Name: Implantation de cardiomyocytes induite par ultrasons dérivée de cellules souches pluripotentes chez des souris infarctus du myocarde (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Découvrez une méthode d'injection intramyocardique percutanée guidée par échocardiographie pour délivrer des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites chez des souris infarctus du myocarde. Cette technique offre une approche moins invasive et efficace pour la thérapie cellulaire cardiaque.

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Ce travail a été soutenu par le Plan de recherche majeur de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 91539111à JY), le projet clé de la science et de la technologie de la province du Hunan (n ° 2020SK53420 à JY) et le programme d’innovation scientifique et technologique de la province du Hunan (2021RC2106 à CF).

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<li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+revisited%3A+inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes critiques de cette étude comprennent la culture hiPSC, la différenciation des cardiomyocytes , la purification de l’hiPSC-CM et la transplantation d’hiPSC-CM dans le site d’infarctus du myocarde de la souris. La clé est d’utiliser l’échographie cardiaque pour guider le traitement par voie transcutanée vers le site de l’infarctus au bord de l’infarctus où des HIPSC-CM ont été injectés dans la région.
Avec la prolongation du temps de culture, le phénotype hiPSC-CM change de morphologi...

Lorsque l’IM aigu se produit, les cellules myocardiques de la région infarctue meurent rapidement en raison de l’ischémie et de l’hypoxie. Plusieurs facteurs inflammatoires sont libérés après la mort et la rupture des cellules, tandis que les cellules inflammatoires infiltrent le site infarctus pour provoquer une inflammation1. De manière significative, les fibroblastes et le collagène, tous deux sans contractilité et conductivité électrique, remplacent les cellules myocardiques dans le site infarctus pour former du tissu cicatriciel. En raison de la capacité de régénération limitée des cardiomyocytes chez les mammifères adultes, les tissus viables formés après une grande zone d’infarctus ne sont généralement pas suffisants pour maintenir un débit cardiaque suffisant2. L’IM provoque une insuffisance cardiaque et, dans les cas graves d’insuffisance cardiaque, les patients ne peuvent compter que sur des transplantations cardiaques ou des dispositifs d’assistance ventriculaire pour maintenir des fonctions cardiaques normales 3,4.
Après l’IM, la stratégie de traitement idéale consiste à remplacer les cardiomyocytes morts par des cardiomyocytes nouvellement formés, formant un couplage électromécanique avec des tissus sains. Cependant, les options de traitement ont généralement adopté la récupération du myocarde plutôt que le remplacement. Actuellement, les thérapies à base de cellules souches et de cellules progénitrices sont parmi les stratégies les plus prometteuses pour promouvoir la réparation myocardique après l’IM5. Cependant, la transplantation de ces cellules présente plusieurs problèmes, principalement l’incapacité des cellules souches adultes à se différencier en cardiomyocytes et leur courte durée de vie6.
Les questions éthiques liées à l’utilisation de cellules souches embryonnaires (SE) peuvent être contournées par les CSPi, qui sont une source prometteuse de cellules. De plus, les CSPi possèdent de fortes capacités d’auto-renouvellement et peuvent se différencier en cardiomyocytes7. Des études ont montré que les CM-HiPSC transplantés dans le site MI peuvent survivre et former des jonctions lacunaires avec les cellules hôtes 8,9. Cependant, comme ces cellules transplantées sont situées dans le microenvironnement de l’ischémie et de l’inflammation, leur taux de survie est extrêmement faible10,11.
Plusieurs méthodes ont été mises au point pour améliorer le taux de survie des cellules transplantées, telles que le prétraitement par hypoxie et choc thermique des cellules transplantées12,13, la modification génétique 14,15 et la transplantation simultanée de cellules et de capillaires 16. Malheureusement, la plupart des méthodes sont limitées par la complexité et le coût élevé. Par conséquent, la présente étude propose une méthode d’administration reproductible, pratique, relativement invasive et efficace de hiPSC-CM.
L’injection intramyocardique guidée par ultrasons peut être réalisée uniquement avec un petit appareil à ultrasons vétérinaire haute résolution et un micro-injecteur, quel que soit le site. Sous guidage échographique, l’administration directe de cellules sous le processus xiphoïde du péricarde dans le myocarde chez la souris est un protocole sûr qui évite les dommages au foie et aux poumons. Cette méthode peut être combinée simultanément avec d’autres technologies pour améliorer considérablement le taux de survie des cellules transplantées.

