Identification de l’activité hémolytique et phospholipase dans les extraits bruts d’anémones de mer par des essais biologiques simples

L’interaction de la toxine anémone marine doit utiliser le moins d’organismes et des protocoles efficaces pour obtenir une grande diversité et abondance des toxines et une identification rapide d’une toxine spécifique. Nous avons combiné deux techniques efficaces pour préparer l’extrait brut avec une grande quantité de protéines et décrire des tests reproductibles, spécifiques, rapides et peu coûteux pour identifier l’hémolyse et les bases phospholiques dans le venin d’anémone de mer. La méthode peut être utilisée dans presque tous les exemples qui sont décidés pour identifier un ou les deux types de cytolysines.

L’efficacité de la méthode est obtenue en prenant soin des temps à chaque étape lors de la préparation de l’extrait brut. La clé de l’hémolyse est une manipulation prudente de l’érythrocyte pour éviter la lyse mécanique, et dans le test de phospholyse, en prenant soin de la température dans la préparation de la plaque. Le Dr Santos Ramirez-Carreto, la biologiste Sandra Salazar Garcia et le biologiste Giovanni Macias Martinez de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.

Commencez par nettoyer l’anémone de mer A.doi collectée avec de l’eau distillée à la main pour éliminer les grosses particules de substrat adhérant au corps. Congelez immédiatement les organismes à moins 80 degrés Celsius dans un ultrageleur pendant 72 heures. Ensuite, placez les organismes dans des verres spéciaux pour la lyophilisation dans des conditions de lyophilisation pendant 48 heures.

Pour l’hydratation des tissus, reconstituer 20 grammes de poids sec d’organismes lyophilisés avec 60 millilitres de tampon de phosphate de sodium de 50 millimolaires et un comprimé cocktail inhibiteur. Dans un agitateur magnétique, remuer continuellement l’échantillon à environ 800 tr / min et quatre degrés Celsius pendant 12 heures. Après avoir congelé l’échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant 12 heures pour induire la lyse cellulaire et la décharge de nématocystes, placez le récipient dans de l’eau à température ambiante jusqu’à ce qu’il dégèle jusqu’à 90% Répétez cette procédure trois fois.

Pour clarifier l’extrait, centrifuger l’échantillon à 25 400 fois G pendant 40 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant et centrifugez-le à nouveau. Répétez l’étape trois à quatre fois et récupérez enfin le surnageant.

Le surnageant récupéré ou l’extrait brut contient les composants du venin et d’autres molécules cellulaires telles que les lipides, les glucides et les acides nucléiques. Déterminez la concentration en protéines de l’extrait brut à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique commercial Bradford. Incuber les échantillons pendant cinq minutes à température ambiante sans les secouer.

Ensuite, mesurez l’absorbance à 595 nanomètres. Tracer les moyennes des absorbances BSA de l’échantillon et déterminer l’équation du graphique où y est l’absorbance, m est la pente de la ligne, x est la concentration en protéines et b est l’ordonnée à l’origine. Pour analyser l’extrait brut, ajoutez 30 microgrammes de l’extrait brut à cinq microlitres du tampon de charge protéique pour dénaturer les protéines.

Le volume final doit être inférieur à 50 microlitres. Exécutez l’électrophorèse à 25 milliampères constants pendant une heure et 30 minutes. Pour éviter la diffusion des protéines du gel, ajoutez la solution de fixation aux protéines et incubez à température ambiante pendant 40 minutes en agitant à 80 RPM.

Ensuite, décantez la solution et ajoutez la solution de réticulation des protéines. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante en agitant à 80 rpm. Retirez la solution et lavez le gel avec 100 millilitres d’eau distillée pendant cinq minutes.

Après cela, retirez l’eau et répétez cette procédure quatre fois. Effectuer la coloration protéique avec 50 millilitres de solution filtrée Coomassie Brilliant Blue R-250 en remuant à 60 tr / min dans un oscillateur rotatif de laboratoire à température ambiante pendant 15 minutes. Extraire un millilitre de sang de la veine jugulaire d’un mouton et retirer l’aiguille de la seringue.

