Construction de mutants homozygotes du criquet migrateur à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9

Le criquet migrateur est un test agricole important. Cette méthode fournit un protocole efficace et facile à céder pour les méthodes de pression génique de l’Il s’agit d’une méthode systématique et détaillée de construction CRISPR/CAS9 de mutants homozygotes du criquet, y compris la collecte d’œufs, le criblage des mutants et le maintien homozygote. Pour commencer, préparez les aiguilles d’injection en tirant les capillaires en verre avec un extracteur de micro-pipettes.

Réglez les paramètres comme décrit dans le manuscrit textuel, puis broyez la pointe de l’aiguille d’injection avec une micro-meuleuse. Préparer la protéine ribonucléo pour l’injection en mélangeant un microlitre de protéine Cas9 avec un microlitre de l’ARN guide unique vérifié. Ajoutez ensuite huit microlitres d’eau stérile libre de l’ARN pour obtenir le volume final du mélange, 10 microlitres.

Bien mélanger la solution et la placer sur de la glace. Ensuite, récupérez les gousses d’œufs fraîchement pondues de la gousse de position des ovules et attendez le bronzage des œufs. Après 30 minutes, utilisez une brosse fine pour isoler les œufs des gousses dans l’eau et lavez les œufs trois fois avec de l’eau stérile.

Ensuite, placez les œufs dans une boîte de Petri et ajoutez de l’eau stérile pour les garder humides. Remplissez l’aiguille d’injection avec la solution de protéine ribonucléo préparée et chargez l’injection sur le micromanipulateur. Définissez les paramètres de micro-injection sur 300 hectopascals de pression d’injection, 0,5 seconde de temps d’injection et 25 hectopascals de pression de compensation.

Lorsque les paramètres sont réglés, appuyez sur la pédale pour évaluer le volume de la solution injectée. Ajustez la pression et le temps d’injection pour vous assurer que le volume d’injection est d’environ 50 à 100 nanolitres. Après avoir disposé régulièrement les œufs stériles sur le tampon d’injection, placez le tampon sur la table d’objets du microscope et ajustez le grossissement du microscope jusqu’à ce que les œufs soient observés.

Ajustez ensuite l’aiguille de micro-injection au microscope jusqu’à ce que l’embout d’injection soit visible et positionnez-le près de l’œuf à injecter. Commencez l’injection à une hauteur appropriée et à un angle de 30 à 45 degrés. Insérez la pointe dans l’œuf près des micro-piles de l’œuf et appuyez sur la pédale pour accomplir l’injection.

Ensuite, rétractez rapidement l’aiguille et déplacez le tampon d’injection pour l’injection de l’œuf suivant. Transférer les œufs injectés dans une boîte de culture avec un morceau de papier filtre humide. Placez-les dans un incubateur à 30 degrés Celsius.

Après l’injection, vérifiez le développement des ovules injectés tous les jours. Transférer les œufs injectés dans une nouvelle boîte de culture toutes les 24 heures au cours des cinq premiers jours. Le sixième jour après l’injection, cueillez et transférez au hasard 10 œufs dans un tube et broyez correctement les œufs avec deux billes d’acier à 60 hertz pendant six minutes à l’aide d’un broyeur.

Après le meulage, remettez les débris en suspension dans un millilitre de PBS. Ensuite, transférez cinq microlitres du mélange remis en suspension dans 45 microlitres d’hydroxyde de sodium à 50 millimolaires pour lyser à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour mettre fin à la réaction de lyse alcaline, ajoutez cinq microlitres d’une solution molaire de chlorhydrate de Tris dans le système de lyse.

Prenez un microlitre du produit de lyse comme modèle de PCR pour amplifier le fragment de gène cible. Après la PCR et le séquençage, comparez les résultats du séquençage avec la séquence de type sauvage pour évaluer si le système CRISPR / Cas9 a clivé le gène cible in vivo. Laisser le reste des œufs pour un développement ultérieur car les indels sont détectés au stade embryonnaire.

Après le développement, le transfert et la culture, les nymphes écloses dans une cage d’élevage comme décrit dans le manuscrit. Lorsque les nymphes atteignent le cinquième stade, séparez-les avec des gobelets de culture en plastique. Effectuer des croisements à l’aide des mutants G0 et des criquets de type sauvage.

Après avoir recueilli des oassists, utilisez trois à six ovules développés dans chaque oassist pour détecter les mutations comme décrit précédemment. Conservez les oassists positifs pour le développement ultérieur et abandonnez les oassists mutation-négatifs. Pour la cryoconservation, lavez les œufs avec de l’eau stérile et incuberez-les dans un plat de culture comme expliqué précédemment.

Après cinq à six jours, rassemblez les œufs dans le plat de culture et recouvrez-les de fragments de papier filtre. Ensuite, enveloppez tout le plat de culture avec un film de paraffine. Placez le plat à 25 degrés Celsius pendant deux jours, suivis de deux autres jours à une température plus basse de 13 à 16 degrés Celsius.

Ensuite, transférez le plat dans un réfrigérateur à six degrés Celsius. Ajouter de l’eau au plat toutes les deux semaines pour fournir un environnement humide aux œufs. Enfin, pour ressusciter les œufs cryoconservés, placez la boîte de Petri à 25 degrés Celsius pendant deux jours.

Plus tard, placez les œufs dans un incubateur à 30 degrés Celsius jusqu’à l’éclosion des nymphes. Dans cette étude, le site cible du système CRISPR/Cas9 était situé dans le premier exon. Dans le test de clivage Cas9, la protéine ribonucléo CRISPR / Cas9 a pu digérer le fragment de PCR contenant le site cible avec un taux de clivage d’environ 55%Les résultats du séquençage pour l’estimation du taux de mutation au stade embryonnaire ont suggéré une édition efficace du génome sur le site cible.

L’efficacité de l’édition a entraîné un taux d’éclosion des nymphes de 52,73% et 66,67% des adultes G0 étaient des mutants mosaïques. La stratégie de passage des lignées mutantes est montrée ici. Les œufs homozygotes excédentaires ont été cryoconservés pour améliorer le taux d’utilisation des homozygotes.

Bien que le taux d’éclosion des œufs cryoconservés ait été réduit avec l’allongement du temps de cryoconservation, les mesures correctives telles que l’application de fragments de papier filtre et la récupération de ces œufs conservés avec un gradient de température ascendante ont été utiles pour la réanimation. Le plus important est d’essayer de limiter les dégâts mécaniques causés par la micro-injection. Cette procédure peut être utilisée comme référence pour atteindre d’autres insectes.

Une partie de certains détails tels que les méthodes de collecte des œufs, d’injection et de culture devrait être modifiée. Cette technique peut également être utile pour étudier la métamorphose et l’adaptation environnementale des insectes et la construction de mutants homozygotes acridiens a accéléré les recherches dans ce domaine.