Name: Cultures cellulaires primaires pour étudier le potentiel de régénération de murin Müller Glia après un traitement par microARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Apprenez à cultiver des cellules de Müller murines pour étudier leur conversion en progéniteurs rétiniens par traitement microARN. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des candidats avant applications in vivo.

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Les auteurs remercient la Dre Ann Beaton et tous les membres du laboratoire pour leur contribution au manuscrit. Nous remercions tout particulièrement les Drs Tom Reh, Julia Pollak et Russ Taylor d’avoir présenté les cultures primaires MG comme outil de dépistage à S.G.W. lors d’une formation postdoctorale à l’Université de Washington à Seattle. L’étude a été financée par la subvention empire innovation program (EIP) à S.G.W. et des fonds de démarrage de SUNY Optometry à S.G.W., ainsi que par le prix R01EY032532 du National Eye Institute (NEI) à S.G.W.

Un brevet incluant certaines des conclusions de ce rapport a été déposé par l’Université de Washington auprès des inventeurs Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl et Thomas A. Reh. Le brevet s’intitule « Méthodes et compositions pour stimuler la régénération rétinienne.

Ce protocole décrit comment cultiver la MG à partir de rétines de souris dissociées pour des études de reprogrammation à l’aide de miARN. Comme l’ont montré et confirmé diverses études antérieures, la grande majorité (80% à 90%) des cellules trouvées dans ces cultures sont MG 20,23,24. Cette méthode est une technique très robuste et fiable et les résultats peuvent être facilement reproduits si le protocole est suivi correctement...

