Isolement, expansion et différenciation des cellules souches mésenchymateuses du coussinet adipeux infra-patellaire de l’articulation étouffante de chèvre

Les cellules souches mésenchymateuses dérivées de coussinets adipeux infrapatellals, ou en bref, IFP-MSCs, sont un type de cellules souches relativement moins étudié. Ce protocole est une méthode simple, fiable et reproductible démontrant l’isolement des IFP-MSC de l’articulation de l’étouffement de chèvre. Le principal avantage de la technique est qu’un grand nombre d’IFP-MSC de haute qualité peuvent être obtenus.

Les IFP-MSC isolées peuvent se différencier en plusieurs lignées et possèdent un potentiel de régénération étendu. En raison de leur emplacement anatomique, les IFP-MSC ont gagné en intérêt pour la réparation des défauts du cartilage et l’atténuation de la dégradation du cartilage dans l’arthrose. La méthode a des implications pour la thérapie cellulaire dans le domaine de l’ingénierie tissulaire et de la médecine régénérative.

La procédure d’isolement, d’expansion et de différenciation des IFP-MSC sera démontrée par le Dr Sugata Hazra et M. Aman Mahajan. Pour commencer l’isolement des cellules souches mésenchymateuses à coussinet adipeux infrapatellaire, ou IFP-MSC, prélever des articulations fémorotibiales de chèvre englobant environ 15 centimètres des régions fémorales et tibiales des membres postérieurs dans une boîte d’échantillons de prélèvement stérilisée. Conservez l’échantillon à quatre degrés Celsius pour le transporter au laboratoire en vue d’un traitement ultérieur.

Placez l’échantillon sur une boîte de Petri de 150 millimètres et assurez-vous de traiter l’échantillon de manière aseptique et une enceinte de biosécurité tout au long de la procédure. Rincez-le abondamment avec du PBS autoclavé complété par des antibiotiques. Gardez l’échantillon hydraté à l’aide de PBS.

Examinez attentivement les régions anatomiques de l’échantillon. Pour un accès facile, retirez complètement les tissus supplémentaires des deux os longs en tenant la surface terminale de l’os du fémur d’une main et en la coupant longitudinalement vers l’articulation à l’aide de ciseaux tranchants. Ensuite, sans perturber le tissu entourant la capsule articulaire, retirez les muscles et le tissu adipeux de l’os.

De même, faites une autre incision à l’extrémité tibiale de l’échantillon et retirez les muscles et le tissu adipeux de l’os tibial. Assurez-vous que les deux os longs sont complètement exposés et que la capsule articulaire est visible. Ensuite, faites une incision de chaque côté de la membrane synoviale pour ouvrir l’articulation articulaire.

Coupez la rotule de la membrane synoviale et des ligaments rotuliens à l’aide de ciseaux et de pinces fraîchement stérilisés. Placez immédiatement la rotule séparée dans une boîte de Petri contenant du PBS. De la rotule séparée, retirez tout le coussinet graisseux présent sur la surface interne à l’aide de ciseaux et de pinces.

Recueillez-le dans une autre boîte de Petri fraîche et hachez-le à l’aide d’un scalpel. Inclure d’autres outils chirurgicaux pour obtenir les petits segments de graisse d’environ deux à trois millimètres. Utilisez une spatule pour transférer le tissu haché dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et lavez-le trois fois avec du PBS supplémenté en antibiotiques pendant 15 minutes à température ambiante à l’aide d’un mélangeur à tube à essai.

Pour la digestion enzymatique, incuber environ cinq grammes de tissu haché dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco, ou DMEM, un milieu à faible teneur en glucose contenant 1,5 milligramme par millilitre de collagénase de type II et 2% FBS à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Aspirez soigneusement le tissu digéré et filtrez-le à travers une passoire cellulaire de 70 microns pour éliminer toute partie non digérée. Centrifuger le filtrat dans un tube à centrifuger de 15 millilitres à 150 fois g pendant cinq minutes.

Retirez le surnageant avant de laver deux fois la pastille de cellule avec du DMEM à faible teneur en glucose. Remettez la pastille en suspension dans du DMEM complet, également appelé fluide d’expansion. Ensemencez les cellules sur une boîte de Petri de 150 millimètres et cultivez-les dans le milieu d’expansion complété par cinq nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes de base, ou BFGF, et 50 microgrammes par millilitre de sel trisodique d’acide 2-phospho-L-ascorbique.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5% pour permettre aux cellules d’adhérer et de proliférer. Surveillez quotidiennement l’attachement et la croissance des cellules. Pour une maintenance et une expansion correctes des IFP-MSC, changez le support tous les trois jours.

