Guérison des plaies cornéennes du poisson-zèbre: de l’abrasion à l’analyse d’imagerie de fermeture de plaie

Ce protocole se concentre sur l’endommagement de la surface oculaire du poisson-zèbre par abrasion pour évaluer la fermeture ultérieure de la plaie au niveau cellulaire. Cette approche exploite une bavure oculaire pour enlever partiellement l’épithélium cornéen et utilise la microscopie électronique à balayage pour suivre les changements dans la morphologie cellulaire pendant la fermeture de la plaie.

La transparence cornéenne est essentielle pour avoir la vue dégagée. Dans un contexte pathologique, cette transparence peut être remise en question. L’étude du mécanisme de pathogenèse nécessite des modèles simples ayant une grande similitude avec les organes humains.

Dans ces aspects, le poisson-zèbre est un excellent modèle. Et c’est la première description détaillée de l’abrasion cornéenne chez le poisson-zèbre. Cette technique est un moyen simple et rapide d’induire l’entrée de surface dans l’œil.

La fermeture de la plaie peut être suivie facilement après abrasion. En outre, des produits chimiques, ou des facteurs spécifiques, peuvent être ajoutés à l’eau du réservoir pour étudier leur impact sur la fermeture de la plaie. Comme la plaie est créée manuellement, la méthode nécessite une certaine pratique pour obtenir des résultats cohérents.

Avant l’expérience, préparez une solution de tricaïne à 0,02%. Décongeler 2 mL de solution mère à 0,4 %. Ajouter à 40 mL d’eau de système.

Et placez la solution dans un petit récipient. Préparez la bavure ophtalmique en vérifiant si l’extrémité de la bavure est propre. Et si nécessaire, enlevez les débris cellulaires avec un coton-tige humide.

Faites une incision sur le côté d’une éponge molle. Et humidifiez l’éponge avec de l’eau du système. Placez l’éponge sur la scène d’un microscope à dissection.

Assurez-vous d’un espace de travail suffisant pour utiliser la bavure. Et suffisamment d’éclairage sur le côté et au-dessus pour voir correctement la surface de l’œil. Placez doucement le poisson anesthésié avec une cuillère dans l’incision sur l’éponge avec la tête dépassant de la surface de l’éponge.

Approchez-vous soigneusement de la surface des yeux avec la pointe de la bavure. Et commencez à déplacer la pointe sur la surface de l’œil avec un mouvement circulaire. Lorsque l’abrasion est terminée, placez soigneusement le poisson dans l’eau fraîche du système contenant un analgésique pour la récupération.

Nettoyez la bavure immédiatement après utilisation avec un coton-tige humide. Ramassez le poisson au moment souhaité et placez-le dans une solution de tricaïne à 0,02%. Gardez l’animal dans la solution jusqu’à ce que le mouvement operculaire ait complètement cessé et que le poisson ne réagisse pas au toucher.

Placez le poisson sur une boîte de Pétri avec une cuillère et tenez-le avec une pince à épiler. Décapitez le poisson avec des ciseaux disséquants. Évitez de faire des rayures sur la surface des yeux.

Mettez le tissu dans un tube d’échantillonnage contenant 0,1 M de phosphate de sodium. Et rincez-le avec un tampon propre afin qu’il ne reste pas de sang dans la solution. Fixer le tissu dans du glutaraldéhyde à 2,5 % dans du phosphate de sodium à 0,1 M pendant 24 heures à 4 °C. Retirer la solution fixatrice et rincer l’échantillon plusieurs fois avec du phosphate de sodium à 0,1 M.

Disséquer l’échantillon en le plaçant sur une goutte de phosphate de sodium de 0,1 M sur une plaque de dissection. Coupez l’échantillon de tête en deux avec de fins ciseaux à disséquer. Alternativement, collectez les yeux en plaçant soigneusement les pointes de la pince à épiler fine dans les orbites du côté de l’œil.