La glie de Müller (MG) est la glie prédominante dans la rétine neurale. Ils ont des fonctions similaires à celles d’autres glies dans d’autres parties du système nerveux central, telles que le maintien de l’homéostasie de l’eau et des ions, la nutrition des neurones et la protection des tissus. Les MG ont une autre caractéristique fascinante : bien qu’ils soient des glie matures, ils expriment encore de nombreux gènes exprimés dans les cellules progénitrices rétiniennes (RPC) à la fin du développement 1,2. Cette ressemblance est supposée être la raison de la régénération neuronale naturelle à base de MG dans la rétine du poisson après une lésion rétinienne 3,4. Au cours de ce processus, MG rentre dans le cycle cellulaire et se différencie en RPC qui se différencient ensuite en six types de neurones rétiniens. Bien que ce phénomène se produise naturellement chez les poissons, les MG de mammifères ne se convertissent pas en neurones 5,6. Ils peuvent toutefois être reprogrammés. Il a été démontré qu’une variété de facteurs reprogramment mg en RPC / neurones; parmi ces facteurs figure le facteur de transcription de base hélice-boucle-hélice (bHLH) homologue achaete-scute 1 (Ascl1) qui est impliqué dans la régénération des poissons 7,8. Chez la souris, Ascl1 n’est exprimé que dans les RPC pendant la rétinogenèse mais est absent dans les neurones MG matures ou rétiniens9.
La reprogrammation des cellules directement in vivo est non seulement difficile sur le plan méthodologique, mais nécessite également l’approbation d’un comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Pour recevoir l’approbation, des données préliminaires sur le ou les facteurs utilisés ou modifiés, les concentrations, les effets hors cible, les mécanismes sous-jacents, la toxicité et l’efficacité sont requises. Les systèmes de culture cellulaire permettent de tester ces critères avant utilisation dans des modèles in vivo. De plus, comme les MG ne représentent qu’environ 5% de l’ensemble de la population de cellules rétiniennes10, les cultures MG permettent d’étudier leur fonction11 ainsi que leur comportement, y compris la migration 12,13, la prolifération14, la réaction au stress aux blessures / dommages15,16, leur interaction avec d’autres types de cellules telles que la microglie17 ou les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR)18, ou leur potentiel neurogène 19,20,21. De nombreux chercheurs utilisent des lignées cellulaires immortalisées pour leurs études car elles ont un potentiel prolifératif illimité et peuvent être facilement maintenues et transfectées. Les cellules primaires, cependant, sont préférables pour les essais biologiquement pertinents que les cellules immortalisées car elles ont de vraies caractéristiques cellulaires (expression des gènes et des protéines) et, plus important encore, elles représentent un certain stade de développement et ont donc un « âge ». L’âge d’un animal (et par conséquent des cellules obtenues à partir d’un animal) est un facteur particulièrement crucial dans la reprogrammation cellulaire puisque la plasticité cellulaire diminue avec le stade de développement avancé22.
Ce protocole décrit en détail comment reprogrammer la MG primaire avec des miARN comme méthode in vitro actuelle pour étudier la régénération. Ce modèle de culture primaire MG a été établi en 2012 pour évaluer les caractéristiques de prolifération cellulaire de MG chez les souris knock-out P53 (souris trp53-/-)23. Il a été démontré que les MG cultivés conservent leurs caractéristiques gliales (c’est-à-dire l’expression des protéines S100β, Pax6 et Sox2 évaluées par marquage immunofluorescent), et qu’ils ressemblent à des MG in vivo (microréseau de MG purifié par FACS)23. Peu de temps après, l’expression de l’ARNm glial et des protéines a été validée et confirmée dans une approche différente utilisant des vecteurs viraux20. Quelques années plus tard, il a été confirmé que la grande majorité des cellules trouvées dans ces cultures sont MG en utilisant la souris rapporteur Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl spécifique à MG 24. De plus, la quantification de l’ensemble des miARN dans le MG purifié par FACS et le MG primaire cultivé a montré que les niveaux de mg miARN (mGLiomiRs) ne varient pas beaucoup dans le MG cultivé pendant la phase de croissance. Les périodes de culture allongées, cependant, provoquent des changements dans les niveaux de miARN et, par conséquent, dans les niveaux d’ARNm et l’expression des protéines, car les miARN sont des régulateurs translationnels25.
