Formulation et caractérisation d’un système de transport de dopamine à base d’exosomes
4 avril 2022
Ici, nous avons cherché à obtenir une formulation par chargement dopaminergique des exosomes isolés de cellules souches issues des cellules souches mésenchymateuses gelées de Wharton. L’isolement et la caractérisation des exosomes, la charge du médicament dans les exosomes résultants et l’activité cytotoxique de la formulation développée sont décrits dans ce protocole.
Les exosomes peuvent réagir aux vésicules sécrétées par une cellule d’une taille comprise entre 14 et 200 nanomètres, et se séparer de la cargaison intracellulaire et de la communication, qui se trouve dans le plus petit sous-groupe de vésicules extracellulaires. Les exosomes, qui se forment à la suite de la différenciation de l’endosome, proviennent de la membrane cellulaire. Les cellules souches peuvent être isolées à partir de différentes sources telles que la moelle osseuse ou les tissus adipeux.
mais les cellules souches séchées des tissus adultes ont un potentiel immunogène plus élevé Inconvénients de la taille des exosomes, on dit qu’ils jouent un rôle important dans la maladie du système nerveux central car ils peuvent passer à travers la barrière hémato-encéphalique. Pour commencer, lavez les cellules souches mésenchymateuses de gelée de Wharton ensemencées avec cinq millilitres de PBS. Ajoutez ensuite cinq millilitres de solution d’EDTA de trypsine avant de placer le flacon dans un incubateur.
Après incubation, prélever les cellules et centrifuger à 1 500 g pendant cinq minutes. Retirez ensuite le surnageant et ajoutez un millilitre de DMEM-F12 contenant 10% FBS dans le tube. Laver les cellules cultivées avec du PBS.
Après le lavage, ajoutez le milieu DMEM-F12 sans sérum aux cellules et placez-le dans l’incubateur. Pour isoler les exosomes, prélever le milieu sans sérum et centrifuger à 300 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez le surnageant dans un autre tube et traitez-le par centrifugation en série à des vitesses plus élevées.
Après la centrifugation finale, retirez lentement le surnageant et dissolvez la pastille dans un millilitre de PBS. Mélanger par vortex et procéder à l’ultracentrifugation à 110 000 G pendant 70 minutes à quatre degrés Celsius. Ajouter trois millilitres de PBS à la suspension d’exosomes prélevée précédemment par ultracentrifugation et stériliser la suspension diluée par filtration à l’aide d’un filtre de 0,22 micron.
Transférez ensuite 500 microlitres de la suspension d’exosomes stérilisée dans un autre tube. Ensuite, séquentiellement, ajoutez 500 microlitres de solution de dopamine à 0,5 milligramme par millilitre et de saponine dans la suspension stérilisée. Après l’incubation, ultracentrifuger la suspension.
L’échantillon peut être utilisé pour l’analyse NTA et DLS afin de caractériser les exosomes chargés en dopamine ou stocké à moins 20 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Dans l’analyse NTA, la taille moyenne des exosomes dérivés de la gelée de Wharton a été déterminée à 98 nanomètres et les exosomes chargés en dopamine à 110 nanomètres. Les nombres de nanoparticules révélés par les analyses NTA et DLS étaient cohérents entre eux.
Le potentiel zêta des exosomes dérivés de la gelée de Wharton a été mesuré à moins 15,7 et les exosomes chargés en dopamine à moins 17,6 millivolts. L’analyse HPLC des exosomes chargés en dopamine a détecté le pic de dopamine à 6,45 minutes. Le profil de libération cumulatif du médicament a révélé que 74,8 % de la dopamine encapsulée a été libérée par les exosomes au cours des huit premières heures.
La cytotoxicité des exosomes libres et chargés en dopamine sur les fibroblastes a été étudiée. Bien que les exosomes chargés en dopamine n’aient pas démontré d’effets cytotoxiques, la saponine a diminué la viabilité des fibroblastes. Le test MTT a montré une viabilité cellulaire accrue lorsque les fibroblastes ont été traités avec les exosomes chargés en dopamine.
La signification statistique des résultats a été évaluée en effectuant une anova à un facteur. De plus, les effets cytotoxiques de différentes concentrations d’exosomes libres ont été étudiés sur les fibroblastes. La viabilité des fibroblastes était plus élevée avec des exosomes libres à la concentration de 25 microlitres par millilitre.
