Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN
2 mai 2022
Ce protocole fournit une méthode d’isolement de l’ADN simple et rentable pour l’analyse des altérations du microbiote intestinal murin au cours du développement de maladies auto-immunes.
La méthode d’isolement de l’ADN proposée peut servir à étudier la dynamique du microbiote intestinal dans des modèles murins de maladies auto-immunes. Une méthode plus polyvalente, rentable et efficace est proposée pour obtenir de l’ADN à partir d’échantillons fécaux comparables aux trousses disponibles dans le commerce. Pour commencer, sortez chaque souris individuellement de sa cage, collectez une pastille fécale directement dans l’anus et conservez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit traitée.
Traiter les échantillons avec des pinces, des tubes et des gants stériles et propres. Ajoutez une pastille congelée à un tube à vis pré-pesé de deux millilitres et notez le poids fécal en grammes, qui devrait se situer entre 0,02 et 0,05 gramme par granulé fécal. Ajouter à la pastille une fine couche de billes de verre de 0,1 millimètre, 500 microlitres de tampon de lyse et 200 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 20%.
Bead a battu le tube pendant quatre minutes dans un homogénéisateur, suivi de trois à cinq minutes de vortex. Centrifuger les tubes pendant une courte période pour éliminer les bulles et la mousse. Pour extraire l’ADN des échantillons de microbiote, transférer 350 microlitres de surnageant d’échantillon dans un nouveau tube à pression de 1,5 millilitres, sans aucun débris.
Ajouter 500 microlitres de phénol:chloroforme:alcool isoamylique, dans un rapport de 25:24:1, et vortex pendant une minute. Après centrifugation, transférer 180 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à pression de 1,5 millilitre. Ajouter 180 microlitres de chloroforme, retourner et mélanger.
À partir de là, transférez 180 microlitres de la phase aqueuse dans un nouveau tube à pression. Dans une armoire de biosécurité, ajoutez 180 microlitres d’isopropanol froid et 36 microlitres d’acétate d’ammonium à cinq molaires. Inversez-le plusieurs fois pour mélanger et placez le tube sur de la glace pendant 20 minutes.
Jeter le surnageant, puis laver les granulés plusieurs fois avec 500 microlitres d’éthanol froid à 70%. Jeter le surnageant et sécher le tube à l’air sur du papier de soie à l’envers pendant 20 minutes, jusqu’à ce que la pastille devienne claire. Suspendre la pastille dans 50 microlitres d’eau de qualité moléculaire et chauffer le liquide à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour dissoudre complètement les grosses pastilles d’ADN.
Après chauffage, centrifuger ces tubes à 3 400 fois G pendant une minute pour récupérer les gouttelettes de condensation du couvercle. Mesurer la concentration et obtenir le rapport 260/280 à l’aide d’un spectrophotomètre. Un rapport pour un ADN de bonne qualité est généralement compris entre 1,8 et deux.
Centrifuger les échantillons préparés à 600 fois G pendant une minute à température ambiante, avant de les congeler à moins 80 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, envoyez 20 microlitres d’échantillons avec des concentrations allant de un à 50 nanogrammes par microlitre au laboratoire national d’Argonne pour le séquençage. La souche de souris dépourvue du récepteur CX3CR1 a une composition de microbiote intestinal différente de celle des souris LMR/lpr de type sauvage, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, montre des différences significatives dans certains genres, pertinentes pour les bactéries potentiellement pathogènes telles que celles du phylum Proteobacteria.
Soyez prudent lorsque vous contaminez l’échantillon. Il doit être stérile. En outre, il est important de pipeter avec précision lors du transfert du surnageant dans un nouveau tube.
Cette méthode convient à l’analyse moléculaire telle que la PCR, la digestion enzymatique de restriction ou la construction de bibliothèques génomiques. Dans le lupus, nous avons prouvé une forte relation entre le microbiote intestinal et la progression du lupus.
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Aperçu
Ce protocole propose une méthode simple et économique d'isolement de l'ADN pour l'analyse des modifications du microbiote intestinal murin au cours du développement d'une maladie auto-immune. La méthode est conçue pour étudier la dynamique du microbiote intestinal dans des modèles murins de maladies auto-immunes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Microbiologie
- Auto-immunité
Contexte
- La compréhension du microbiote intestinal est essentielle dans la recherche sur les maladies auto-immunes.
- Les méthodes actuelles d'isolement de l'ADN peuvent être coûteuses et complexes.
- Cette étude propose une alternative plus efficace et plus économique.