En 2013, ce modèle de culture MG a été utilisé pour tester une variété de facteurs de transcription en ce qui concerne leur capacité à reprogrammer MG dans les neurones rétiniens20. Ascl1 s’est avéré être un facteur de reprogrammation très robuste et fiable. La surexpression d’Ascl1 via des vecteurs viraux a induit des changements morphologiques, l’expression de marqueurs neuronaux et l’acquisition de propriétés électrophysiologiques neuronales. Plus important encore, les connaissances et les résultats obtenus à partir de ces premières expériences in vitro ont été transférés avec succès à des applications in vivo 22,26, démontrant que les cultures MG primaires représentent un outil solide et fiable pour les criblages factoriels initiaux et l’évaluation des caractéristiques gliales avant la mise en œuvre in vivo.
Il y a quelques années, il a été démontré que le miARN miR-124 enrichi par le cerveau, qui est également fortement exprimé dans les neurones rétiniens, peut induire l’expression d’Ascl1 dans MG21 cultivé. L’expression d’Ascl1 dans les cellules vivantes a été visualisée via une souris rapporteure Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Une souris rapporteure est une souris génétiquement modifiée qui a un gène rapporteur inséré dans son ADN. Ce gène rapporteur code pour une protéine rapporteure, qui est dans cette étude tdTomato, une protéine fluorescente rouge. Cette protéine rapporteure rapporte l’expression d’un gène d’intérêt, en l’occurrence Ascl1. En d’autres termes, les cellules qui expriment Ascl1 deviendront rouges. Étant donné qu’Ascl1 n’est exprimé que dans les RPC9, cette souris Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl permet de suivre la conversion DE MG en RPC exprimant Ascl1 , ce qui signifie que la conversion des cellules exprimera la protéine rapporteure tdTomato fluorescente rouge. Il s’agit d’un marquage irréversible puisque l’ADN de ces cellules est altéré. Par conséquent, toute différenciation neuronale ultérieure sera visualisée car l’étiquette tdTomato reste dans les cellules différenciantes. Si Ascl1 exprimant des RPC dérivés de MG (avec étiquette tdTomato) se différencient en neurones, ces neurones auront toujours leur étiquette rouge. Cette souris permet donc non seulement l’étiquetage des RPC dérivés de MG pour l’imagerie de cellules vivantes, mais permet également la cartographie du destin et le traçage de la lignée de ces RPC dérivés de MG (rouges). Plus récemment, l’ensemble des miARN dans les RPC a été identifié et des cultures MG de souris Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter ont été utilisées pour dépister et tester l’effet de ces miARN sur la capacité et l’efficacité de reprogrammation27. Un candidat, le RPC-miRNA miR-25, s’est avéré capable de reprogrammer la MG cultivée dans des cellules exprimant Ascl1 (Ascl1-Tomato+). Ces cellules reprogrammées adoptent des caractéristiques neuronales au fil du temps, y compris la morphologie neuronale (petits somata et processus fins courts ou longs), l’expression des transcriptions neuronales mesurées via scRNA-Seq, ainsi que l’expression de protéines neuronales validées par marquage immunofluorescent27.
Ici, le protocole détaille comment cultiver et transfecter MG à partir de souris P12 adaptées des travauxprécédents 21,24,27. Choisi pour ce protocole est le miARN miR-25 susmentionné, un miARN fortement exprimé dans les RPC, avec de faibles niveaux d’expression dans les neurones MG ou rétiniens. Afin de surexprimer miR-25, des mimiques murines miR-25, c’est-à-dire des molécules artificielles de miARN sont utilisées. Comme contrôle, on choisit des imitations d’un miARN de Caenorhabditis elegans, qui n’ont aucune fonction dans les cellules de mammifères. La visualisation de la conversion de MG en RPC a été réalisée via la souris rapporteur RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), une souris avec un fond mixte (souches C57BL/6, S129 et ICR). Cette culture peut toutefois être réalisée avec toutes les souches de souris, y compris les souches de type sauvage. Au cours des dernières années, le protocole original a été modifié pour réduire la durée de la phase de croissance et la période de culture globale et assurer un statut de cellule gliale plus robuste et minimiser le degré de dégénérescence cellulaire, qui se produit pendant les périodes de culture prolongées. La fenêtre de temps de transfection régulière a également été prolongée de 3 h à 2 jours. Comme mentionné précédemment, bien que le protocole actuel décrive les cultures MG comme un outil pour les études de régénération, la méthode est non seulement utile pour tester les facteurs de reprogrammation, mais peut également être adaptée à d’autres applications, y compris des études sur le comportement migratoire ou prolifératif MG, les paradigmes liés aux blessures / dommages cellulaires, et / ou l’identification des mécanismes et des voies sous-jacents.

