Génération de motifs pour la microscopie de traction à micromotifs

Ce protocole permet la création cohérente de micro-modèles protéiques haute fidélité de la forme souhaitée, notamment des îlots de motif isolés pour l’étude des amas cellulaires. Cette technique peut être utilisée pour créer des micro-motifs insulaires isolés de toute forme et taille en une seule étape, alors qu’auparavant, la fabrication de tels modèles nécessitait deux étapes distinctes. Commencez par mélanger le PDMS dans le bon rapport agent de durcissement /base, comme décrit dans les instructions du fabricant.

Incuber à température et pression ambiantes pendant 15 minutes, puis dégazer le mélange sous vide pendant 15 minutes. Versez le PDMS dans le moule maître et transférez-le dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius pour durcir pendant la nuit. Retirez le moule maître de l’incubateur et laissez-le refroidir à la température ambiante.

Pendant que le moule maître refroidit, sonicez des couvercles de 25 millimètres dans de l’éthanol pendant 10 minutes. Utilisez autant de couvertures que le nombre de timbres en cours de préparation. Rincez soigneusement les couvercles avec de l’eau DI et séchez-les à l’aide d’un pistolet à air filtré.

Traitez les couvercles avec du plasma pendant une minute à l’aide du nettoyeur plasma sous vide poussé. Relâchez lentement le vide après le traitement pour empêcher les couvercles de se déplacer à l’intérieur de la chambre. Enduisez chaque couvercle de 100 microlitres de la solution protéique marquée fluorescente dans une pièce dépourvue de lumière directe du soleil ou d’éclairage aérien.

Couvrez les échantillons pour une protection supplémentaire contre la lumière et incubez-les pendant 20 minutes à température ambiante. Rincez soigneusement chaque couvercle avec de l’eau DI. Éliminez l’excès d’eau de la surface en tapotant doucement les côtés de chaque couvercle sur une serviette en papier ou un matériau absorbant similaire.

Laissez les couvercles sécher complètement en les laissant à découvert dans l’obscurité pendant au moins 30 minutes. Pendant que les couvercles recouverts de protéines sèchent, retirez le tampon PDMS du moule principal en le coupant avec un scalpel ou une lame tranchante. Traitez les tampons PDMS avec du plasma pendant deux minutes sous vide poussé.

Placez les tampons dans un récipient avec un couvercle sous la hotte, puis enduisez chaque tampon d’une fine couche de 10% 3-APTMS diluée dans de l’éthanol à 100%. Couvrir le récipient avec les tampons et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Rincez soigneusement chaque tampon des deux côtés avec de l’eau DI.

Placez les timbres dans un récipient propre et enduisez-les de 2,5% de glutaraldéhyde préparé dans de l’eau DI. Couvrez les timbres et incubez-les à température ambiante pendant 30 minutes. Rincez soigneusement les tampons à l’eau DI.

Retirez l’excès d’eau de la surface comme décrit précédemment et laissez les timbres sécher à découvert pendant 30 minutes. Si, après 30 minutes, les couvercles ou les tampons recouverts de protéines ne sont pas complètement secs, utilisez un pistolet à air filtré pour les sécher complètement. Poussez le côté motif des tampons sur les couvercles avec suffisamment de pression pour qu’ils puissent entrer en contact complet.

Laissez-le tranquille pendant 15 minutes. Ensuite, décollez soigneusement les tampons PDMS des couvercles. À l’aide d’un microscope fluorescent avec le filtre approprié, vérifiez la fidélité des couvercles à motifs.

Utilisez immédiatement les couvercles à motifs ou rangez-les à l’abri de la lumière directe jusqu’à une utilisation ultérieure. Avant de préparer le précurseur d’hydrogel PAA, retirez l’ester d’acide acrylique NHS du réfrigérateur pour atteindre la température ambiante avant d’être ouvert. Préparez un plat à couvercle interchangeable en le stérilisant avec de l’éthanol à 70%, puis incuvrez-le sous la lumière UV dans une armoire de biosécurité pendant au moins 30 minutes avant utilisation.