Tout en changeant le média, ajoutez cinq nanogrammes frais par millilitre BFGF et 50 microgrammes par millimètre de sel trisodique d’acide 2-phospho-L-ascorbique directement dans la boîte de Pétri. Une fois que les cellules deviennent 80% à 90% confluentes, sous-cultivez-les en retirant le milieu d’expansion de la boîte de Petri et en lavant les cellules avec 1X PBS. Ajoutez ensuite quatre millilitres de trypsine-EDTA à 0,25% dans le plat et incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone.

Après quatre minutes, tapotez la plaque sur le côté pour déloger les cellules. Confirmer le détachement complet de toutes les cellules au microscope. Une fois confirmé, ajoutez un volume égal de milieu d’expansion pour neutraliser la trypsine.

Utilisez une pipette pour recueillir ces cellules dissociées dans un tube en polypropylène frais de 15 millilitres et centrifugez-les à 150 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans le volume de dilatation souhaité. Comptez les cellules en utilisant la méthode standard de comptage des cellules et sous-cultivez-les pour une expansion ultérieure à une densité de semis de 10 000 cellules par centimètre carré dans une boîte de Petri de 150 millilitres.

Pour tous les essais, utiliser une monocouche confluente de cellules du numéro de passage P2 à P5. Lorsque les cellules expansées atteignent 80% à 90% de confluence, dissocier les cellules à l’aide d’une solution de trypsine-EDTA avant de les pelleter dans un tube centrifuge de 15 millilitres à 150 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans du plasma de chèvre à une densité de 2 millions de cellules par 50 microlitres. Ajouter 50 microlitres de plasma contenant les cellules sur une boîte de Petri stérilisée de 90 millimètres, suivie de l’ajout de chlorure de calcium à une concentration finale de 0,3%Bien mélanger pour fabriquer un hydrogel plasma réticulé.

Après avoir incubé l’hydrogel fabriqué à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes, transférer les hydrogels dans des plaques de culture tissulaire de 24 puits contenant des milieux chondrogènes. Changez le support tous les trois jours pendant 14 jours. Les hydrogels cultivés dans un milieu DMEM complet sans TGF-bêta 1 sont considérés comme des témoins non induits.

Après 14 jours de différenciation chondrogénique des cellules dans l’hydrogel plasmatique, laver les hydrogels trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacun et fixer les échantillons dans du formol tamponné neutre pendant trois heures. Les IFP-MSC isolées étaient homogènes et ont atteint une morphologie allongée dans les 24 heures suivant la culture in vitro. Les cellules proliféraient efficacement de 80% à 90% de confluence dans les six jours suivant l’expansion et présentaient une capacité clonogène, indiquant des capacités efficaces de prolifération et d’auto-renouvellement.

Lorsqu’elles ont été traitées pour se différencier en lignée adipogénique, les cellules isolées ont produit des gouttelettes lipidiques, ce qui a été confirmé par la coloration Oil Red O aux jours 14 et 21. De telles gouttelettes d’huile n’étaient pas visibles dans les cellules sans facteurs inducteurs adipogènes. Les cellules isolées encapsulées dans de l’hydrogel plasmatique ont montré la formation de néo-tissus blancs et brillants après 14 jours dans le groupe induit présentant le potentiel chondrogénique.

Le groupe non induit avait un tissu blanc pâle avec une brillance réduite. De plus, une coloration histologique positive pour le bleu d’Alcian et la safranine O dans le groupe induit a indiqué que les cellules pouvaient sécréter des glycosaminoglycanes sulfatés, l’un des principaux composants de la matrice cartilagineuse. En revanche, les coupes d’hydrogel des groupes non induits étaient négatives pour la coloration à la safranine O et au bleu d’Alcian, confirmant le potentiel de différenciation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses uniquement en présence de stimuli chondrogènes.

Les cellules isolées induites avec les milieux ostéogéniques ont montré une coloration positive pour la phosphatase alcaline, confirmant la minéralisation au bout de 14 jours. Après 28 jours d’induction ostéogénique, les dépôts calcifiés ont été observés avec une coloration au rouge d’alizarine S. Les résultats ont souligné le potentiel de différenciation des cellules induites en lignées adipogènes, chondrogéniques et ostéogéniques.

Il est essentiel de traiter l’échantillon dans des conditions aseptiques pour éviter toute contamination. Il est également important d’identifier l’emplacement correct de la rotule. Cette procédure ouvre la voie à l’isolement de divers types de cellules, telles que les chondrocytes articulaires, les fibroblastes ligamentaires et les cellules souches de la synoviale et du liquide synovial, ayant de nombreuses applications en médecine régénérative.

Après isolement des IFP-MSC à l’aide de cette technique, son efficacité a été particulièrement étudiée pour la régénération des tissus musculo-squelettiques, tels que le cartilage, les os et les ligaments, à l’aide d’approches sans échafaudage et sans échafaudage.