Évaluation de la probabilité ouverte du pore de transition de perméabilité mitochondriale dans le cadre de l’excès de coenzyme Q

Ce protocole fournit une nouvelle façon d’étudier l’ouverture à faible conductance du pore de transition de perméabilité mitochondriale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un moyen facile de mesurer la probabilité d’ouverture du pore en fonction du potentiel de la membrane mitochondriale. Cette technique peut être facilement appliquée aux mitochondries isolées de n’importe quel système d’organe et espèce.

Commencez par l’étalonnage de l’électrode d’oxygène en plaçant une goutte de solution d’électrolyte de chlorure de potassium à 50% sur le dôme du disque de l’électrode. Placez un petit morceau d’espaceur de papier à cigarette de deux centimètres carrés recouvert d’un morceau légèrement plus grand de membrane de polytétrafluoroéthylène sur la goutte d’électrolyte. Utilisez ensuite l’outil applicateur pour pousser le petit joint torique du disque d’électrode sur le dôme de l’électrode.

Ensuite, remplissez bien le réservoir avec la solution d’électrolyte. Placez le joint torique plus grand dans le renfoncement autour du disque d’électrode. Installez ensuite le disque dans la chambre à électrodes et connectez-le à l’unité de commande.

Ajouter deux millilitres d’eau désionisée saturée à l’air et l’aimant revêtu de polytétrafluoroéthylène à la chambre de réaction. Lorsque vous avez terminé, connectez la chambre à l’arrière de l’unité de commande. Réglez la température à 37 degrés Celsius et la vitesse d’agitation à 100.

Laissez la température du système s’équilibrer pendant 10 minutes avant l’étalonnage. Après avoir vérifié la température, la vitesse d’agitation et la pression correctes, sous l’onglet Calibration, sélectionnez l’option Calibration de phase liquide pour effectuer l’étalonnage de phase liquide. Appuyez ensuite sur OK et attendez que le signal plafonne.

Une fois le plateau atteint, appuyez sur OK. Ajoutez ensuite environ 20 milligrammes de dithionite de sodium pour établir zéro oxygène dans la chambre. Encore une fois, appuyez sur OK et attendez que le signal plafonne avant de cliquer sur le bouton Enregistrer pour accepter l’étalonnage. Pour préparer l’ensemble d’électrodes sélectives de tétraphénylphosphonium, remplissez l’embout de l’électrode sélective de TPP avec une solution de TPP de 10 millimolaires à l’aide d’une seringue et d’une aiguille flexible.

Évitez les bulles d’air pendant le remplissage de la pointe de l’électrode. Desserrez le capuchon du porte-électrode pour insérer l’électrode de référence interne dans la pointe TPP. Lorsque vous avez terminé, assemblez l’appareil à électrodes sélectives TPP, y compris l’électrode de référence et le porte-électrode.

Serrez le capuchon pour fixer la pointe. Connectez ensuite le câble au port auxiliaire du boîtier de commande et au porte-électrode TPP. Insérez les électrodes sélectives TPP et de référence dans l’ensemble piston adapté pour électrodes sélectives d’ions.

Connectez l’électrode de référence à l’orifice de référence du boîtier de commande. Ensuite, pour préparer la chambre de réaction, ajoutez un millilitre du mélange réactionnel à la chambre de réaction sans créer de bulles d’air. Fermez la chambre à l’aide de l’ensemble piston adapté avec les électrodes sélectives TPP et de référence en place.

Une fois la chambre fermée, introduisez des réactifs supplémentaires directement dans la chambre de réaction à l’aide de micro-seringues séparées modifiées avec des tubes en plastique. Lorsque la configuration est prête, sélectionnez Aller pour démarrer l’enregistrement. Une fois qu’un signal de tension stable est obtenu, calibrez l’électrode sélective TPP en ajoutant un incrément micromolaire d’une solution TPP de 0,1 millimolaire pour obtenir une concentration finale de trois micromolaires.

Observez la baisse logarithmique du signal de tension TPP à chaque ajout. Après avoir stabilisé les traces d’oxygène et de TPP, ajouter 100 microgrammes de mitochondries cardiomyocytaires fraîchement préparées à la chambre de réaction via le port d’addition de réactif dans l’ensemble du piston à une concentration finale de 0,1 milligramme par millilitre. Observez la diminution des niveaux d’oxygène dans la chambre à mesure que les mitochondries s’énergisent et consomment de l’oxygène.

Voyez également l’augmentation abrupte du signal de tension TPP car les mitochondries génèrent un potentiel membranaire et absorbent le TPP de la solution. Ajoutez ensuite 2,5 microgrammes par millilitre d’oligomycine pour induire une respiration d’état 4. Pour évaluer la probabilité ouverte du pore de transition de perméabilité mitochondriale, ou mPTP, observez la diminution du potentiel membranaire au fil du temps pendant la respiration des fuites.

Une fois que le potentiel membranaire souhaité est atteint, ajoutez une cyclosporine A micromolaire comme inhibiteur de mPTP à la chambre de réaction pour évaluer la probabilité ouverte du mPTP à ce potentiel mmicrométrique spécifique. Mesurez ensuite l’effet de la cyclosporine A sur la consommation d’oxygène et le potentiel membranaire avant et après l’ajout de cyclosporine A. Dans les courbes représentatives de la consommation simultanée d’oxygène et du potentiel membranaire, le potentiel membranaire élevé a été fixé à zéro, intermédiaire à cinq et faible à 10 millivolts par rapport au niveau d’étalonnage TPP à deux micromolaires.

Les mitochondries à zéro millivolts présentaient une probabilité fermée de 100% mPTP et à 10 millivolts une probabilité d’ouverture de 100%. Après l’ajout d’oligomycine, aucune différence significative dans la consommation d’oxygène n’a été observée, ce qui suggère que l’adénosine triphosphate, ou ATP synthase, contribue de manière minimale à la respiration de l’état 2. De plus, le taux de consommation d’oxygène et le potentiel membranaire avant et après l’ajout de cyclosporine A ont été comparés.

Une diminution du taux de consommation d’oxygène et une augmentation de la stabilisation du potentiel membranaire ont indiqué la fermeture d’un mPTP ouvert. Lorsque le mPTP est fermé, il n’y a pas eu de diminution du taux de consommation d’oxygène et le potentiel membranaire a continué de baisser. Les résultats ont démontré des probabilités similaires de mPTP fermées et ouvertes à des potentiels membranaires élevés et faibles dans le contrôle FVB et les mitochondries cardiaques Knockout Fmr1.

Au potentiel membranaire intermédiaire, les mitochondries cardiaques knock-out Fmr1 ont démontré une probabilité accrue de mPTP fermée par rapport aux témoins FVB. Aucune bulle d’air ne doit être introduite dans la chambre, car cela entraînera des lectures instables de la consommation d’oxygène et rendra l’interprétation difficile. En suivant cette procédure, la capacité de charge en calcium peut être mesurée.

Cette méthode évalue l’ouverture à haute conductance du pore et complète les résultats de notre technique.