Name: Détection de la souche wAlbB de Wolbachia dans les lignées cellulaires d’Aedes albopictus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Découvrez quatre méthodes complémentaires pour détecter Wolbachia dans les cellules d'Aedes albopictus. Ce protocole améliore la précision de détection des infections intracellulaires et facilite l'étude des interactions hôte-bactérie.

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Nous remercions le Dr Xin-Ru Wang de l’Université du Minnesota pour ses suggestions et ses conseils perspicaces. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (No.81760374).

1. Matériaux et réactifs
<ol><li>Utilisez des solutions et des milieux sans pyrogène pour la culture cellulaire (voir le Tableau des matériaux).</li>
	<li>Utilisez de l’eau ultrapure pour préparer toutes les solutions.</li>
	<li>Soyez prudent dans le choix du sérum fœtal bovin (FBS) pour la culture cellulaire, en suivant un processus de vérification du lot. REMARQUE: Comme les lots FBS sont sujets à des changements réguliers, il est impossible d’indiquer le catalogue et les numéros de lot pertinents dans ce protocole.</li>
	<li>Sélectionner des souches de cellules Aa23 dérivées d’œufs d’A. albopictus , correspondant à Aa23-T sans Wolbachia.</li>
</ol>2. Culture cellulaire
<ol><li>Préparer des flacons de culture cellulairede 25 cm 2 avec 4 mL de milieu de Schneider avec 10% de FBS.</li>
	<li>Incuber les flacons à 28 °C sous une atmosphère de 5 % deCO2 pendant 5 à 7 jours 7,24.</li>
	<li>Observez les cellules Aa23 et Aa23-T non colorées dans les flacons à l’aide de la microscopie optique à un grossissement de 100x (Figure 1).</li>
</ol>3. Extraction de l’ADN
<ol><li>Cultivez les cellules pendant 5-7 jours jusqu’à 70-80% de confluence par flacon (étape 2). Prélever les cellules par pipetage manuel à partir de 1 mL de milieu de culture remis en suspension par centrifugation pendant 5 min à 100 × g dans une microcentrifugeuse.</li>
	<li>Retirer le surnageant par aspiration et stocker la pastille cellulaire résultante à -20 °C.</li>
	<li>Remettre les granulés dans 0,40 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), placer 50 μL de la solution dans un tube de microcentrifugeuse, ajouter 5 μL de protéinase K (20 mg/mL) et incuber à 55 °C pendant 1 h. Enfin, chauffer ces tubes à 99 °C pendant 15 min pour obtenir l’ADN brut et le stocker à -20 °C.</li>
</ol>4. Détection de l’acide nucléique Wolbachia
<ol><li>Analyse PCR<ol>
<li>Effectuer la PCR dans un volume de réaction total de 20 μL, contenant 8 μL de ddH2O, 10 μL de Taq polymérase (voir la Table des matériaux), 1 μL de gabarit d’ADN (à partir de l’étape 3), 0,5 μL d’amorces avant et arrière (10 μM) : wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') et wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTC CA 3')25, respectivement.</li>
		<li>Utiliser les conditions de PCR suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 min, suivie de 35 cycles de dénaturation à 94 °C, recuit à 55 °C et extension à 72 °C ; puis, une dernière prolongation à 72 °C pendant 7 min.</li>
		<li>Détecter l’ADN sur un gel d’agarose à 1 % (1 % p/v d’agarose dans le PBS) à l’aide d’un imageur de gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse qPCR<ol>
<li>Analyser la copie du génome de Wolbachia pour trois répliques biologiques (n = 6) de l’ADN extrait (étape 3) à l’aide des amorces wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') et QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, normalisées avec des amorces avant et arrière de la protéine ribosomique S6 (RPS6) (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' et 5' GAGATGGTCAGGTGATTT 3', respectivement)3.</li>
		<li>Générez une courbe standard pour wAlbB et RPS6.<ol>
