de liaison à l’ubiquitine et de domaines isolés de liaison à l’ubiquitine (UBD)17. Ici, nous fournissons un protocole utilisant l’ubiquitine marquée par affinité comme médiateur pour purifier les protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères. L’utilisation de l’ubiquitine poly-marquée offre des avantages par rapport aux autres méthodes. Les protéines ubiquitinées sont purifiées en présence de dénaturants puissants, ce qui réduit la liaison non spécifique à la résine chargée de nickel en linéarisant les protéines cellulaires et en perturbant les interactions protéine-protéine. En revanche, l’utilisation d’anticorps ubiquitine, de protéines de liaison à l’ubiquitine et d’UBD isolés comme médiateurs ne peut pas exclure efficacement les partenaires de liaison de la protéine cible, car la purification doit être effectuée dans des conditions moins strictes. De plus, la purification peut également conduire à une liaison accrue de protéines non apparentées à l’aide de ces médiateurs. De plus, il existe une propension à se lier à divers types de liaison ubiquitine ainsi qu’à la mono- et poly-ubiquitination par des protéines de liaison à l’ubiquitine ou des UBD isolés17. L’utilisation de l’ubiquitine poly-marquée contribue à abattre toutes les protéines cellulaires ubiquitinées. Alternativement, l’utilisation d’agarose conjuguée anti-Flag ou anti-HA disponible dans le commerce facilite l’immunoprécipitation de protéines cibles marquées Flag ou HA à grande échelle dans des conditions non dénaturantes. Une deuxième étape de purification, par exemple, par résine chargée de nickel ciblant l’ubiquitine marquée poly-His, peut être utilisée pour acquérir des protéines cibles ubiquitinées d’une grande pureté pour des expériences en aval. Notamment, une stratégie de purification du marquage des épitopes peut être adaptée lorsqu’un anticorps spécifique ne peut pas être acquis pour immunoprécipiter efficacement les protéines cibles. Enfin, la purification des protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères, en comparaison avec la purification in vitro, conserve le mode de liaison ubiquitine des protéines cibles dans des conditions plus physiologiques.

<table><tbody><tr><td>&beta ;-mercaptoéthanol</td><td>Sangon Biotech</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Souris IgG, AB entier lié à la HRP (provenant de moutons)</td><td>GE healthcare</td><td>NA931</td><td>Antibdoy secondaire</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rat IgG, AB entier lié à la HRP (provenant de l’âne)</td><td>GE healthcare</td><td>NA935</td><td>Antibdoy secondaire</td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>FLAG/M2 billes</td></tr><tr><td>Anticorps monocolonal anti-GFP</td><td>Santa cruz</td><td>sc-9996</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Anti-HA Haute Affinité</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Anticorps monocolonal anti-Mdm2 (SMP14)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-965</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Anticorps monocolonal anti-p53 (DO-1)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-126</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>solvant</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FLAG Peptide</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>Préparer le tampon d’élution</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>supplément</td></tr><tr><td>Guanidine-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100287-0500</td><td>solvant</td></tr><tr><td>H1299</td><td>Banque de cellules souches, Académie chinoise de Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Logiciel Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>solvant</td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrat</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 réactifs</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>MG132</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13259</td><td>Inhibiteur de protéasome</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>solvant</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>solvant</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td>solvant</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501726-0500</td><td>solvant</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>QIAGEN</td><td>30230</td> résine <td>chargée de nickel</td></tr><tr><td>Membrane buvard en nitrocellulose</td><td>GE healthcare</td><td>10600002</td><td>0,45 & micro ; m taille des pores</td></tr><tr><td>Opti-MEM sérum réduit moyen</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Milieu de transfection</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607011-0100</td><td>antibiotique</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biological Industries</td><td>01-100-1ACS</td><td>medium</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>solvant</td></tr><tr><td>SDS Tampon de chargement</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>supplément</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501492-0005</td><td>solvant</td></tr><tr><td>Tris-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610103-0250</td><td>solvant</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A110694-0500</td><td>réactif</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100777-0500</td><td>supplément</td></tr><tr><td>Système d’imagerie par chimiluminescence ultra haute sensibilité</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>ChemiDoc XRS+</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sangon Biotech</td><td>A510907-0500</td><td>solvant</td></tr></tbody></table>

purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

L’ubiquitination est un type de modification post-traductionnelle qui régule non seulement la stabilité, mais aussi la localisation et la fonction d’une protéine substrat. Le processus d’ubiquitination se produit intracellulaire chez les eucaryotes et régule presque tous les processus biologiques cellulaires de base. La purification des protéines ubiquitinées aide à étudier le rôle de l’ubiquitination dans le contrôle de la fonction des protéines substrat. Ici, une procédure étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères est décrite avec la protéine suppresseur de tumeur p53 à titre d’exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation. La protéine p53 totale marquée au drapeau cellulaire a été purifiée avec de l’agarose conjuguée à l’anticorps anti-drapeau dans des conditions non dénaturantes. Alternativement, la protéine ubiquitinée totale marquée His cellulaire a été purifiée à l’aide de résine chargée de nickel dans des conditions de dénaturation. Les protéines p53 ubiquitinées dans les éluats ont été détectées avec succès avec des anticorps spécifiques. En utilisant cette procédure, les formes ubiquitinées d’une protéine donnée peuvent être efficacement purifiées à partir de cellules de mammifères, facilitant ainsi les études sur les rôles de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction protéique.

