Name: Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Découvrez une méthode simple et économique d'isolement de l'ADN fécal pour étudier la dynamique du microbiote intestinal chez les souris modèles de maladies auto-immunes. Cette technique offre des résultats comparables aux kits commerciaux.

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Nous apprécions l’aide du laboratoire national d’Argonne et de nos bioinformaticiens collaborateurs. Ce travail est soutenu par diverses subventions internes et NIH.

Le locus gfp/gfp Cx3cr1 des souris B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J a été rétrocroisé avec MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) pendant 10 générations pour générer des souris MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp. Le criblage du génome à l’aide de panels de polymorphisme mononucléotidique (SNP) a confirmé que le fond génétique des souris nouvellement générées était identique à plus de 97% à celui de MRL / lpr. Après cela, les souris ont été élevées et maintenues dans un environnement exempt d’agents pathogènes spécifiques conformément aux exigences spécifiques du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de Virginia Tech. Les échantillons ont été prélevés lorsque les souris avaient 13, 14 et 15 semaines.
1. Prélèvement d’échantillons de microbiote chez la souris
<ol><li>Sortez chaque souris individuellement de sa cage. Prélever une pastille fécale directement dans l’anus et la conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit traitée. Traiter les échantillons avec des pinces, des tubes et des gants stériles et propres. REMARQUE : Un contenant (p. ex., un bécher) peut être utilisé pour placer la souris en attendant l’échantillon fécal. Nettoyez le récipient avec de l’éthanol avant et après chaque souris.</li>
	<li>Ajouter une pastille congelée dans un tube à vis prépesé de 2 mL. Notez le poids fécal en grammes, qui devrait se situer entre 0,02 et 0,05 g par pastille fécale.</li>
	<li>Ajouter à la pastille une fine couche de billes de verre de 0,1 mm, 500 μL de tampon de lyse (50 mM NaCl, 5 mM Tris et 50 mM EDTA) et 200 μL de SDS à 20%.</li>
	<li>Battre le tube pendant 4 min dans un homogénéisateur (à puissance maximale), suivi de 3 à 5 min de vortex.</li>
	<li>Essorez pendant une courte période pour éliminer les bulles et la mousse (appuyez sur le bouton de la centrifugeuse jusqu’à ce qu’elle atteigne 1 000-1 200 x g, puis relâchez).</li>
</ol>2. Extraction de l’ADN
<ol><li>Transfèrent 350 μL de surnageant obtenu à l’étape 1.5 (en veillant à ne transporter aucun débris) dans un nouveau tube à pression de 1,5 mL. Ajouter 500 μL de mélange phénol-chloroforme-isoamylique (PCI; 25:24:1, v/v) et vortex pendant 1 min. REMARQUE: Dorénavant, les échantillons doivent être manipulés à l’intérieur d’une hotte chimique. L’ICP est toxique.</li>
	<li>Faire tourner à 6 000 x g pendant 3 min à 4 °C. Transfère 180 μL de la phase aqueuse (couche supérieure) dans un nouveau tube à pression de 1,5 mL. Ajouter 180 μL (1:1) de chloroforme, retourner et mélanger. REMARQUE: Minimisez la contamination de la couche inférieure lors du transfert de la couche supérieure.</li>
	<li>Essorage à 18 400 x g pendant 3 min à 4 °C. Transférer 180 μL de la phase aqueuse dans un nouveau tube à pression. REMARQUE: Après avoir éliminé l’ICP et le chloroforme, les étapes suivantes peuvent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique.</li>
	<li>Ajouter 180 μL d’isopropanol froid et 36 μL de 5M NH4Ac. Retourner quelques fois pour mélanger et placer le tube sur de la glace pendant 20 min.</li>
	<li>Essorage à 18 400 x g pendant 20 min à 4 °C. Verser pour jeter le surnageant. Lavez la pastille plusieurs fois avec 500 μL d’éthanol froid à 70 % en le retournant. NOTE: L’éthanol doit être dilué avec de l’eau stérile double désionisée.</li>
	<li>Essorage à 18 400 x g pendant 3 min à 4 °C. Jeter le surnageant pour éliminer l’éthanol résiduel.</li>
	<li>Sécher le tube à l’air à l’envers sur du papier de soie pendant 20 minutes, jusqu’à ce que la pastille devienne claire. Suspendre la pastille dans 50 μL d’eau de qualité moléculaire. Chauffer le liquide à 37 °C pendant 10 min pour dissoudre complètement les grosses pastilles d’ADN.</li>
	<li>Faire tourner les tubes après chauffage pour récupérer les gouttelettes de condensation sur le couvercle (3 400 x g pendant 1 min).</li>
	<li>Mesurer la concentration et obtenir le rapport 260/280 à l’aide d’un spectrophotomètre. Utilisez de l’eau de qualité moléculaire comme un blanc. L’ADN de bonne qualité devrait avoir des ratios 260/280 compris entre 1,8 et 2. REMARQUE : Le rendement attendu en ADN est d’au moins 0,03 g par pastille fécale.</li>
</ol>3. Préparation de l’échantillon pour le séquençage du gène de l’ARNr 16S
<ol><li>Envoyez les échantillons d’ADN au laboratoire national d’Argonne, où ils sont préparés par la bibliothèque et séquencés sur l’Illumina Miseq.<ol><li>Envoyez les échantillons dans des plaques de 96 puits entièrement plinquées, avec des échantillons disposés en rangées (A1-A12, B1-B12, etc.) et scellés avec des joints de plaque de feuille.</li>
		<li>Envoyer un volume final de 20 μL par échantillon et par puits, dont la concentration varie de 1 à 50 ng/μL. NOTE: Les dilutions doivent être effectuées avec de l’eau de qualité moléculaire.</li>
		<li>Après préparation des échantillons, faire tourner à 600 x g pendant 1 min à température ambiante avant de congeler les échantillons à -80 °C pendant 24 h.</li>
		<li>Envoyer pendant la nuit sur de la glace sèche.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li>
<li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).</li>
<li>Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+microbiome+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the microbiome in rheumatic diseases.</a> Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314(2013).</li>
<li>Larsen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+human+adults+with+type+2+diabetes+differs+from+non-diabetic+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.</a> PLoS One. 5 (2), 9085(2010).</li>
<li>Alam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+imbalance+in+inflammatory+bowel+disease+patients+at+different+taxonomic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels.</a> Gut Pathogens. 12 (1), (2020).</li>
<li>Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbiota+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Diet, microbiota and autoimmune diseases.</a> Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).</li>
<li>Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLE%3A+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608(2015).</li>
<li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus%3A+a+national+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li>
<li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73(2017).</li>
<li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection%2C+storage%2C+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143(2018).</li>
<li>Fiedorová, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821(2019).</li>
<li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365(2016).</li>
<li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007(2019).</li>
<li>Galloway-Peña, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+analysis+of+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li>
<li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209(2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Un microbiote intestinal équilibré peut protéger le corps humain contre les maladies. Une fois que cet équilibre est perturbé par des déclencheurs externes ou internes, les conséquences peuvent être dévastatrices. Cette méthode présente un moyen d’analyser la dynamique du microbiote intestinal dans des modèles murins. La méthode convient non seulement aux comparaisons entre groupes, mais aussi au suivi du microbiote intestinal au fil du temps afin de mieux identifier les facteurs dépendants du temps qui perturbent le mic...