<table><tbody><tr><td><fort>Anticorps</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Troponine cardiaque T</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td></td></tr><tr><td>Âne Anti-Souris IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>Âne Anti-Souris IgG H& L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150110</td><td></td></tr><tr><td>Âne Anti-Lapin IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td></td></tr><tr><td>Âne Anti-Lapin IgG H& L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150062</td><td></td></tr><tr><td>Troponine cardiaque humaine T</td><td>Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>Isolectine B4</td><td>Vecteur</td><td>FL-1201</td><td></td></tr><tr><td>Alpha actinine sarcomérique</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Agglutinine de germe de blé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supplément B27 Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr>(<tr><td>moins insuline)</td><td>Supplément</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Thermo Fisher Scientific(sans sérum)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17&ndash ; 504-044</td><td></td></tr><tr><td>La solution de Bouin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SDHT10132</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>cyclosporin A</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-B0579</td><td></td></tr><tr><td>DIRECT RED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>365548-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de mouchoirs</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>FAST GREEN FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp ; F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sans glucose RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Selleck</td><td>S7086</td><td></td></tr> acide <tr><td>lactique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6661</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356234</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR Green Kit MasterMix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>agent de couplage à ultrasons</td><td>CARENT</td><td>22396269389</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S6390<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment and Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7500 Cryostat PCR</td><td></td>en temps réel</tr> Microscope à fluorescence <tr><td></td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux anatomiques fins</td><td></td> Olympus IX83 <td></td> Outils scientifiques fins 15000-08 <td></td></tr><tr><td>Pince à dissection fine</td><td>Outils scientifiques</td><td>fins 11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Micro seringue</td><td>Hamilton</td><td>7633</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Petit animal <td></td></tr><tr><td> appareil d’anesthésie</td><td>MATRX</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie par ultrasons à ultrasons à ultra-haute résolution pour petits animaux</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statistical Product and Service Solutions</td><td>IBM</td><td>21</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>1.48</td><td></td></tr><tr><td>Human mitochondrial amorces d’ADN</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>la séquence d’amorce directe</td><td>CCGCTACCATAATCATCGCTAT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>la séquence d’amorce inverse</td><td>TGCTAATACAATGCCAGTCAGG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

implantation de cardiomyocytes induite par ultrasons dérivée de cellules souches pluripotentes chez des souris infarctus du myocarde

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

L’objectif principal de la thérapie cellulaire après un infarctus du myocarde (IM) est d’améliorer efficacement le taux de greffe cellulaire, et les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont une source cellulaire prometteuse pour la réparation cardiaque après une lésion ischémique. Cependant, un faible taux de greffe est un obstacle important à une régénération efficace du tissu cardiaque après la transplantation. Ce protocole montre que les injections percutanées multiples guidées par ultrasons hiPSC-CM dans une zone d’IM augmentent efficacement les taux de transplantation cellulaire. L’étude décrit également l’ensemble du processus de culture hiPSC-CM, le prétraitement et les méthodes d’administration percutanée guidées par ultrasons. En outre, l’utilisation de l’ADN mitochondrial humain aide à détecter l’absence de hiPSC-CMs dans d’autres organes de souris. Enfin, cet article décrit les changements dans la fonction cardiaque, l’angiogenèse, la taille des cellules et l’apoptose dans la zone frontalière infarctus chez la souris 4 semaines après l’accouchement cellulaire. On peut conclure que l’injection percutanée guidée par échocardiographie du myocarde ventriculaire gauche est une thérapie cellulaire réalisable, relativement invasive, satisfaisante, reproductible et efficace.