<table><tbody><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascl1-CreERT souris Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td><td>Jax laboratories</td><td>#012882</td> souris <td>Ascl1-CreERT ont été croisées avec des souris tdTomato</td></tr><tr><td>tdTomato-STOPfl/fl souris&nbsp ; N° B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>Jax laboratories</td><td>#007914</td><td>Le génotypage est nécessaire pour identifier les souris Ascl1CreER positives</td></tr><tr><td><fortes>réactifs</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-Hydroxytamoxifène, &ge ; Isomère Z à 98 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td>reconstitué dans de l’éthanol, aliquotes congelées</td></tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde (PFA) Solution aqueuse</td><td>VWR</td><td>100504-782</td><td>2 % PFA à base de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), aliquotes congelées</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-546-152</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment d’âne Anti-chèvre IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>705-606-147</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Otx2 humain, R& D Systems</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF1979</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942-200UL</td><td>dilution 1:250</td></tr><tr><td>Anticorps anti-protéine fluorescente rouge (RFP)</td><td>Anticorps en ligne</td><td>ABIN334653</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72132</td><td>reconstitué dans PBS, aliquotes congelées</td></tr><tr><td>B-27 Supplément</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td>aliquotes congelées</td></tr><tr><td>Brain Phys Neuronal</td><td>Medium STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>utilisé comme milieu neuronal dans la section 1.2, stocker à 4 &deg ; C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td>reconstituer suivant le manuel, 4&deg ; C</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73886</td><td>reconstitué dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO), aliquotes congelées</td>du</tr><tr><td>sulfoxyde de diméthyle (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td>aliquotes congelées</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp ; Opti-MEM Sérum Réduit Medium, Supplément GlutaMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>51-985-034</td><td>stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp ; TrypLE Express Enzyme (1X), rouge de phénol</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-028</td><td>utilisé comme solution contenant de la trypsine, conserver à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-025-134</td><td>magasin au 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Protéine de souris laminine, naturelle</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-017-015</td><td> aliquotes congelées, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.164323 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) </td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>aliquotes congelées</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td><td>Horizon</td><td>CN-001000-01-50</td><td>reconstituées dans de l’eau libre de RNase (200 &micro ; M), aliquotes</td></tr><tr><td>congelées miRIDIAN microARN Souris mmu-miR-25-3p mimique</td><td>Horizon</td><td>C-310564-05-0050</td><td>reconstitué dans de l’eau libre de RNase (200 &micro ; M), aliquotes congelées</td></tr><tr><td>N-2 Supplément</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-502-048</td><td>aliquotes congelées</td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-103-049</td><td>utilisées pour le milieu de croissance à la section 1.1, conserver à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Système de dissociation de la papaïne</td><td>Worthington LK003153 biochimique</td><td></td><td>reconstitué dans une solution saline équilibrée d’Earle, aliquotes congelées</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td>Aliquotes congelées</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>Bromhydrate de poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4538-50MG</td><td>reconstitué dans de l’eau stérilisée, aliquotes congelées Recombinant</td></tr><tr><td>Human BDNF Protein</td><td>R& D Systems</td><td>248-BDB-050/CF</td><td>reconstitué dans du PBS et du FBS stérilisés, aliquotes congelées</td></tr><tr><td>Souris recombinante Protéine EGF</td><td>Fisher Scientific</td><td>2028EG200</td><td>reconstituée dans du PBS stérilisé, aliquotes congelées</td></tr><tr><td>Rat recombinant Protéine GDNF Fisher</td><td>Scientific</td><td>512GF010</td><td>reconstituée dans du PBS stérilisé, aliquotes congelées</td></tr><tr><td>Rhodamine Rouge 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment d’âne anti-rat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-296-150</td><td>Dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>Medium de montage de lames</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection (Lipofectamine 3000)</td><td>Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>magasin à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>plasticware/supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tube à microcentrifuger de 0,6 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro ; L POURBOIRE&nbsp ; filtre stérile Pointes de pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-439</td><td></td></tr><tr><td>100 & micro ; L POURBOIRE&nbsp ; filtre stérile Pointes de pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-431</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro ; L TIP filtre stérile Pointes de pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Tube à centrifuger</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-138</td><td></td></tr><tr><td>20 & micro ; L POURBOIRE&nbsp ; filtre stérile Pointes de pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes à volume réglable (2,5, 10, 20, 100, 200, & 1000 & micro ; L)</td><td>Eppendorf</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-669-12</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond plat multipuits avec couvercles, nombre de puits = 12</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond plat multipuits avec couvercles, nombre de puits = 24</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtre stérile PIPET 10ML Sérologique jetable Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>Filtre stérile PIPETER 50ML Pipettes sérologiques jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10Q</td><td></td></tr><tr><td>Filtre stérile PIPETER 5ML Pipettes sérologiques jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>Gants d’examen en nitrile non poudrés</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597B</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles rondes (12 mm de diamètre, 0,17 - 0,25 mm d’épaisseur)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22293232 Filtre à</td><td></td></tr><tr><td>vide, taille des pores = 0,22 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-106</td><td></td></tr><tr><td>equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1300 B2 Armoire de biosécurité</td><td>Thermo Scientific</td><td>1310</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence tout-en-un Keyence BZ-X 810</td><td>Keyence</td><td>9011800000</td><td></td></tr><tr><td>Zoom binoculaire Stéréomicroscope</td><td>Vision Scientific</td><td>VS-1EZ-IFR07</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri jetables (100 mm de diamètre)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5 - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pince incurvée - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>2231000508</tr><tr><td>Ciseaux fins-Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux McPherson-Vannas, 8 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Bain de perles métalliques</td><td>Lab Armor</td><td>74309-714</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur à nutation, électrique=115V, 60Hz, Vitesse=24 tr/min</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Dissection recouverte de silicone Boîte de Pétri (90 mm diamètre)</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler, économie #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>501979</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur CO2 à chemise d’eau</td><td>VWR</td><td>10810-744</td><td></td></tr></tbody></table>