Les humains et les bactéries coexistent depuis longtemps. Ils ont établi une relation de codépendance avec des effets bénéfiques mutuels qui influencent les réponses immunitaires de l’hôte de manière quantitative et qualitative1. Des études récentes suggèrent une association entre la composition du microbiote intestinal et la pathogenèse des maladies auto-immunes qui comprennent la sclérose en plaques 2, la polyarthrite rhumatoïde3, le diabète de type2 4, la maladie inflammatoire de l’intestin5 et le lupus érythémateux disséminé (LED)6. Cependant, on ne sait toujours pas si le microbiote intestinal est la cause principale ou un effet secondaire de ces maladies auto-immunes7. Potentiellement, le microbiote intestinal pourrait exacerber la maladie pendant la phase effectrice des maladies auto-immunes ou jouer un rôle dans la régulation de l’induction de ces maladies8.
Une dysbiose intestinale a été rapportée chez des souris femelles MRL/Mp-Faslpr (LMR/lpr) sujettes au lupus, et des modifications du microbiote intestinal avec une déplétion significative des lactobacilles ont été observées9. Lorsqu’un mélange de cinq souches de Lactobacillus a été administré par voie orale, les symptômes de type lupus ont été largement atténués chez ces souris, suggérant un rôle essentiel du microbiote dans la régulation de la pathogenèse du LED.
La technique suivante d’extraction d’ADN permet de suivre les fluctuations du microbiote et de les analyser qualitativement et quantitativement au cours de l’évolution de la maladie de type LED murin chez les souris sujettes au lupus. Qu’il s’agisse d’examiner le microbiote intestinal sain ou de définir la dysbiose, il est important d’examiner de manière critique comment les données sont collectées et si elles sont exactes et reproductibles10. Chaque étape est essentielle dans ce processus. Une méthodologie appropriée doit être utilisée pour extraire l’ADN microbien, car tout problème éventuel introduisant des biais pendant le processus d’extraction de l’ADN pourrait entraîner une représentation microbienne inexacte. Bien que la méthode phénol-chloroforme soit décrite ici, il existe des kits disponibles dans le commerce pour extraire l’ADN de bactéries qui fonctionnent bien dans des cas particuliers11. Cependant, leur facilité d’utilisation est limitée par le coût et la quantité d’échantillon requise.
Le protocole présenté ici est rentable et ne nécessite qu’une petite quantité d’échantillon. Il fonctionne bien avec n’importe quel type d’échantillon de selles et est utile pour étudier la dynamique du microbiote intestinal au fil du temps ainsi que les comparaisons entre les groupes. L’ADN est isolé avec une méthode de purification de l’alcool, qui utilise du phénol, du chloroforme et de l’alcool isoamylique. L’extraction à base d’alcool aide à nettoyer et à éliminer l’échantillon de protéines et de lipides, où l’ADN est précipité à l’étape finale. La méthode proposée a une efficacité et une qualité significativement élevées et s’est avérée précise dans l’identification des populations bactériennes. Une remarque critique au cours de la procédure est que la contamination de l’ADN peut se produire, et donc une manipulation appropriée des échantillons est nécessaire12.
L’ADN est ensuite analysé par les plateformes de séquençage de nouvelle génération pour le gène de l’ARNr 16S, tel que l’Illumina MiSeq. En particulier, la région hyper-variable V4 est analysée pour fournir une meilleure quantification pour les taxons de rangélevé 13. L’analyse bioinformatique ultérieure est externalisée, suivie d’une analyse interne utilisant des méthodes statistiques standard. Il existe de nombreux logiciels bioinformatiques open source disponibles pour le séquençage en aval, et le type d’analyses effectuées dépend fortement de la question biologique spécifique d’intérêt14. Ce protocole se concentre spécifiquement sur les étapes expérimentales précédant le séquençage et fournit une méthode plus polyvalente, rentable, comparable et efficace pour obtenir de l’ADN à partir d’échantillons fécaux.