<li>Extraire l’ADN de PMD-18T (un vecteur spécial pour le clonage efficace de produits PCR (clonage TA)) plasmide recombinant contenant des fragments de gènes wsp et rps6 (fichier supplémentaire) et mesurer la concentration d’ADN plasmidique (voir la table des matériaux).</li>
			<li>Convertissez la concentration d’ADN plasmidique en concentration en nombre de copies à l’aide de Eq (1). Nombre de copies plasmidiques = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63662/63662eq01v3.jpg"> (1)</li>
			<li>Diluer le nombre de copies plasmidiques de 101 à 108 avec de l’eau ultrapure et définir 3 répliques pour chaque gradient de concentration.</li>
			<li>Effectuez une amplification qPCR à l’aide de TB Green et d’un système de PCR en temps réel (voir la table des matériaux) et enregistrez les résultats de chaque réaction. Utilisez la valeur Ct pour développer une courbe standard. Analyser l’ADN dans un volume de réaction total de 20 μL, comprenant 7 μL de ddH2O, 10,4 μL de TB Green (voir la Table des matériaux), 1 μL de gabarit d’ADN (fourni par l’étape 3) et 0,8 μL d’amorces avant et arrière (10 μM). Utilisez les conditions de réaction suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, et recuit à 60 °C pendant 35 s.</li>
			<li>Calculer le nombre de copies des gènes WSP et RPS6 dans les cellules en fonction de la courbe standard établie et de la densité relative de Wolbachia par le nombre de copies de wsp/RPS6. Analysez les données à l’aide d’un test t d’échantillons indépendants.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse par transfert de Western de la protéine Wolbachia<ol>
<li>Extraction de protéines<ol>
<li>Prélever 2 × 10cellules Aa23 et Aa23-T de 10 7 dans la plaque à six puits (à partir de l’étape 2) dans un tube de microcentrifugation, les laver trois fois avec du PBS et les centrifuger à 100 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
			<li>Préparer 1 mL de lysats avec un tampon de lyse RIPA (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1 % de Triton X-100, 1 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de dodécylsulfate de sodium [SDS], 2 mM de pyrophosphate de sodium, 25 mM de β-glycérophosphate, 1 mM d’EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/mL de leupeptine) et PMSF (concentration finale 1 mM).</li>
			<li>Ajouter 200 μL de tampon de lyse à la pastille cellulaire et maintenir pendant 30 min sur de la glace. Centrifuger les lysats à 12 000 × g pendant 10 min à 4 °C et retirer le surnageant.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analyser la concentration de wsp du surnageant à l’aide d’une trousse d’analyse des protéines de l’acide bicinchoninique (ACB) (voir la table des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Charger des quantités égales de protéines sur un gel SDS-PAGE à 15 % [10 % d’eau distillée; 50 % (30 % Acr-Bis (29:1), 38 % 1 M Tris, pH 8,8 ; 1 % (10 % SDS), 1 % (persulfate d’ammonium à 10 %), 0,04 % TEMED].</li>
		<li>Transférer la protéine dans des membranes de nitrocellulose, bloquer les membranes avec du lait écrémé à 5 % pendant2 h 26,27 à température ambiante, puis laver les membranes trois fois avec du TBST (1 mL de Tween 20 sur 1 L de TBS) (voir le Tableau des matériaux).</li>
		<li>Incuber les membranes pendant la nuit à 4 °C avec 100 μL d’anticorps polyclonal anti-wsp (préparés en interne, voir Fichier supplémentaire)), préparés en diluant l’anticorps primaire avec du lait écrémé à 5 % (1:12 000).</li>
		<li>Lavez l’anticorps primaire trois fois avec TBST.</li>
		<li>Incuber les membranes dans 100 μL d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) sur un agitateur pendant 1 h à température ambiante.</li>
