Préparation et caractérisation de bio-encre d’hydrogel biohybride 3D à base de graphène pour la neuro-ingénierie périphérique

Le système de cellules souches est sous l’influence de ses composants importants. La préservation et la différenciation des cellules souches sont impensables sans la présence de leur microenvironnement. Ce microenvironnement, appelé niche de cellules souches, est constitué de cellules et d’échafaudages.

La neuropathie périphérique peut être et occasionnellement, ils peuvent comme une lésion du plexus brachi, divers traumatismes, une tumeur, des anomalies autonomes, une définition immunitaire et une maladie métabolique. Diverses méthodes de culture 3D ont été développées pour fournir une niche meilleure et plus naturelle pour les cellules souches. La formation de sphéroïdes et la bio-impression 3D sont des méthodes relativement nouvelles et prometteuses pour les cultures 3D.

La bio-impression 3D peut également être utilisée dans des études de neuro-ingénierie. Par conséquent, dans le cadre de cette étude, des bio-encres à base de graphène et d’alginate/gélatine ont été développées et étudiées pour leurs caractéristiques régénératrices. Pour commencer, culture de cellules souches mésenchymateuses de gelée de Wharton ou WJMSCs dans un milieu DMEM F12 contenant 10% de sérum de veau fœtal ou FBS, 1% de stylo / streptocoque et 1% de L-glutamine sous un flux laminaire stérile à température ambiante.

Lorsque les cellules cultivées sont confluentes à 80% dans le ballon, verser le milieu et laver les cellules avec cinq millilitres de PBS. Ajoutez ensuite cinq millilitres de trypsine à 0,25% et d’EDTA de sodium à 2,21 millimolaires et incuber à 37 degrés Celsius. Après cinq minutes, ajoutez 10 millilitres de milieu DMEM F12 contenant 10% FBS aux cellules.

Suspendez les cellules, recueillez le milieu et transférez-le dans un tube à centrifuger. Ensuite, centrifuger les cellules et jeter le surnageant avant de réensemencer les cellules dans une nouvelle fiole avec un milieu nutritif frais contenant 10% de FBS. Pour préparer la bio-encre du groupe témoin sans graphène, pesez 4,5 milligrammes d’alginate et 1,5 milligramme de gélatine et transférez-les dans un tube à centrifuger.

Ajoutez ensuite 50 millilitres de milieu DMEM F12 contenant 10% FBS dans le tube. Encore une fois, pesez 4,5 milligrammes d’alginate et 1,5 milligrammes de gélatine et transférez-les dans un tube à centrifuger. Ajoutez ensuite 50 microlitres de graphène 0,1% dans le tube et faites le volume 50 millilitres avec un milieu DMEM F12 contenant 10% FBS.

Mélanger les bio-encres par pipetage et vortex avant l’autoclavage à 121 degrés Celsius sous 1,5. pression atmosphérique pendant 20 minutes. Après l’autoclavage, centrifuger la solution pour éliminer les bulles formées et placer les bio-encres à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules soient préparées.

Pour l’interaction de bioencre cellulaire, créez les groupes de bioencres. Le premier groupe comprend les impressions 3D-B et 3D-G avec de la bio-encre pour la bio-impression. Le deuxième groupe comprend les bio-encres 3D-BS et 3D-GS sur lesquelles des sphéroïdes ont été formés après la bio-impression.

Pour le premier groupe, comptez les cellules à une par 10 à la septième cellule dans 0,5 millilitre de milieu. Ajoutez ensuite 4,5 millilitres de bio-encre. Transférer le mélange dans les cartouches dans l’armoire stérile à l’aide de seringues.

Installez les cartouches dans la section extrudeuse correspondante de la bio-imprimante. Pour le deuxième groupe, prenez cinq millilitres de bio-encre de chacun des groupes de bio-encre et transférez-les dans des cartouches stériles à l’aide d’un injecteur. Utilisez la bio-imprimante avec deux têtes d’impression coaxiales et la technologie d’extrusion pneumatique.