<table><tbody><tr><td>Perles de verre de 0,1 mm</td><td>Produits BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>tubes à bouchon à vis de 2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3488</td><td></td></tr><tr><td>20 % FDS</td><td>FisherScientific</td><td>BP1311-1</td><td>FDS 20%</td></tr><tr><td>96 % Ethanol, Biologie moléculaire Qualité</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> T032021000CS Acétate <td>d’ammonium</td><td></td></tr><tr><td>(5 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9071</td><td>NH4AC 5M</td></tr><tr><td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005582</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender storm 24</td><td>Next Advance</td><td>4116-BBY24M</td><td>Homogénéisateur</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>FisherScientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Eau traitée au DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Acide</td> <td>éthylènediamine tétraacétiqueFisherScientific</td><td>BP118-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Joint d’étanchéité en aluminium</td><td>FisherScientific</td><td>NC0302491</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes-Kimtech 34256</td><td>FisherScientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) souris</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000485</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 spectrophotomère</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Phénol : chloroforme : isoamylalchohol (25:24:1)</td><td>FisherScientific</td><td>BP1752I-400</td> Échelle <td>PCI</td></tr><tr><td>à 4 décimales</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS205DU</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits</td><td>à jupe Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0800</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>FisherScientific</td><td>15528154</td><td>Chlorhydrate de NaCl</td></tr><tr><td>Tris</td><td>FisherScientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vortex Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’adn

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Le microbiote intestinal joue un rôle important dans l’éducation du système immunitaire. Cette relation est extrêmement importante pour comprendre les maladies auto-immunes qui ne sont pas seulement motivées par des facteurs génétiques, mais aussi par des facteurs environnementaux qui peuvent déclencher l’apparition et / ou aggraver l’évolution de la maladie. Une étude publiée précédemment sur la dynamique du microbiote intestinal chez les souris femelles LMR/LPR sujettes au lupus a montré comment les changements du microbiote intestinal peuvent modifier la progression de la maladie. Ici, un protocole est décrit pour extraire des échantillons représentatifs du microbiote intestinal pour des études d’auto-immunité. Des échantillons de microbiote sont prélevés dans l’anus et traités, à partir desquels l’ADN est extrait selon une méthode phénol-chloroforme et purifié par précipitation alcoolique. Une fois la PCR effectuée, les amplicons purifiés sont séquencés à l’aide d’une plate-forme de séquençage de nouvelle génération au laboratoire national d’Argonne. Enfin, les données de séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S sont analysées. À titre d’exemple, les données obtenues à partir de comparaisons du microbiote intestinal de souris LMR/LPR avec ou sans CX3CR1 sont présentées. Les résultats ont montré des différences significatives dans les genres contenant des bactéries pathogènes telles que celles du phylum Proteobacteria, ainsi que du genre Bifidobacterium, qui est considéré comme faisant partie du microbiote commensale sain. En résumé, cette méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN est fiable et peut aider à étudier les changements du microbiote intestinal associés aux maladies auto-immunes.