		<li>Lavez les membranes trois fois avec tbST et mélangez 20 μL de solution A (réactif luminol de substrat HRP) et 20 μL de solution B (réactif de peroxyde de substrat HRP) dans le kit de détection de chimiluminescence dans un rapport de 1:1. Plongez l’ensemble de la membrane dans la solution de luminescence en même temps et observez les signaux à l’aide d’un système d’imagerie multifonctionnel.</li>
	</ol></li>
	<li>Localisation par immunofluorescence de la protéine Wolbachia<ol>
<li>Incuber 5 × 105 cellules Aa23 et Aa23-T à 28 °C sur une boîte de Petri confocale laser d’une épaisseur de 0,17 mm en fond, sous une atmosphère de CO2 à 5% pendant 3 à 4 jours 7,24. Attendez que la cellule soit à 60% à 70% de confluence et lavez les cellules trois fois avec PBS.</li>
		<li>Fixer les cellules pendant 20 min à 4 °C dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (p/v) dans le PBS.</li>
		<li>Lavez les cellules fixes à l’aide de PBST (0,2 % v/v Triton X-100 dans PBS) pendant 5 min et lavez à nouveau les cellules deux fois avec PBS.</li>
		<li>Incuber les lames pendant 1 h à 37 °C dans 1 mL d’albumine sérique bovine à 3 % (p/v) dans du PBS.</li>
		<li>Incuber les lames pendant la nuit dans 100 μL d’anticorps polyclonal anti-wsp de souris (préparé en interne) et de sérum de souris (dilution de 1:1 000 dans du PBS) dans une boîte humide (il peut maintenir l’humidité et empêcher l’humidité de s’évaporer) à 4 °C.</li>
		<li>Retirez les glissières de la boîte humide et remettez-les à température ambiante; lavez-les trois fois avec pbS et retirez le PBS. REMARQUE: À partir de l’étape 4.4.7, toutes les opérations doivent être protégées de la lumière.</li>
		<li>Incuber les lames avec 100 μL d’un anticorps anti-souris de chèvre conjugué Alexa Fluor 488 (dilution 1:2 000 dans pbS) à 37 °C pendant 30 min.</li>
		<li>Incuber les lames de l’échantillon avec 50 μL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI dilué dans du PBS à 10 μg/mL, se lie fortement à l’ADN) à 37 °C pendant 5 min, puis les laver trois fois avec du PBS.</li>
		<li>Observez l’immunocoloration au microscope confocal.<ol>
<li>Allumez l’alimentation et le laser.</li>
			<li>Allumez les lampes normales et au mercure du microscope.</li>
			<li>Démarrez le système et exécutez le logiciel d’exploitation. Placez une goutte d’huile de cèdre sur les lames d’échantillon, placez les lames d’échantillon sur la scène du microscope et déplacez la scène à la position appropriée.</li>
			<li>Cliquez sur le bouton d’observation de la lampe au mercure dans le logiciel, ouvrez l’obturateur de la lampe au mercure et observez l’échantillon sous un microscope inversé pour faire la mise au point.</li>
			<li>Utilisez le panneau de commande manuel pour sélectionner la fluorescence verte et bleue afin de prendre des photos de fluorescence sous un grossissement de 100x.</li>
			<li>Éteignez le bouton d’observation de la lampe au mercure et commencez à acquérir des images.</li>
			<li>Pour garantir une bonne qualité d’image, prénumérisez par taille de numérisation (512 pixels x 512 pixels). Ajustez la taille de numérisation pour obtenir des images claires (1 024 pixels x 1 024 pixels).</li>
			<li>Effectuez une réduction du bruit si le bruit de fond est trop élevé.</li>
			<li>Arrêtez la numérisation et enregistrez les images.</li>
			<li>Éteignez la lampe au mercure et les lasers.</li>
			<li>Essuyez l’objectif avec 75% d’alcool et abaissez l’objectif à la position la plus basse.</li>
			<li>Coupez l’obturateur et l’alimentation du microscope.</li>
			<li>Une fois l’instrument refroidi, couvrez-le avec le couvercle anti-poussière.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+Science+B%22%5BJournal%5D)">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li>
<li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li>
<li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunofluorescence%2C+Western+blotting%2C+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