L’échocardiographie pour l’évaluation de la fonction ventriculaire gauche des souris de chaque groupe a révélé que les lésions de l’IM étaient effectivement inversées dans le groupe DM (Figure 2A). Par rapport au groupe IM, le groupe SD a montré une augmentation de la fraction d’éjection (FE) (de 30 % à 35 %; Figure 2B) et le raccourcissement des fractions (FS) (de 18 % à 22 %; Figure 2C) après MI. Cependant, il est encore plus cruc...

L’administration de cellules guidée par ultrasons autour du site de l’infarctus du myocarde chez la souris est un moyen sûr, efficace et pratique de transplantation cellulaire.

Implantation de cardiomyocytes induite par ultrasons dérivée de cellules souches pluripotentes chez des souris infarctus du myocarde

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Il s’agit du premier rapport démontrant que l’injection intramyocardique percutanée de cardiomyocytes guidée par échocardiographie améliore significativement la propriété réparatrice des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPS. Cette méthode est une procédure réalisable, satisfaisante, reproductible, moins invasive et efficace pour administrer un traitement des cardiomyocytes dérivés des iPS humaines. Nous croyons que l’administration intramyocardique percutanée est une méthode sûre et efficace pour l’administration locale de médicaments pour des maladies telles que les cardiopathies ischémiques, l’infarctus du myocarde et l’insuffisance cardiaque.Ce projet est supervisé par le professeur Jinfu Yang et le professeur Jun Peng. Xun Wu, Kele Qin et Kun Xiang, MD PhDs de mon laboratoire et Di Wang, un PhD du Laboratoire provincial de recherche cardiovasculaire du Hunan. Pour commencer, aspirez le surnageant de culture à partir d’une culture de 60 jours de hiPSC-CM.Lavez les cellules avec PBS trois fois. Ensuite, dissocier les hiPSC-CM en cellules individuelles en utilisant le mélange d’enzymes de détachement cellulaire à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Recueillir les cellules dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu RPMI plus B27 et mélanger.Comptez les cellules et calculez le nombre total de cellules. Centrifuger la suspension cellulaire à 300G pendant deux minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans le milieu de support des cardiomyocytes à une concentration de 6 x 10 des 4e cellules par microlitre.Placez le tube à 37 degrés Celsius jusqu’à l’étape d’injection. Une fois que la souris est suffisamment anesthésiée, fixez les membres et la queue avec du ruban adhésif. Ensuite, fixez les incisives de la souris avec un fil de soie 2/0 et du ruban adhésif.Stérilisez le cou médian et la poitrine gauche avec trois cycles alternés de bétaïne suivis d’alcool. Faites une incision médiane du cou à l’aide de fins ciseaux anatomiques et de pinces à dissection fine. Coupez quelques muscles cervicaux antérieurs pour stabiliser et exposer complètement la trachée.Insérez une aiguille de ponction de cathéter de calibre 20 comme tube trachéal dans la bouche. Connectez le tube trachéal au ventilateur et vérifiez les mouvements thoraciques pour vous assurer que les deux poumons sont bien ventilés. Ajustez les paramètres respiratoires.Ensuite, refixez le membre postérieur gauche sur le côté inférieur droit et desserrez le ruban autour du membre supérieur gauche. Avec des ciseaux et des pinces à dissection fine, effectuez une thoracotomie à l’espace intercostal de trois à quatre du thorax gauche. À l’aide d’une pince, décollez le péricarde et localisez l’artère coronaire descendante antérieure gauche.Utilisez un fil de soie 6/0 pour ligaturer l’extrémité proximale de l’artère. Pour s’assurer que le modèle d’infarctus aigu du myocarde est établi, attendez que le côté distal de l’artère au site de ligature passe du rouge au blanc. Fermez la poitrine couche par couche et suturez la peau avec un fil 4/0.Pour le groupe d’animaux