Les résultats de l’Argonne National Laboratory sont analysés par un bioinformaticien qualifié, suivis d’une analyse interne des données à l’aide de méthodes statistiques standard. Les analyses typiques du microbiome impliquent le regroupement de séquences similaires en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) ou en variantes de séquence d’amplicon (ASV) comme proxy pour différents micro-organismes dans un échantillon. Les comptages d’OTU ou d’ASV dans les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour tester les change...

Ce protocole fournit une méthode d’isolement de l’ADN simple et rentable pour l’analyse des altérations du microbiote intestinal murin au cours du développement de maladies auto-immunes.

Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

La méthode d’isolement de l’ADN proposée peut servir à étudier la dynamique du microbiote intestinal dans des modèles murins de maladies auto-immunes. Une méthode plus polyvalente, rentable et efficace est proposée pour obtenir de l’ADN à partir d’échantillons fécaux comparables aux trousses disponibles dans le commerce. Pour commencer, sortez chaque souris individuellement de sa cage, collectez une pastille fécale directement dans l’anus et conservez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit traitée.Traiter les échantillons avec des pinces, des tubes et des gants stériles et propres. Ajoutez une pastille congelée à un tube à vis pré-pesé de deux millilitres et notez le poids fécal en grammes, qui devrait se situer entre 0,02 et 0,05 gramme par granulé fécal. Ajouter à la pastille une fine couche de billes de verre de 0,1 millimètre, 500 microlitres de tampon de lyse et 200 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 20%.Bead a battu le tube pendant quatre minutes dans un homogénéisateur, suivi de trois à cinq minutes de vortex. Centrifuger les tubes pendant une courte période pour éliminer les bulles et la mousse. Pour extraire l’ADN des échantillons de microbiote, transférer 350 microlitres de surnageant d’échantillon dans un nouveau tube à pression de 1,5 millilitres, sans aucun débris.Ajouter 500 microlitres de phénol:chloroforme:alcool isoamylique, dans un rapport de 25:24:1, et vortex pendant une minute. Après centrifugation, transférer 180 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à pression de 1,5 millilitre. Ajouter 180 microlitres de chloroforme, retourner et mélanger.À partir de là, transférez 180 microlitres de la phase aqueuse dans un nouveau tube à pression. Dans une armoire de biosécurité, ajoutez 180 microlitres d’isopropanol froid et 36 microlitres d’acétate d’ammonium à cinq molaires. Inversez-le plusieurs fois pour mélanger et placez le tube sur de la glace pendant 20 minutes.Jeter le surnageant, puis laver les granulés plusieurs fois avec 500 microlitres d’éthanol froid à 70%. Jeter le surnageant et sécher le tube à l’air sur du papier de soie à l’envers pendant 20 minutes, jusqu’à ce que la pastille devienne claire. Suspendre la pastille dans 50 microlitres d’eau de qualité moléculaire et chauffer le liquide à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour dissoudre complètement les grosses pastilles d’ADN.Après chauffage, centrifuger ces tubes à 3 400 fois G pendant une minute pour récupérer les gouttelettes de condensation du couvercle. Mesurer la concentration et obtenir le rapport 260/280 à l’aide d’un spectrophotomètre. Un rapport pour un ADN de bonne qualité est généralement compris entre 1,8 et deux.Centrifuger les échantillons préparés à 600 fois G pendant une minute à température ambiante, avant de les congeler à moins 80 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, envoyez 20 microlitres d’échantillons avec des concentrations allant de un à 50 nanogrammes par microlitre au laboratoire national d’Argonne pour le séquençage. La souche de souris dépourvue du récepteur CX3CR1 a une composition de microbiote intestinal différente de celle des souris LMR/lpr de type sauvage, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, montre des différences significatives dans certains genres, pertinentes pour les bactéries potentiellement pathogènes telles que celles du phylum Proteobacteria.Soyez prudent lorsque vous contaminez l’échantillon. Il doit être stérile. En outre, il est important de pipeter avec précision lors du transfert du surnageant dans un nouveau tube.Cette méthode convient à l’analyse moléculaire telle que la PCR, la digestion enzymatique de restriction ou la construction de bibliothèques génomiques. Dans le lupus, nous avons prouvé une forte relation entre le microbiote intestinal et la progression du lupus.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo décrit le protocole d’isolement de l’ADN à partir d’échantillons de selles de souris porteuses d’une tumeur du côlon. L’ADN extrait est amplifié à l’aide de la PCR, et le produit est nettoyé à l’aide d’une approche basée sur des billes magnétiques. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer l’effet de l’enrichissement de l’environnement sur le microbiote du côlon et la mortalité animale.