cultures cellulaires primaires pour étudier le potentiel de régénération de murin müller glia après un traitement par microarn

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

La glie de Müller (MG) est la glie prédominante dans la rétine neurale et peut fonctionner comme une source régénératrice pour les neurones rétiniens. Chez les vertébrés inférieurs tels que les poissons, la régénération entraînée par MG se produit naturellement; chez les mammifères, cependant, une stimulation avec certains facteurs ou une manipulation génétique / épigénétique est nécessaire. Étant donné que les MG ne représentent que 5% de la population cellulaire rétinienne, il existe un besoin de systèmes modèles permettant l’étude exclusive de cette population cellulaire. L’un de ces systèmes modèles est constitué de cultures MG primaires qui sont reproductibles et peuvent être utilisées pour une variété d’applications, y compris le criblage et l’identification de molécules / facteurs, le test de composés ou de facteurs, la surveillance cellulaire et / ou des tests fonctionnels. Ce modèle est utilisé pour étudier le potentiel de la MG murine à se convertir en neurones rétiniens après supplémentation ou inhibition des microARN (miARN) par transfection de miARN artificiels ou de leurs inhibiteurs. L’utilisation de souris rapporteures spécifiques à MG en combinaison avec le marquage immunofluorescent et le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) a confirmé que 80% à 90% des cellules trouvées dans ces cultures sont MG. En utilisant ce modèle, il a été découvert que les miARN peuvent reprogrammer MG en cellules progénitrices rétiniennes (RPC), qui se différencient ensuite en cellules neuronales. Les avantages de cette technique sont que les candidats miARN peuvent être testés pour leur efficacité et leurs résultats avant leur utilisation dans des applications in vivo .