Sous la hotte, ajouter 1,25 millilitre d’acrylamide à 40 % préparé dans de l’eau DI à un tube conique de 15 millilitres. Dans le même tube, ajouter 175 microlitres de solution de bis-acrylamide préparée dans de l’eau DI. Ajoutez ensuite 500 microlitres de 10X PBS, suivis de 2,915 millilitres d’eau DI.

Pipette 969 microlitres de ce précurseur dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et stocker le reste à quatre degrés Celsius pendant deux semaines. Mesurez 50 à 100 milligrammes d’APS dans un tube de microcentrifugation frais et diluez-le à 100 milligrammes par millilitre dans de l’eau DI. Ouvrez l’ester NHS dans la hotte et mesurez soigneusement jusqu’à trois milligrammes de NHS dans un tube de microcentrifugation.

Diluer l’ester NHS à un milligramme par millilitre dans 1X PBS. Sous la hotte, ajouter deux microlitres de TEMED au tube de microcentrifugation contenant l’aliquote de 969 microlitres de précurseur PAA. Ajouter 15 microlitres d’un HCL molaire pour diminuer le pH de la solution d’hydrogel et éviter l’hydrolyse de l’ester NHS.

Ajouter 10 microlitres de la solution d’ester NHS au tube. Effectuez les étapes suivantes dans une armoire de biosécurité. Placez soigneusement le couvercle de 30 millimètres dans la partie centrale de l’ensemble de couvercles avec le 3-APTMS et le glutaraldéhyde traité côté vers le haut et vissez l’anneau en plastique sur le dessus.

Configurez le couvercle à motifs avec une exposition minimale à la lumière pour vous préparer à l’étape suivante. Pipette cinq microlitres de solution APS dans le tube aliquote précurseur PAA, puis inverser et mélanger. Pipettez immédiatement 35 microlitres de cette solution sur le couvercle de 30 millimètres.

Placez le couvercle à motifs sur la solution avec le côté protéine vers le bas. Attention à ne pas créer de bulles d’air dans l’hydrogel. Protégez l’hydrogel de la lumière et laissez-le polymériser pendant 90 minutes.

Une fois l’hydrogel polymérisé, utilisez une lame de rasoir ou un scalpel pour enlever le couvercle supérieur, assurez-vous que le couvercle ne retombe pas ou ne glisse pas du gel une fois retiré pour éviter de ruiner le motif à la surface du gel. Pour passiver tout ester NHS restant dans l’hydrogel, ajoutez deux millilitres de PBS stérile au gel et incubez à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Préparez immédiatement les gels pour des expériences ou conservez-les pendant la nuit dans du PBS stérile à quatre degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure.

Les hydrogels ont été indirectement modelés avec de la fibronectine fluorescente pour visualiser et mesurer les forces de traction cellulaire au sein des grappes et créer des motifs d’îlots de taille et de forme prédéterminées. La qualité du motif était directement liée à la fidélité du moule maître à partir duquel le tampon PDMS a été coulé. Cette méthode pourrait fabriquer des motifs d’îlots isolés, bien définis, de forme prédéterminée.

Les points d’adhésion à la fibronectine n’étaient présents que dans la zone souhaitée de l’île. Ces îlots isolés de points d’adhésion ont en outre permis un meilleur contrôle de la forme de l’amas. Le revêtement des tampons PDMS avec deux petits 3-APTMS est essentiel car il limitera l’efficacité de la méthode d’élimination, tandis qu’un trop grand nombre créera un résidu orange sur la surface du timbre.

Les modèles créés ici peuvent être utilisés pour déterminer les forces de traction cellulaire dans les cellules individuelles et les amas, ce qui donne un aperçu de leur capacité à maintenir l’homéostasie mécanique.