- Des échantillons fécaux sont utilisés pour analyser les modifications du microbiote.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode fiable d'extraction de l'ADN à partir d'échantillons fécaux.
- Faciliter l'étude du microbiote intestinal dans les modèles de maladies auto-immunes.
- Comparer l'efficacité de la nouvelle méthode à celle des kits disponibles commercialement.
Méthodes utilisées
- Collecte individuelle de pellets fécaux provenant de souris.
- Stockage des échantillons à -80 degrés Celsius.
- Utilisation d'outils stériles pour le traitement des échantillons.
- Préparation des échantillons avec un tampon de lyse et des billes de verre.
Résultats principaux
- La méthode proposée donne une qualité d'ADN comparable à celle des kits commerciaux.
- Elle est rentable et efficace pour l'analyse de la microflore.
- Elle facilite des recherches ultérieures sur les mécanismes des maladies auto-immunes.
Conclusions
- Cette méthode d'isolement de l'ADN constitue un outil précieux pour les chercheurs.
- Elle permet d'étudier la microbiote intestinale dans les contextes pathologiques.
- Elle favorise une recherche plus accessible dans le domaine de l'auto-immunité.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'analyse fiable de la dynamique du microbiote intestinal dans les modèles de maladies auto-immunes est essentielle pour comprendre les contributions environnementales et génétiques à la progression de la maladie. Ce protocole de coût modéré d'isolement d'ADN permet une extraction reproductible et évolutive de l'ADN microbien à partir d'échantillons fécaux de souris, soutenant ainsi des études à haut débit sur le microbiome dans la recherche préclinique. La méthode renforce la confiance prédictive dans l'association entre les modifications du microbiote et les phénotypes auto-immuns, orientant les stratégies de découverte précoce et de translation.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'étudier les interactions entre le microbiote et le système immunitaire dans des modèles murins pertinents pour la maladie.
- Permet la validation fonctionnelle de voies candidates influencées par la composition microbienne intestinale.
- Facilite la réduction mécanistique des risques en reliant les modifications microbiennes à la progression de l'auto-immunité.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des échantillons d'ADN standardisés et reproductibles pour le séquençage en aval et les tests moléculaires.
- Garantit un ADN quantitatif et de haute qualité, adapté aux protocoles de PCR et de séquençage de nouvelle génération.
- Permet un traitement d'échantillons à l'échelle adaptative pour des études comparatives de microbiomes entre cohortes expérimentales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne le profilage préclinique du microbiote avec la progression de la maladie et les efforts de découverte de biomarqueurs.
- Permet une continuité entre les résultats obtenus en phase de découverte et la validation translationnelle dans les modèles auto-immuns.
- Réduit l'ambiguïté biologique dans l'association entre les facteurs déclenchants environnementaux et les phénotypes de la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'isolement de l'ADN s'inscrit dans le continuum entre la phase de découverte précoce et le développement préclinique, permettant une analyse robuste du microbiome chez des modèles murins prédisposés au lupus et soutenant l'identification de candidats thérapeutiques et les études mécanistiques.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur la modulation immunitaire induite par le microbiote dans les maladies auto-immunes.
- Écrantage : Fournit des produits d'ADN reproductibles et quantitatifs pour le profilage du microbiome basé sur le séquençage.
- Analyse : Offre une entrée de haute qualité pour la comparaison statistique des modifications communautaires microbiennes entre génotypes ou traitements.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes précliniques sur le microbiome à un développement potentiel de biomarqueurs dans les maladies auto-immunes.
- Réutilisation en milieu professionnel : Propose un protocole évolutif et rentable, adaptable à divers modèles murins et plans expérimentaux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les associations entre microbiote et maladies, ainsi que dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'extraction de l'ADN, améliorant la reproductibilité et l'extensibilité entre les études.
- Valeur stratégique : Permet des décisions éclairées de poursuite ou d'abandon en clarifiant la contribution du microbiome aux mécanismes de la maladie.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des interventions modulant le microbiome dans les programmes de maladies auto-immunes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise technique en manipulation stérile des échantillons et en protocoles de biologie moléculaire.
- Suppose l'accès à des homogénéisateurs, des centrifugeuses et des spectrophotomètres pour le contrôle qualité.
- Exige une standardisation rigoureuse entre les équipes afin de minimiser la contamination et la variabilité.
- Adaptable à divers modèles murins, mais peut nécessiter une optimisation selon les types d'échantillons.
- Dépend d'une pipetage précis et d'une technique stérile pour garantir l'intégrité des données.