Ce protocole décrit comment cultiver mg à partir de rétines de souris P12 et comment reprogrammer ces cellules avec miR-25 en neurones rétiniens à l’aide de la souris rapporteur Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Cette méthode a été utilisée dans des travaux antérieurs rapportant en détail d’autres miARN appropriés (mimiques ou inhibiteurs, en tant que molécules uniques ou en combinaison) pour reprogrammer MG en RPC qui adoptent ensuite les caractéristiques des cellules neuronales<sup clas...

Les cultures primaires de glie de Müller obtenues à partir de rétines de souris représentent un outil très robuste et fiable pour étudier la conversion gliale en cellules progénitrices rétiniennes après un traitement par microARN. Des molécules uniques ou des combinaisons peuvent être testées avant leur application ultérieure d’approches in vivo .

Cultures cellulaires primaires pour étudier le potentiel de régénération de murin Müller Glia après un traitement par microARN

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Ce protocole permet d’étudier le potentiel et la capacité de la glie de Muller à se convertir en cellules progénitrices rétiniennes après traitement avec des facteurs spécifiques tels que les microARN. L’avantage de cette technique est que les candidats microARN peuvent être testés pour leur efficacité et leurs résultats avant leur utilisation dans des applications in vivo. Seoyoung Kang, doctorant du laboratoire de Stefanie Wohl, aidera à démontrer la procédure.Tout d’abord, trempez brièvement le globe oculaire enlevé dans un tube avec de l’éthanol pour éviter la propagation des bactéries de l’animal. Ensuite, lavez brièvement le globe oculaire dans la boîte de Petri de 10 centimètres avant de le placer dans la plaque de 24 puits sur la glace. Une fois les globes oculaires enlevés et nettoyés, placez un œil dans la boîte de dissection placée sous un microscope à dissection avec une source de lumière.Maintenant, fixez un globe oculaire en saisissant le nerf optique et le tissu conjonctif environnant autour de la sclérotique avec une pince fine Dumont 5 et pressez-le soigneusement contre le plat de dissection. Ensuite, faites un trou dans le centre de la cornée à l’aide d’une aiguille de calibre 30 pour permettre un accès plus facile aux ciseaux veineux. Ensuite, disséquez la cornée autour du corps ciliaire à l’aide de ciseaux veineux et retirez délicatement la cornée, le cristallin, l’iris et le corps vitré avec une pince fine Dumont 5.Plus tard, disséquez la sclérotique avec des ciseaux veineux jusqu’à ce que le nerf optique soit atteint et extrayez soigneusement la rétine à l’aide de pinces fines Dumont 5. Utilisez maintenant une deuxième pince fine Dumont 5 pour pousser contre la rétine et retirer complètement le corps vitré. Transférer les rétines couper environ 2,5 centimètres de l’extrémité d’une pipette de transfert stérile pour agrandir le diamètre.Maintenant, en utilisant cette astuce, ramassez des rétines entières sans endommager le tissu et transférez les rétines dans une nouvelle boîte de Petri stérile avec HBSS froid et bercez la boîte. Ensuite, à l’aide d’une nouvelle pipette de transfert stérile, poussez soigneusement les rétines pour éliminer les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes. Placez immédiatement la rétine isolée dans un nouveau puits propre de la plaque de 24 puits remplie d’un millilitre de HBSS tout en gardant la plaque de 24 puits sur la glace pendant la dissection.Préparer le mélange de dissociation de la papaïne DNase I comme décrit dans le manuscrit. Maintenant, avec une pipette de transfert de pointe agrandie, ramassez les rétines. Attendez que les rétines se déposent au bas de la pointe et libèrent les rétines sans HBSS excessif dans le tube contenant le mélange de Papain DNase I.Ensuite, placez le tube sur un nutator dans l’incubateur et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, dissociez les cellules en pipitant soigneusement de haut en bas avec une pipette d’un millilitre. Une fois les cellules dissociées, ajoutez 275 microlitres d’inhibiteur de protéase ovomucoïde du kit de dissociation de la papaïne pour neutraliser la papaïne et mélangez doucement en pipetant de haut en bas.Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner à quatre degrés Celsius pendant huit minutes à une force centrifuge relative de 300. Ajouter le facteur de croissance épidermique au volume calculé du milieu de croissance préchauffé à 37 degrés Celsius. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse.Sans toucher la pastille au fond du tube, retirez le surnageant soigneusement et entièrement. Maintenant, remettez en suspension la pastille cellulaire avec 500 microlitres de facteur de croissance épidermique complété par le milieu de croissance. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un puits de la plaque de 12 puits étiquetée.Rincez le tube avec 500 microlitres supplémentaires du milieu de croissance supplémenté en facteur de croissance épidermique et ajoutez-le au puits. Balancez soigneusement la plaque de puits, puis placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec du dioxyde de carbone. Commencez par vérifier la confluence des cellules de 90 % à 100 %.Ensuite, retirez le milieu et ajoutez un millilitre de HBSS froid pour laver le puits. Balancez doucement la plaque et retirez HBSS sans laisser de traces. Plus tard, ajoutez 500 microlitres d’une solution contenant de la trypsine préchauffée pour détacher les cellules du puits.Rock doucement et incuber pendant deux minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après avoir déplacé la plaque de l’incubateur à l’armoire de biosécurité, aspirez la solution contenant de la trypsine en l’inclinant. Dispersez-le soigneusement et lentement sur le puits plusieurs fois jusqu’à ce que les cellules se détachent complètement.Ensuite, transférez cette suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 millilitre et insérez des tubes dans la centrifugeuse. Faire tourner à 300 fois g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius et ramener les tubes dans l’enceinte de biosécurité. Retirez le surnageant sans toucher la pastille.Maintenant, remettez soigneusement en suspension la pastille cellulaire en ajoutant 600 microlitres de milieu de croissance préchauffé et en pipetant de haut en bas environ 30 à 40 fois. Enfin, ensemencez 100 microlitres de la suspension cellulaire obtenue au centre de six glissements de couverture revêtus de la plaque de 24 puits. Placez la plaque sur l’incubateur et laissez les cellules se déposer pour une transfection ultérieure en utilisant des micro-imitations d’ARN.La figure montre les conditions de contrôle cinq jours après la transfection avec quelques cellules Ascl1-Tomate positives présentes. Cependant, après un traitement miR-25, beaucoup plus de cellules Ascl1-Tomate positives sont trouvées. La quantification a révélé une multiplication par quatre du nombre de cellules Ascl1-Tomato positives dans les puits traités miR-25 par rapport aux témoins.Plus important encore, la grande majorité des cellules Ascl1-Tomate positives trouvées dans les puits traités riR-25 ont adopté une morphologie neuronale. Les caractéristiques de cette morphologie neuronale comprenaient la réduction de la taille du soma cellulaire, le développement de processus fins et la formation de minuscules réseaux. La quantification a révélé qu’environ 70% de toutes les cellules Ascl1-tomate positives avaient des caractéristiques neuronales.Le marquage immunofluorescent montre que les cellules Ascl1-Tomate positives avec une morphologie neuronale expriment les marqueurs neuronaux OTX2 et MAP2, confirmant l’identité neuronale. La quantification de ces cellules a révélé qu’après la surexpression de miR-25, environ 40 neurones Ascl1-Tomato positifs par champ sont présents par rapport à cinq cellules neuronales par champ chez les témoins. Les cellules neuronales identifiées constituent environ 70% de la population totale de cellules Ascl1-Tomato positives des échantillons traités miR-25.De plus, la quantification du nombre absolu de neurones coexprimant OTX2 et MAP2 a montré qu’après le traitement miR-25, environ 60 neurones par champ ont été trouvés contre 10 neurones par champ chez les témoins. Il est impératif de travailler dans un environnement propre et aseptisé avec des outils propres et stériles et de travailler avec soin en évitant tout traitement sévère. Les applications en aval peuvent être, par exemple, la quantification des protéines, l’analyse de l’ADN ou de l’ARN, ou des études électrophysiologiques.Cette technique nous a permis d’explorer les questions initiales sur la reprogrammation nucléaire qui appartient au domaine de la médecine régénérative. Et il existe un large éventail de facteurs et de conditions qui peuvent être testés afin d’explorer de nouvelles questions.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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