Isolement de l’ADN microbien dans les selles : étude de l’effet de l’enrichissement de l’environnement sur la diversité du microbiome dans un modèle de tumeur murine

Le transfert de lymphocytes bm12 chez un receveur C57BL/6 est un modèle établi de lupus érythémateux disséminé. Nous décrivons ici comment initier une maladie à l’aide de ce modèle et comment caractériser les cellules auxiliaires folliculaires T, les cellules B du centre germinatif et les plasmocytes par cytométrie en flux.

Le bm12 inductible modèle du lupus érythémateux disséminé (SLE) dans C57BL / 6

La caractérisation quantitative des lymphocytes intestinaux suscite un intérêt croissant en raison de la reconnaissance croissante du fait que ces cellules jouent un rôle essentiel dans diverses maladies intestinales et systémiques. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler des populations de cellules uniques de différents compartiments de l’intestin grêle pour une caractérisation ultérieure de la cytométrie en flux.

L&#39;isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l&#39;intestin grêle Lymphocytes murine

Enrichissement de l’environnement (ERE) est un environnement de logement des animaux qui permet de révéler les mécanismes qui sous-tendent les connexions entre le mode de vie, le stress et la maladie. Ce protocole décrit un procédé qui utilise un modèle murin de la tumorigenèse du côlon et EE pour définir précisément les altérations en biodiversité microbiote qui peut-être influer sur la mortalité animale.

Une méthode pour définir les effets de l’enrichissement environnemental sur la biodiversité le Microbiome du côlon dans un modèle murin de tumeur du côlon

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolement des lymphocytes des sites inductives y compris les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et les ganglions lymphatiques mésentériques drainants et les sites d’effecteur notamment la lamina propria et de la épithélium intestinal du petit système immunitaire intestinal.

Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

Ici nous fournissons des protocoles détaillés pour l’administration orale d’antibiotiques aux souris, collection d’échantillons de matières fécales, l’extraction d’ADN et la quantification des bactéries fécales de qPCR.

Analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote Intestinal après un traitement antibiotique par voie orale

Décrit ici est une procédure d'exploitation standard simplifiée pour le profilage de microbiome utilisant le séquençage et l'analyse ménomiques rRNA 16S utilisant des outils librement disponibles. Ce protocole aidera les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine du microbiome ainsi que ceux qui ont besoin de mises à jour sur les méthodes pour atteindre le profilage bactérien à une résolution plus élevée.

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

Le présent protocole décrit une méthode pour suivre la progression du lupus chez la souris. Deux procédures supplémentaires sont présentées pour caractériser la néphrite lupique basée sur l’infiltration cellulaire et le dépôt de protéines dans les reins.

Analyses de la protéinurie, de l’infiltration rénale des leucocytes et du dépôt rénal de protéines chez les souris LMR/LPR sujettes au lupus

L’objectif ici est de définir un protocole pour étudier les mécanismes de la dysbiose dans les maladies cardiovasculaires. Cet article explique comment collecter et transplanter de manière aseptique des échantillons fécaux murins, isoler les intestins et utiliser la méthode « Swiss-roll », suivie de techniques d’immunomarquage pour interroger les changements dans le tractus gastro-intestinal.

Isolement fécal murin et transplantation de microbiote

Ce protocole décrit les meilleures pratiques pour le transfert et l’hébergement de souris sans germes dans des isolateurs expérimentaux à cage unique (isocages) tout en maintenant des conditions stériles. Les méthodes de transplantation fécale chez des souris exemptes de germes et la collecte de bactéries viables à partir de ces souris intestinales « humanisées » pour d’autres applications sont discutées.

Préparation et maintenance d’une expérience de cage bio-exclusion isopositive pour la transplantation fécale humaine chez des souris exemptes de germes

Découvrez une méthode simple et économique d'isolement de l'ADN fécal pour étudier la dynamique du microbiote intestinal chez les souris modèles de maladies auto-immunes. Cette technique offre des résultats comparables aux kits commerciaux.

Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN

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