La détection de l’infection intracellulaire à Wolbachia est essentielle pour l’étude des interactions Wolbachia-hôte et la confirmation de la transfection réussie des cellules avec de nouvelles souches. Dans ce protocole, quatre méthodes ont été utilisées pour détecter avec succès l’infection intracellulaire à Wolbachia aux niveaux d’acide nucléique et de protéines. Ces quatre méthodes expérimentales ont corroboré et amélioré la précision de détection de l’infection à Wolbachia des cel...

Le moustique tigre asiatique Aedes albopictus (Skuse) (Diptères: Culicidae), qui est un vecteur clé du virus de la dengue (DENV) en Asie et dans d’autres parties du monde1, est un hôte naturel de deux types de bactéries intracellulaires, Wolbachia (wAlbA et wAlbB), qui sont réparties dans toute la lignée germinale et le tissu somatique 2,3. La lignée cellulaire Aa23 dérivée d’embryons d’A. albopictus se compose d’au moins deux types de cellules morphologiques, qui soutiennent tous deux l’infection4 et peuvent être guéris de l’infection native de Wolbachia à l’aide d’antibiotiques (Aa23-T). Étant donné que Aa23 ne conserve que wAlbB, c’est un modèle utile pour l’étude des interactions hôte-endosymbiote 4,5,6.
Wolbachia est transmis par la mère et infecte environ 65% des espèces d’insectes 8,9 et 28% des espèces de moustiques10. Il infecte une variété de tissus et forme une relation symbiotique intime avec l’hôte, induisant généralement une incompatibilité cytoplasmique (IC)11 et un remplacement de la population en manipulant le système reproducteur hôte12,13. Ces réponses de l’hôte ont été observées dans des populations naturelles de Drosophila simulans14 et chez A. aegypti dans une cage de laboratoire et un essai sur le terrain15. Une manipulation non reproductrice importante provoquée par Wolbachia est la résistance induite de l’hôte à une variété d’agents pathogènes, y compris le DENV, le virus Chikungunya (CHIKV) et le virus du Nil occidental (VNO)16,17, qui peut être médiée par un système immunitaire inné amélioré du symbiote18,19, la compétition entre Wolbachia et les virus pour les ressources essentielles de l’hôte20 et la manipulation des voies de défense virale de l’hôte21 .
Ce protocole a été développé pour étudier ces mécanismes sous-jacents des réponses antivirales de l’hôte induites par Wolbachia. Il utilise quatre méthodes de détection de l’infection intracellulaire à Wolbachia des cellules Aa23. Ces méthodes fournissent une base théorique solide pour les études de l’infection intracellulaire à Wolbachia d’autres espèces hôtes. La première méthode, la PCR - une technique puissante permettant l’amplification enzymatique de régions spécifiques de l’ADN sans utiliser de procédures de clonage conventionnelles - a été utilisée pour détecter l’ADN de Wolbachia et déterminer la présence / absence d’infection à Wolbachia 22. La deuxième méthode mesure la densité de copie de l’ADN de Wolbachia à l’aide de la PCR quantitative (qPCR) pour une détection et une mesure fiables des produits générés au cours de chaque cycle de PCR qui est directement proportionnelle à la quantité de gabarit avant la PCR23. La troisième méthode détecte la présence de protéines intracellulaires de Wolbachia , en utilisant le transfert de Western, l’un des outils les plus puissants pour détecter des protéines spécifiques dans des mélanges complexes en combinant le pouvoir de séparation élevé de l’électrophorèse, la spécificité des anticorps et la sensibilité des réactions enzymatiques chromogènes. La dernière méthode est un test d’immunofluorescence (IFA) qui combine l’immunologie, la biochimie et la microscopie pour détecter la protéine de surface de Wolbachia (wsp) par une réaction antigène-anticorps afin de confirmer l’absorption cellulaire de Wolbachia et de déterminer sa localisation cellulaire.
Cet article décrit les quatre méthodes énumérées ci-dessus pour vérifier l’existence de Wolbachia dans les cellules, qui peuvent être utilisées pour détecter si le Wolbachia exogène a été transfecté avec succès et si le Wolbachia dans la cellule a été éliminé. Après avoir déterminé si Wolbachia est présent dans les cellules ou non, une variété d’analyses différentes peuvent être effectuées, y compris la génomique, la protéomique ou la métabolomique. Ce protocole démontre la détection de Wolbachia à travers les cellules Aa23 mais peut également être utilisé dans d’autres cellules.

<table><tbody><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>inSituX platform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis Logiciel d’analyse</td><td>dopé au</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cérium développé en interne</td><td>MSE Supplies</td><td></td><td>Substrats monocristallins Ce :Y3Al5O12, YAG</td></tr><tr><td>Porte-puce</td><td>Logiciel de contrôle développé</td><td></td><td></td>en interne</tr><tr><td>Huile</td> par immersion <td>développée</td><td></td><td></td>en interne</tr><tr><td></td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Type A faible viscosité 150 cSt</td></tr><tr><td>Plateforme inSituX</td><td>Source</td> lumineuse IR développée <td></td><td></td>en interne</tr><tr><td></td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED avec lentille en verre, 1085 nm, 5 mW, anneau extérieur TO-18</td></tr><tr><td></td><td>Lasers</td> à pompe développés <td></td><td></td>en interne</tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW et Oslash ; 9 mm, E Pin Code, Diode Laser</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Anneau</td> de retenue de fondation <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Raspberry Pi Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 Anneau de retenue pour &Oslash ; Tubes d’objectif et montures</td></tr><tr><td>1" Cristal de quartz sans pépins</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm de diamètre Coupe en Z 0,05 mm d’épaisseur Polissage double face 8 mm sur -</td></tr><tr><td>X Cale</td> Arrêt de faisceau de rayons X <td>développé</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>en interne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détection de la souche walbb de wolbachia dans les lignées cellulaires d’aedes albopictus

