Application de l’interférence ARN chez le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus

L’ARNi est devenu une méthode efficace pour identifier la fonction des gènes chez les nématodes et est proposé comme une nouvelle façon de lutter efficacement contre les nématodes pathogènes. L’ARNi trempe les nématodes dans l’ARNds peut suffire pour la procédure. Pour commencer, collectez les nématodes par la méthode de l’entonnoir de Baermann.

Pour cela, placez un tube en caoutchouc serré sous un entonnoir et placez deux couches de papier filtre dans l’embouchure de l’entonnoir. Transférer les cultures fongiques de Botrytis cinerea dans l’entonnoir et ajouter de l’eau pour immerger le tapis fongique. Lorsque les nématodes sont collectés, ajoutez 500 microlitres de réactif d’extraction et 100 microlitres de billes magnétiques à un tube centrifuge de deux millilitres.

Aspirer 20 microlitres de nématodes et broyer les échantillons à 9 000 x g pendant 30 secondes. Incuber pendant cinq minutes et centrifuger à 12 000 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger.

Ajouter 100 microlitres de chloroforme et mélanger en retournant le tube plusieurs fois. Incuber pendant trois minutes, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Encore une fois, transférez le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger.

Ajouter 250 microlitres d’alcool isopropylique et vortex vigoureusement. Centrifuger à 12 000 x g pendant 10 minutes et vortex. Jetez le surnageant et ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 75% pour laver l’ARN.

Vortex l’échantillon suivi d’une centrifugation à 12 000 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Sécher à l’air la pastille d’ARN pendant cinq minutes et la remettre en suspension dans 30 microlitres d’eau sans RNase. Calculez la concentration d’ARN à l’aide de cette formule et calculez le rapport A260 à A280.

Ensuite, utilisez une paire d’amorces pour amplifier la séquence codante partielle du gène BX ppm-1 du B. xylophilus. Clonez ensuite les séquences du gène ppm-1 en un vecteur pGEM-T Easy contenant le promoteur T7. Récupérez le fragment de gène ppm-1 long de la paire de 894 bases en utilisant le plasmide cloné comme modèle pour pcr.

Ensuite, utilisez un kit de transcription in vitro pour synthétiser l’ARNds. Analyser la qualité de l’ARNds à l’aide d’un spectrophotomètre et visualiser les produits sur un gel d’agarose à 1%. Ajouter quatre microlitres de tampon de trempage 5X et compléter le volume à 20 microlitres avec de l’eau distillée double pour obtenir une concentration finale d’ARN de 0,8 microgramme par millilitre.

Ensuite, placez les nématodes dans le plat pendant 30 minutes et attendez que les œufs adhèrent au fond. Retirez soigneusement l’eau et les nématodes sans déranger les œufs jusqu’à ce qu’il ne reste que les œufs dans le plat. Faire éclore les œufs collectés dans l’obscurité à 25 degrés Celsius pendant 24 heures pour obtenir des larves J2.

Rassemblez les larves dans un tube et lavez-les trois fois avec de l’eau distillée double. Ensuite, transférez les larves dans le tube contenant la solution d’ARNds. À cela, ajoutez une solution de résorcinol pour obtenir une solution à 1%.

Placez les larves sur une table à secouer pour assurer une absorption suffisante de l’ARNds dans les larves. Pour les témoins, tremper la même quantité de nématodes dans le tampon de trempage sans la sonde dsRNA ou avec une sonde d’ARNds GFP. Effectuer une qPCR en utilisant les gènes actB et tbb-2 comme références internes pour évaluer les changements dans le niveau d’expression génique.

Utilisez la méthode delta delta Ct pour estimer le niveau relatif d’expression génique à partir de la courbe de dissolution et de la valeur Ct. Après ARNi, cultiver les larves J2 jusqu’à l’âge adulte sur des pelouses de Botrytis cinerea sur des plaques PDA. Recueillir les adultes en utilisant la méthode de l’entonnoir de Baermann, comme indiqué dans la première section.

Obtenez des images des nématodes adultes au microscope et utilisez le logiciel ImageJ pour mesurer la longueur du corps de 50 nématodes mâles et de 50 nématodes femelles. Analysez les données en calculant la moyenne et l’écart-type pour chaque échantillon. Appliquer le test de Student t pour comparer les moyennes des échantillons des différents groupes.

L’analyse de l’expression relative des gènes après ARNi a indiqué que l’ARNds ppm-1 peut inhiber efficacement l’expression du gène ppm-1 one de B.Xylophilus. Alors que l’ARNds exogène GFP n’a eu aucun effet sur l’expression de ppm-1. Après l’ARNi, la taille des adultes a nettement diminué malgré l’atteinte de la maturité sexuelle, ce qui a entraîné le phénotype mutant de petite taille corporelle.

La longueur corporelle moyenne des femelles et des mâles mutants était de 544 et 526 micromètres contre 971 et 912 micromètres pour le groupe témoin Le plus important est de transférer les nématodes dans la solution d’ARN double brin et d’ajouter un autre réactif pour stimuler les nématodes à se nourrir. Cette méthode convient au criblage génétique à grande échelle et est couramment utilisée dans la recherche cellulaire. L’étude de la fonction génique de B.Xylophilus par cette méthode a une valeur directrice pour la lutte biologique contre B.Xylophilus.