Analyse quantitative des propriétés viscoélastiques des globules rouges à l’aide de pinces optiques et de microscopie à défocalisation

Cette méthodologie permet d’explorer le comportement mécanique des érythrocytes, en caractérisant leurs paramètres viscoélastiques et leurs caractéristiques vitreuses molles pour plusieurs conditions physiologiques et pathologiques. Notre méthode basée sur une seule cellule vérifie les références vidéo en utilisant les valeurs métalliques pour le facteur de forme qui relie les forces et les déplacements, les contraintes et les éraflures dans la surface érythrocytes. Commencez par verser de la graisse de silicone sur la surface de l’anneau en caoutchouc de manière à couvrir tout le périmètre.

Ensuite, placez l’anneau en caoutchouc sur le couvercle avec le côté gras face au couvercle. Attendez cinq minutes pour une fixation correcte, et les détenteurs d’échantillons sont alors prêts à recevoir la culture cellulaire. Ensuite, avec la solution de cellules préalablement préparée suivant le protocole écrit, ensemencez les cellules dans le porte-échantillon.

Ajouter 0,2 microlitre d’une solution de sphère de polystyrène à 10 % en volume à l’échantillon. Placez le deuxième couvercle au-dessus de l’anneau en caoutchouc. Fermez la configuration et terminez la préparation de l’échantillon.

Enfin, déplacez l’échantillon entier au microscope. Pour commencer l’expérimentation, utilisez le système OT, piégez la sphère avec le laser OT, puis fixez-la à la lamelle de couverture, près de la cellule. Ensuite, interceptez une autre sphère et répétez la même procédure de fixation en appuyant la sphère contre la surface de la cellule, près de la surface supérieure et près du bord de la cellule.

Ajouter une fonction sinusoïdale d’amplitude et de fréquences variables. Ensuite, appuyez sur le bouton « start », en utilisant l’étage piézoélectrique pour permettre le déplacement piézoélectrique. Gardez la sphère de globule rouge dans le piège et soumettez l’échantillon à un cycle de mouvements en utilisant la fonction sinusoïdale précédemment définie.

Pour l’analyse, ouvrez le logiciel ImageJ et importez le film entier obtenu lors des mouvements sinusoïdaux. Cliquez sur Ajuster, puis sélectionnez le seuil d’option. Ajustez le seuil avec les deux barres de défilement et sélectionnez la sphère de référence en cliquant sur fichier, suivi d’un rectangle.

Ensuite, dans l’onglet analyser, cliquez sur l’option « définir les mesures"et sélectionnez le centre de masse ». Cliquez à nouveau sur l’onglet Analyser et sélectionnez Analyser les particules. Une nouvelle fenêtre contenant un tableau avec les coordonnées xy pour le centre de la masse apparaîtra.

Répétez la procédure pour l’autre sphère fixée à la surface RBC. Ouvrez le logiciel d’analyse et importez les fichiers txt précédemment obtenus. Générez un tracé avec les centres de masse sur l’axe des y et le temps sur l’axe des abscisses.

Tracez les résultats sur un graphique en utilisant l’axe des x pour la constante de perte, noté K double nombre, et l’axe des y pour la constante de stockage, noté K premier. Tout d’abord, pour l’acquisition vidéo, déplacez l’étage piézoélectrique dans la direction xy, en utilisant le logiciel pour rechercher une cellule isolée attachée à la lame. Pièger et fixer une sphère de polystyrène de diamètre connu à la surface des globules rouges.

Ensuite, à l’aide de l’étage piézoélectrique, déplacez le cordon piégé attaché à la surface de la globule rouge pour déformer la cellule, puis fixez le cordon à la lèvre de couverture. Maintenant, changez la position de l’axe z pour trouver l’image nette. Après avoir fixé la position, utilisez le logiciel de la caméra pour créer un film de la cellule entière.

Ensuite, déplacez la position de l’axe z de deux micromètres vers le bas ou vers le haut pour obtenir une image défocalisée pour la cellule choisie. Enfin, sans modifier la position de l’axe z, recherchez une région sans cellules pour répéter la même procédure et créez un film de l’arrière-plan de l’image. Pour l’acquisition d’images de contraste, recherchez d’abord la valeur de N zéro, cliquez sur l’icône de sélection de polygone, puis cliquez sur l’onglet analyser et sélectionnez mesure.

Ensuite, utilisez l’équation de contraste pour déterminer N image moins N zéro, et exécutez-la en sélectionnant math"under process, puis soustraire. Plus tard, divisez le résultat par N zéro moins B.Enfin, trouvez le contraste pour les images focalisées et défocalisées. Maintenant, utilisez la transformée de Hartley pour obtenir l’épaisseur RBC.

Dans ImageJ, cliquez sur processus, suivi des options FFT et FFT, puis choisissez FHT. Effectuez ensuite la transformation inverse FHT en sélectionnant processus, suivi de FFT"et FFT. Utilisez l’image résultante pour obtenir le profil de hauteur.

Après avoir trouvé l’image qui contient le profil de hauteur RBC, utilisez le contraste flou de deux micromètres pour créer un ensemble de deux images dans ImageJ. Pour trouver le facteur de forme, utilisez une macro personnalisée ImageJ pour analyser la pile. La macro fournit un tableau avec la position de l’arête, le périmètre, l’inverse du périmètre et une image de la cellule analysée.

Vérifiez si les bords de cette image sont similaires à ceux de la figure de référence. Sinon, répétez la procédure et utilisez la somme de l’inverse du périmètre pour trouver le facteur de forme. Commencez par organiser les données expérimentales dans un tableau.

Créez une nouvelle table dans le logiciel d’analyse en cliquant sur l’onglet fichier. Déterminez 10 colonnes différentes pour les paramètres. Pour tracer la courbe G nombre premier et G double nombre premier dans le logiciel d’analyse, utilisez les données du tableau précédent et cliquez sur le bouton plot.

Pour obtenir les paramètres Gamma et GM, cliquez sur l’onglet ajustement de la courbe et sélectionnez fit1"pour ouvrir une nouvelle fenêtre. Sélectionnez le carré, cliquez sur le bouton Définir et tapez l’équation. Cliquez sur le bouton « OK » dans les deux fenêtres, et le raccord apparaîtra.

Ensuite, créez deux autres tracés, à savoir G premier et G double nombre premier en fonction de l’oméga. Placez les barres d’erreur uniquement sur l’axe y, comme illustré précédemment. Répétez la procédure d’ajustement de courbe, sélectionnez G"option.

Cliquez sur Définition de la courbe » sous ajustement général, puis écrivez l’équation concernée. Enfin, cliquez sur OK, et un ajustement de courbe apparaîtra avec les valeurs pour Alpha et G zéro. Encore une fois, effectuez une autre procédure d’ajustement de courbe.

Sélectionnez G"option, cliquez sur définition de courbe"sous ajustement général, puis écrivez l’équation concernée. Enfin, cliquez sur OK et un ajustement de courbe apparaîtra. La figure montre la constante élastique de stockage en fonction de la constante élastique de perte.

La dépendance linéaire observée démontre que la surface des globules rouges peut être considérée comme un matériau vitreux souple. En appliquant les valeurs du facteur de forme global de la cellule et de l’épaisseur de surface des globules rouges, les valeurs de l’exposant Alpha peuvent être déterminées. Cette technique peut fournir la base de nouvelles méthodes de diagnostic qui corrélent les changements dans les propriétés viscoélastiques des érythrocytes avec des modifications du flux sanguin d’individus atteints de pathologies différentes.