Il est très important pour le système nerveux central que la taille des patients joue un rôle dans des processus tels que la plasticité, la réponse neurologique, la communication latérale et la neurogenèse dans le cerveau. De plus, grâce à la surface des exosomes, il a été observé qu’ils peuvent interagir avec le médicament de la cellule cible et l’activité délivrée pendant le médicament est un achèvement. Pour la première fois dans le cadre de l’étude, nous avons mis au point une nouvelle formulation de médicament en encapsulant de la dopamine dans des exosomes dérivés de cellules souches.
Il a suggéré que cette formulation sera très prometteuse pour le traitement de la maladie de Parkinson.
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Aperçu
Cette étude se concentre sur la formulation d'exosome chargés de dopamine dérivés des cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton. Le protocole détaille l'isolement et la caractérisation des exosomes, le chargement du médicament et l'évaluation de l'activité cytotoxique.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Recherche sur les cellules souches
- Systèmes d'administration de médicaments
Contexte
- Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires impliquées dans la communication cellulaire.
- Ils jouent un rôle important dans divers processus biologiques, y compris ceux du système nerveux central.
- Les cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton sont une source prometteuse pour l'isolement des exosomes.
- Les exosomes peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique, ce qui les rend précieux pour des applications thérapeutiques.
Objectif de l'étude
- Développer une formulation utilisant des exosomes chargés de dopamine.
- Examiner les effets cytotoxiques de la formulation développée.
- Améliorer la compréhension des systèmes d'administration de médicaments basés sur les exosomes.
Méthodes utilisées
- Isolement des cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton.
- Caractérisation des exosomes isolés.
- Chargement de dopamine dans les exosomes.
- Évaluation de l'activité cytotoxique de la formulation.
Résultats principaux
- Isolement et caractérisation réussis des exosomes.
- Chargement efficace de dopamine dans les exosomes.
- L'évaluation des effets cytotoxiques a démontré le potentiel de la formulation.
- Les résultats soutiennent l'utilisation des exosomes dans les applications de livraison de médicaments.
Conclusions
- Les exosomes chargés de dopamine montrent du potentiel pour une utilisation thérapeutique.
- L'étude fournit un protocole pour la recherche sur l'administration de médicaments basée sur les exosomes.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour explorer pleinement le potentiel de cette approche.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Exosome-based nanocarriers offer a promising platform for delivering small molecules across the blood-brain barrier, addressing a critical challenge in CNS drug development. The encapsulation and characterization of dopamine within stem cell-derived exosomes demonstrates a reproducible workflow for evaluating drug delivery vehicles in early discovery. This approach supports predictive confidence in translational neuroscience portfolios by enabling quantitative assessment of carrier efficacy and cytotoxicity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of exosome-mediated delivery mechanisms for CNS-targeted therapeutics.
- Supports biological de-risking by quantifying encapsulation efficiency and release kinetics.
- Facilitates functional validation of carrier systems using cytotoxicity and viability assays.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for exosome isolation, drug loading, and nanoparticle characterization.
- Delivers quantitative outputs via NTA, DLS, zeta potential, and HPLC analyses.
- Enables reproducible assessment of drug release profiles and cytotoxicity in vitro.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by leveraging exosomes' ability to cross the blood-brain barrier.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation through quantitative release and viability data.
- Reduces mechanistic ambiguity in CNS drug delivery strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This exosome-based carrier system fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling iterative optimization before lead identification.
- Discovery Biology: Quantitative encapsulation and release data inform hypothesis testing for CNS delivery.
- Screening: Standardized nanoparticle and cytotoxicity assays support assay readiness and reproducibility.
- Analytics: HPLC and particle analysis provide robust comparative metrics for formulation assessment.
- Translational Research: Exosome-mediated delivery supports biomarker alignment and preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable for other small molecule or biologic payloads in CNS research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CNS-targeted delivery systems.
- Operational Value: Standardizes exosome isolation, loading, and characterization for scalable workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for novel carrier platforms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS delivery strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle isolation, characterization, and analytical chemistry.
- Needs access to ultracentrifugation, NTA, DLS, and HPLC instrumentation.
- Demands cross-team standardization of exosome preparation and assay protocols.
- Adaptable to various stem cell sources and small molecule payloads.
- Release kinetics and cytotoxicity must be validated for each new formulation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Culturing and Cryopreservation of Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells
1:30
Production of Exosomes from Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells
2:20
Dopamine Loading into Exosomes and Characterization of Dopamine Loaded Exosomes
3:15
Results: Development of a Nanocarrier System by Encapsulation of Dopamine into Exosomes Isolated from WJ‐MSCs
5:07
Conclusion