Drainez immédiatement le sang dans un tube avec 50 millilitres de solution d’Alsever et centrifugez à 804 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et ajoutez 30 millilitres de solution Alsever en le faisant glisser le long des parois internes du tube. Remettez lentement la pastille à l’aide d’une pipette en plastique Pasteur et centrifugez à nouveau la solution à 804 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Répétez cette procédure jusqu’à ce que le surnageant soit clarifié. Maintenir le volume final de la solution d’Alsever pour atteindre une concentration d’environ 2 millions de cellules par millilitre. Ensuite, utilisez une chambre Neubauer ou un hémocytomètre pour compter les cellules.

Incuber les mélanges de solution pendant une heure à 37 degrés Celsius sans agiter, puis centrifuger la plaque à 804 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant dans une autre plaque de 96 puits avec un fond plat. Si l’extrait brut contient des cytolysines, les érythrocytes vont lyser et libérer de l’hémoglobine.

Lisez l’absorbance à 415 nanomètres et calculez la quantité d’extrait qui produit l’hémolyse dans 50% des érythrocytes. Augmentez la quantité d’extrait brut d’anémone de mer et concevez la parcelle avec des ajustements sigmoïdaux à l’aide d’un logiciel approprié. Lavez un œuf de poule avec 1% de FDS dans de l’eau distillée et séparez le jaune d’œuf du blanc d’œuf dans des conditions stériles.

Préparer les solutions A, B, C et D.Ajouter 500 microlitres de solutions A et C à la solution B et 100 microlitres de solution D.Mélangez-les et versez 25 millilitres dans chaque boîte de Pétri. Attendez que la solution se solidifie dans des conditions stériles et faites des puits d’environ deux à trois millimètres de diamètre avec un tube mince. Ajouter un total de 20 microlitres de tampon phosphate comme témoin négatif dans un puits et 20 microlitres d’une phospholipase déterminée comme témoin positif dans un autre puits.

Placez différentes quantités de protéines d’extrait brut 5, 15, 25, 35 et 45 microgrammes dans les puits restants, chacun dans un volume final de 20 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 heures. Les résultats représentatifs du protocole utilisé pour obtenir l’extrait brut d’anémone de mer ont montré que la combinaison de deux techniques, l’agitation et les cycles de congélation et de décongélation, produisait un rejet efficace de nématocystes.

Les nématocytes avant et après les stimuli sont montrés ici. Le tubule de nématocyste est exposé dans cette image, indiquant la libération de toxine. Le profil électrophorétique de l’extrait brut d’anémone de mer est montré ici.

L’extrait brut d’anémone de mer a été analysé par SDS-PAGE 15% gel de polyacrylamide et a montré des protéines de 10 kilodaltons à 250 kilodaltons de poids moléculaire. Ici, la voie 1 est l’échelle des protéines et la voie 2 est le venin d’anémone de mer. Des cytolysines ont été détectées dans la zone de poids moléculaire de 15 kilodaltons et 20 kilodaltons.

On voit ici le test d’hémolyse dans les érythrocytes de moutons. L’activité hémolytique de l’extrait avant et pendant les cycles de congélation et de décongélation a augmenté jusqu’à ce que 100% d’hémolyse soit atteinte avec 50 microgrammes de protéine d’extrait brut total au cours des deux derniers cycles. La quantité nécessaire pour lyser 50% d’érythrocytes de mouton est de 11,1 à 0,3 microgrammes par millilitre.

L’activité de la phospholipase a été détectée par la formation de halos clairs dans les zones de la plaque de gélose où l’échantillon d’extrait brut a été appliqué. Les résultats montrent la présence d’une activité de phospholipase à partir de 15 microgrammes de protéines totales. Le diamètre du halo augmentait en fonction de la dose, c’est-à-dire que si la quantité d’extrait brut augmentait, le diamètre du halo augmentait.

Tout en essayant la procédure, assurez-vous d’induire la décharge de nématocyste, de quantifier la protéine totale, d’analyser l’extrait brut par électrophorèse SDS-PAGE, de calculer la quantité de protéine d’extrait brut pour produire 50% de l’hémolyse et d’utiliser différentes quantités de protéines dans le test de phospholipase. Nous pouvons analyser l’extrait brut par technique protéomique pour identifier les polypeptides d’une grande pertinence en biotechnologie et en biomédecine, même profiler et caractériser une molécule unique et ensuite la produire en laboratoire pour une application. Nous avons obtenu une partie de la séquence d’une protéine performante avec une activité antitumorale dans les cellules épithéliales du carcinome pulmonaire obdurique humain.

De même, nous identifions la séquence des phospholipases d’intérêt biotechnologique.