Ensuite, retirez l’œil de l’orbite et retirez le tissu supplémentaire. Transférer l’échantillon disséqué dans un tube contenant 0,1 M de phosphate de sodium. Assurez-vous qu’il n’y a pas de tissu supplémentaire dans le tube d’échantillonnage, car il peut adhérer au sommet de l’œil pendant le traitement de l’échantillon.

Placez le support avec la languette sur un support. Et le support à la base d’un microscope disséquant. Placez doucement l’échantillon de tissu sur la monture avec une pince à épiler fine, la cornée vers le haut.

Enduire l’échantillon de platine à l’aide du dispositif approprié. Et conservez les échantillons à température ambiante jusqu’à l’imagerie. Acquérir des images du grossissement souhaité.

Et utilisez des images 2000 à 2500x pour l’analyse. Ajustez la luminosité et le contraste pour voir clairement toutes les bordures des cellules et les microridges. Et évitez les zones surexposées dans l’image.

Ouvrez l’image TIFF avec Fiji ImageJ 1.53. Et utilisez une barre d’échelle pour définir l’échelle. Créez une ligne égale à la barre d’échelle à l’aide de l’outil Ligne.

Sélectionnez Analyser. Ensuite, définissez l’échelle. Et tapez à la distance connue.

Ensuite, ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement à l’aide du menu Analyser, Outils. Pour la taille et l’arrondi des cellules, sélectionnez Analyser, Définir les mesures, Descripteurs de forme. Et utilisez l’outil Loupe pour voir les cellules sous grossissement.

Sélectionnez des cellules à l’aide de l’outil Polygone et ajoutez chaque sélection au gestionnaire de retour sur investissement. Enfin, mesurez les cellules sélectionnées et enregistrez la mesure. Pour procéder à l’analyse de microridge, assurez-vous que l’image est au format 8 bits en cliquant sur le menu Image, Type.

Ensuite, sélectionnez la cellule à l’aide de l’outil Polygone. Et effacez l’arrière-plan en cliquant sur Modifier, puis sur Effacer à l’extérieur. Lissez l’image une à trois fois en sélectionnant Processus, Lisser.

Et ajustez la luminosité et le contraste de Image, Ajuster, Luminosité / Contraste, afin que les microgravettes se démarquent aussi clairement que possible. Convolve l’image en cliquant sur Process, Filters, Convolve. Et transformez-le en binaire en cliquant sur Processus, Binaire, Rendre binaire.

Ensuite, squelettez l’image en noir et blanc en sélectionnant Processus, Binaire, Squelettiser. Utilisez la fonction Squelette analysé pour mesurer les paramètres de microrérix et enregistrer les valeurs. La zone de la plaie est fermée trois heures après la plaie.

Mais le site où les bordures de la plaie sont jointes reste visible. Les résultats ont montré que sur l’épithélium cornéen abrasé, des micro-bouillies peuvent être observées dans certaines cellules allongées à côté du site de la plaie. Dans certaines régions périphériques, les microruches sont perdues du centre de la cellule.

Une comparaison entre les deux régions périphériques a montré des cellules allongées avec des microruches moyennes plus courtes, indiquant des réarrangements cellulaires en réaction à la blessure. Ces résultats suggèrent que les changements de forme cellulaire sont en corrélation avec la modification de la microrix et soulignent l’hétérogénéité de l’épithélium cornéen dans la réponse de la plaie. Rappelez-vous que l’opération nécessite une formation pour effectuer une plaie homogène et reproductible.

En plus de la microscopie électronique, le tissu peut être utilisé pour l’histologie, les colorations immunologiques et l’hybridation in situ. Ceux-ci fourniront des informations supplémentaires sur les changements cellulaires et moléculaires au cours de la cicatrisation des plaies. L’utilisation du poisson-zèbre élargit nos connaissances sur la biologie cornéenne.

De plus, ce modèle est excellent pour les études pharmacologiques et peut être utilisé pour mieux comprendre l’évolution des yeux.