Le diagramme schématique montre les protéines p53 (Flag-p53) et His/HA ubiquitin double-marqué (HH-Ub) (Figure 1A). Les procédures utilisées pour purifier les protéines ubiquitinées sont résumées à la figure 1B. L’ubiquitine marquée par Poly-His peut être ligaturée pour cibler les protéines dans les cellules de mammifères. Les protéines ubiquitinées peuvent être purifiées avec des billes Flag/M2 dans des conditions non dénaturantes ou par chromatographie d’affin...

Le protocole décrit une méthode étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées à partir de cellules de mammifères en utilisant la protéine suppresseur de tumeur p53 comme exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées à partir de cellules dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation.

Purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

En utilisant ce protocole, les formes ubiquitinées d’une protéine donnée peuvent être efficacement purifiées à partir de cellules de mammifères, facilitant ainsi les études sur les rôles de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction protéique. La purification des protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères par rapport à la purification in vitro conserve le mode de liaison ubiquitine des protéines cibles dans des conditions plus radiologiques. Commencez par ajouter 1,5 millilitre de milieu sérique réduit dans trois tubes centrifugés de 15 millilitres.Ajouter de l’ADN plasmidique prêt pour la transfection dans chaque tube et ajouter 0,2 microgramme de plasmide de protéine fluorescente verte pour surveiller l’efficacité de la transfection. Ajouter 78 microlitres de réactif de transfection des liposomes à 4,5 millilitres de milieu sérique réduit dans un autre tube de centrifugation pour diluer les liposomes. Bien mélanger en agitant le tube, puis laisser reposer pendant cinq minutes à température ambiante.Ajouter 1,5 millilitre de la solution de liposomes diluée dans chaque tube contenant 1,5 millilitre de la solution d’ADN diluée. Bien mélanger et réticuler les plas

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Biochemistry

Biochimie

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Des mutations de gènes impliqués dans cette modification sont associés à différentes pathologies humaines. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en...

La détection des protéines ubiquitination

Cette vidéo décrit une méthode permettant d’extraire et de purifier des peptides ubiquitinylés contenant des peptides de diglycine restants à partir d’un mélange complexe de peptides. La méthode présentée peut aider à identifier les sites d’ubiquitination originaux dans la protéine.

Extraction basée sur l’immunoaffinité de peptides ubiquitinylés : une technique d’extraction sélective de peptides marqués à l’ubiquitine à partir de fractions peptidiques purifiées

La méthode décrite ici est un nouveau protocole d’isolement de la vésicule, qui permet pour la purification des compartiments cellulaires où les antigènes exogènes sont traitées par dégradation associés au réticulum endoplasmique dans présentation croisée.

Purification du compartiment membranaire pour dégradation associés au réticulum endoplasmique des antigènes exogènes dans présentation croisée

Contrairement à l’ubiquitine ligases, quelques ligase E3 SUMO ont été identifiés. Ce modifié in vitro SUMOylation protocole est capable d’identifier de nouveaux SUMO E3 ligases par un essai de reconstitution in vitro .

In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans les processus cellulaires et est étroitement coordonnée par la désubiquitination. Les défauts dans les deux réactions sous-tendent les pathologies humaines. Nous fournissons des protocoles pour mener la réaction d'ubiquitination et de deubiquitination in vitro utilisant des composants purifiés.

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

Nous fournissons un protocole détaillé pour un test d’ubiquitylation d’un substrat spécifique et d’une ubiquitine-ligase E3 dans des cellules de mammifères. Les lignées cellulaires HEK293T ont été utilisées pour la surexpression des protéines, le substrat polyubiquitylé a été purifié des lysats cellulaires par immunoprécipitation et résolu dans SDS-PAGE. L’immunoblotting a été utilisé pour visualiser cette modification post-traductionnelle.

Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères

L’ubiquitination est un régulateur critique des fonctions intracellulaires des protéines. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat dans les cellules de mammifères et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination. La surexpression des protéines dans HEK293T cellules a été induite par transfection transitoire, et des protéines ubiquitinées ont été détectées par analyse western blot.

Stratégies comparatives pour la détection de l’ubiquitination dans les lysats cellulaires de mammifères en utilisant SMAD2/SMURF2 comme modèle

Ce protocole décrit une méthode pour ubiquitiner Streptococcus pneumoniae en utilisant un lysat cellulaire de mammifère ou un complexe enzymatique d’ubiquitine pur, suivie d’un traitement avec un complexe protéique VCP/p97-UFD1-NPLOC4 purifié afin d’évaluer son activité bactériolytique, permettant l’étude des effecteurs immunitaires dépendants de l’ubiquitine.

In-vitro Reconstitution de l’ubiquitination bactérienne et élimination médiatisée par VCP/p97

Apprenez à purifier les protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères. Cette méthode permet d'étudier les rôles de l'ubiquitination dans la régulation de la fonction protéique en conservant les modes de liaison.

Purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères

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