fictifs, effectuez toutes les interventions chirurgicales à l’exception de la ligature. Au cours des deux premières semaines suivant l’infarctus du myocarde, placez les souris dans une boîte d’anesthésie reliée à 5% d’isofluorane et effectuez une intubation trachéale. Trois jours avant d’administrer des CM-HIPSC, injecter de la cyclosporine A dans la cavité intrapéritonéale à une dose de 10 milligrammes par kilogramme et par jour.Enlevez les poils de la poitrine et du haut de l’abdomen de la souris avec une crème dépilatoire. Fournir de l’isofluorane par inhalation jusqu’à ce que la fréquence cardiaque soit maintenue à 400 à 500 battements par minute. Fixez les membres et la queue de la souris avec du ruban adhésif sur la console de détection et réglez la température de la plate-forme à 37 degrés Celsius.Appliquez la gelée à ultrasons sur le haut de l’abdomen. À l’aide d’une sonde à ultrasons vétérinaires à haute résolution, obtenir des images du foie de souris. À l’aide d’une micro-seringue de cinq microlitres, prélever environ 3 x 10 sur le 5e hiPSC-CM.Tenez la seringue et insérez une aiguille de trois millimètres au processus paraxiphoïde gauche. Sous guidage échographique, suivez le bord supérieur du diaphragme. Observez le rythme respiratoire et la portée.Entrez dans le péricarde à la fin du cercle expiratoire, en évitant d’endommager le foie et les poumons. Acquérir ensuite l’image parasternale à axe long du cœur de souris par échocardiographie en mode B. Sous guidage ultrasonique, injecter 1 x 10 à la 5ème cellule hiPSC-CMs dans chacune des trois zones marginales du site de l’infarctus.Retirez la sonde à ultrasons et rincez la gelée. Sevrez la souris de l’anesthésie et remettez-la dans sa cage. Injecter la cyclosporine A en continu pendant un mois après la transplantation.L’échocardiogramme du ventricule gauche a montré que les blessures dues à l’infarctus du myocarde étaient inversées dans le groupe à doses multiples. La transplantation de hiPSC-CM a également entraîné une augmentation de la fraction d’éjection et du raccourcissement de la fraction. La mesure des paramètres cardiaques à l’aide de la coloration rouge Sirius et verte rapide a montré que la taille de l’infarctus et la fraction volumique du collagène diminuaient, tandis que l’épaisseur de la paroi antérieure ventriculaire gauche augmentait après la transplantation.L’étiquetage de l’actine alpha non spécifique en vert, du DAPI en bleu et de la troponine T spécifique à l’homme en rouge a montré la présence de cellules transplantées dans l’infarctus et la zone marginale de l’infarctus. Le nombre et le pourcentage de cellules transplantées étaient plus élevés dans le groupe à doses multiples que dans le groupe à dose unique. 28 jours après l’infarctus du myocarde, le groupe à doses multiples a montré une augmentation du nombre de cellules exprimant le marqueur des cellules endothéliales, I-B4.L’agglutinine de germe de blé et la coloration à l’alpha-actinine sarcomérique sur les cardiomyocytes ont montré une réduction du diamètre minimum des fibres. Un nombre plus faible de noyaux de cardiomyocytes à tunnel positif dans le groupe à doses multiples indiquait une réduction de l’apoptose. L’analyse PCR a détecté l’ADN mitochondrial humain uniquement dans le cœur, montrant une transplantation spécifique.Lors de l’insertion de l’aiguille, assurez-vous qu’elle pénètre dans la cavité péricardique avec la marge supérieure du diaphragme et à la fin du cercle expiratoire pour éviter les blessures au foie ou aux poumons.

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Implantation de cardiomyocytes induite par ultrasons dérivée de cellules souches pluripotentes chez des souris infarctus du myocarde (Vidéo) | JoVE Journal

Implantation de cardiomyocytes induite par ultrasons dérivée de cellules souches pluripotentes chez des souris infarctus du myocarde

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