Imagerie biomoléculaire de l’absorption cellulaire de nanoparticules à l’aide de la microscopie optique multimodale non linéaire

Notre protocole présente une microscopie optique multimodale et non linéaire et l’applique pour effectuer une imagerie chimiquement spécifique des nanoparticules d’or dans les cellules cancéreuses. Le principal avantage de notre système d’imagerie est qu’il peut être utilisé pour examiner le contraste biomoléculaire des structures cellulaires et des nanoparticules d’or de manière multimodale. Pour commencer, allumez les fiches de tous les équipements, à l’exception du boîtier de télécommande.

Ensuite, allumez l’arrière de la boîte et appuyez sur Démarrer l’opération après que le voyant de la télécommande devienne bleu sur le boîtier de commande. Ensuite, allumez le PC du microscope à balayage laser et exécutez le logiciel du microscope confocale. Ensuite, vérifiez le trajet de la lumière du microscope à l’aide du logiciel informatique et contrôlez la mise au point via l’écran tactile ou les boutons de la télécommande ou le logiciel informatique.

Sélectionnez les paramètres d’image souhaités dans le logiciel, y compris le zoom, la taille de l’image en pixels et le temps d’attente des pixels, tout en veillant à ce que le temps d’attente des pixels soit supérieur au temps d’intégration. Placez une gouttelette d’eau distillée sur l’objectif d’immersion dans l’eau qui concentre les faisceaux laser dans l’échantillon et entre le condensateur et l’échantillon pour l’imagerie. Ensuite, réglez la hauteur du condenseur à environ un millimètre au-dessus de l’échantillon pour recueillir le maximum de lumière et déplacez le détecteur SRS placé sur un support mobile hors du trajet du faisceau pour se concentrer sur l’échantillon en utilisant la lumière blanche.

À l’aide des paramètres du logiciel, sélectionnez le faisceau de pompe et modifiez la longueur d’onde du laser à 802 nanomètres pour les vibrations CH et 898 nanomètres pour le pic amide I, en tenant compte des changements importants dans le décalage Raman. Pour obtenir de petits ajustements dans le décalage Raman, scannez l’étape de retard dans l’unité SFTRU comme décrit dans le manuscrit. Pour l’ensemble de données hyperspectrales, sélectionnez l’onglet Déclencheur, cliquez sur Démarrer par déclencheur ttl, puis sélectionnez Déclencher chaque image.

Ensuite, dans l’onglet Séries, définissez la série chronologique activée et la série Z désactivée. En outre, définissez le nombre d’images dans la série chronologique pour qu’il corresponde au nombre d’étapes dans le logiciel ATM. Ensuite, allez dans l’onglet Exécuter du logiciel ATM et réglez les positions d’étage de retard pour CH à 90,25 et 92,25, tandis que pour la région amide I à 89 et 91 en millimètres, correspondant à la position de début et d’arrêt du balayage hyperspectral, tout en vous assurant que le nombre de pas correspond au nombre d’images dans le logiciel informatique.

Après avoir vérifié les paramètres corrects, démarrez la pile hyperspectrale dans le logiciel informatique en allant d’abord dans Acquérir, puis en cliquant sur Démarrer l’analyse. Ensuite, dans le logiciel ATM, cliquez sur Démarrer, ce qui lance la collecte d’une série d’images avec des augmentations incrémentielles de la position de l’étage de retard entre les positions de départ et d’arrêt sélectionnées. Ensuite, prenez une série chronologique d’images à différentes positions d’étape de retard pour générer un balayage hyperspectral.

À l’aide de l’unité analogique, envoyez et recevez des signaux ttl vers et depuis le système SFTRU pour synchroniser l’acquisition d’images et le mouvement de l’étage de retard. Pour passer de l’imagerie dans la région vibratoire CH à la région vibratoire amide I, modifiez la longueur d’onde de la pompe dans le logiciel laser de 802 nanomètres à 898 nanomètres. De plus, modifiez le paramètre de dispersion de Stokes dans le logiciel ATM de 30 millimètres à 5 millimètres.

Ajustez le bouton inférieur du support de miroir pour effectuer un petit réglage du miroir dans la voie de dispersion du faisceau de pompe à l’intérieur du boîtier SFTRU en modifiant l’angle du miroir avec une quantité incrémentielle. Pour valider la sélectivité chimique des microsphères de polystyrène, la diffusion Raman stimulée hyperspectrale et les spectres Raman spontanés ont été enregistrés. Les spectres étaient identiques à l’exception de la différence observée dans l’intensité relative.

L’imagerie par diffusion Raman stimulée des cellules cancéreuses 4T1 a été réalisée à 2, 852, 2, 930 et 2 968 nombres d’ondes, correspondant à la bande vibratoire d’étirement carbone-hydrogène des biomolécules lipidiques, protéiques et ADN. L’imagerie multimodale de cellules cancéreuses 4T1 dosées avec des nanoparticules d’or a été réalisée pour étudier la distribution des nanoparticules dans les cellules cancéreuses. Les images de diffusion Raman stimulées acquises ont été obtenues pour les canaux CH2 et CH3, les sondes fluorescentes LysoTracker et les canaux de diffusion Raman stimulés par résonance.

La chose la plus importante à retenir est de changer la région vibratoire, la référence de la pompe, dans le logiciel laser et aussi le réglage de dispersion de Stokes pendant le protocole. Ce système peut être facilement commuté de la région femtoseconde à la région picoseconde sans affecter l’alignement optique. Cette capacité nous permet d’effectuer la diffusion Raman cohérente multiphotonique et la spectroscopie de sonde de pompe et leurs applications.

Cette plateforme d’imagerie multimodale fournit de nouvelles perspectives sur la nanomédecine et ouvre la voie à l’imagerie moléculaire des cellules, des tissus et des nanoparticules d’or.