Définissez la résolution XYZ par micro-pas à 1,25 micromètre, la largeur d’extrusion à 400 micromètres et la hauteur d’extrusion à 200 micromètres. Utilisez une grille de 20 x 20 x 5 millimètres pour créer des modèles 3D. Créez des modèles 3D à l’aide de programmes de CAO Web open source.

Pour le processus de bio-impression 3D, réglez la pression moyenne de l’imprimante à 7,5 psi. Réglez ensuite la température de la cartouche et du lit à 37 degrés Celsius et la vitesse à 60 % Placez le système en position d’origine pendant la phase d’écriture. Positionnez automatiquement les axes et sélectionnez et réglez l’extrudeuse avant de commencer le processus de bio-impression.

Après l’impression, retirez l’échantillon et placez-le sous une armoire à flux laminaire. Ensuite, vaporisez les bio-encres avec 0,1 solution normale de chlorure de calcium ou ajoutez une solution d’un millilitre avec une pipette à température ambiante et attendez 10 à 20 secondes. Ensuite, lavez les motifs imprimés deux fois avec du PBS contenant du calcium et du magnésium.

Ajouter deux millilitres de milieu DMEM F12 avec 10% FBS sur le dessus de chaque cellule contenant le groupe bio-encre et incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu de suspension contenant un par 10 aux sixièmes cellules à chaque groupe et incuber les plaques. Après 24 heures, observer et photographier tous les lots de bio-encre pour la formation de sphéroïdes au microscope inversé pour la différenciation des CMJME en cellules de type neurone, à l’exception du groupe témoin.

Ajouter deux millilitres de milieu de différenciation neurogène par puits et rafraîchir tous les deux jours. Suivre pendant sept jours pour observer la différenciation neuronale. Ensuite, à l’aide de l’imagerie timelapse, examinez les effets du graphène sur les cellules souches et surveillez les interactions cellulaires au sein de la bio-encre.

L’effet de la concentration de graphène sur la prolifération cellulaire est démontré ici. Par rapport au témoin, une diminution significative a été observée pour la concentration de graphène à 0,001%. Il n’y avait pas de différences significatives entre les autres groupes et le groupe témoin.

Les interactions cellulaires avec le graphène ont montré que le graphène était toléré dans le système 2D et était prélevé par les cellules par endocytose. L’imagerie timelapse a montré que les cellules qui ont survécu dans le milieu de graphène 3D ont maintenu leur vitalité grâce à la luminosité GFP jusqu’à la fin de l’incubation. Les images MEB et l’analyse FIIR des groupes de bioencres 3D-B et 3D-G sont présentées ici.

Les interactions des cellules Bioink ont été démontrées à la fois en surface et en interne. Les cellules étaient morphologiquement rondes et attachées au matériau. Dans la différenciation neuronale 3D, il a été considéré que les frontières des cellules sphéroïdes dans les deux groupes étaient transparentes et vivantes, et les sphéroïdes dans le groupe graphène étaient relativement plus grandes et piégeaient le graphène à l’intérieur de la cellule.

L’immunomarquage des cellules 2D et 3D est illustré ici. Les images vertes représentent des structures semblables à des neurones. L’échantillon de contrôle positif 2D exprimait moins de marqueurs de structure de type neurone que les échantillons 3D.

Nous avons découvert que les bio-encres à base de graphène avaient plus de succès en termes de différenciation des cellules souches en cellules de type neurone. Nous proposons que les bio-encres à base de graphène soient d’excellents outils pour le traitement des troubles des nerfs périphériques dans d’autres études. Aujourd’hui, le système de cellules souches peut être créé par ingénierie tissulaire avec des biomatériaux naturels et synthétiques La création de tissus artificiels qui peuvent remplacer les tissus vivants qui peuvent être utilisés dans la régénération de ces tissus, l’élimination des dommages et la fourniture d’une fonction est fournie par l’ingénierie tissulaire.