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

En tant qu’endosymbiote domestique de la mère, Wolbachia infecte de grandes proportions de populations d’insectes. Des études ont récemment rapporté la régulation réussie de la transmission du virus à ARN à l’aide de moustiques transfectés par Wolbachia. Les stratégies clés pour contrôler les virus comprennent la manipulation de la reproduction de l’hôte par incompatibilité cytoplasmique et l’inhibition des transcriptions virales par l’amorçage immunitaire et la concurrence pour les ressources dérivées de l’hôte. Cependant, les mécanismes sous-jacents des réponses des moustiques transfectés par Wolbachia à l’infection virale sont mal compris. Cet article présente un protocole pour l’identification in vitro de l’infection à Wolbachia aux niveaux d’acide nucléique et de protéines dans les cellules Aa23 d’Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) afin d’améliorer la compréhension des interactions entre Wolbachia et ses insectes vecteurs. Grâce à l’utilisation combinée de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), de la PCR quantitative, du transfert western et des méthodes d’analyse immunologique, un protocole morphologique standard a été décrit pour la détection des cellules infectées par Wolbachia qui est plus précis que l’utilisation d’une seule méthode. Cette approche peut également être appliquée à la détection de l’infection à Wolbachia dans d’autres taxons d’insectes.

Avant la détection de Wolbachia , les cellules Aa23 et Aa23-T ont été observées au microscope optique pour déterminer les différences morphologiques entre les deux lignées cellulaires. Les cellules Aa23 et Aa23-T ont au moins deux morphologies cellulaires, mais aucune différence morphologique évidente entre les deux types de cellules (Figure 1). Ici, les cellules Aa23 ont été utilisées comme système modèle pour détecter l’infection à Wolbachia en utilisant ...

Quatre méthodes ont été utilisées pour détecter les Wolbachia intracellulaires, qui se complétaient et amélioraient la précision de la détection de l’infection à Wolbachia de aa23 dérivé d’Aedes albopictus et de l’Aa23-T guéris de l’infection native de Wolbachia à l’aide d’antibiotiques.

Détection de la souche wAlbB de Wolbachia dans les lignées cellulaires d’Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Ce protocole permet de vérifier l’existence de Wolbachia dans les cellules, ce qui est la base de la compréhension de l’interaction entre Wolbachia et son hôte. Dans ce protocole, quatre méthodes ont été utilisées pour détecter avec succès l’infection intracellulaire à Wolbachia, ce qui a corroboré et amélioré la précision de la détection de l’infection à Wolbachia des cellules. La démonstration de la procédure sera assurée par Qiuqiu Xiao, un étudiant de troisième cycle du Key Laboratory of Modern Pathogen Biology and Characteristics.Commencez par observer les cellules Aa23 et Aa23-T non colorées à un grossissement de 100x à l’aide de la microscopie optique. Cultivez les cellules pendant cinq à sept jours pour atteindre 70 à 80% de confluence par flacon. À l’aide d’une pipette, transférer 1 mL du milieu de culture dans un tube de microcentrifugation.Centrifuger à 100 RCF pendant cinq minutes pour récolter les cellules. Retirez le surnageant et conservez la pastille de cellule résultante à moins 20 degrés Celsius. Cultivez les cellules pendant cinq à sept jours pour atteindre une confluence de 90 à 100 % par flacon.Remettre en suspension les granulés dans 0,40 mL de PBS et transférer 50 microlitres de cette solution dans un tube de microcentrifugeuse. Ajouter cinq microlitres de 20 mg/mL de protéinase K et incuber à 55 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, incubez les tubes à 99 degrés Celsius pendant 15 minutes pour obtenir l’ADN brut et le stocker à moins 20 degrés Celsius.Pour effectuer la PCR, préparez un mélange réactionnel total de 20 microlitres et définissez les conditions de PCR comme décrit dans le manuscrit textuel. Détectez l’ADN sur un gel d’agarose à 1% à l’aide d’un imageur de gel. Effectuez une amplification PCR quantitative à l’aide de TB Green dans un système de PCR en temps réel et enregistrez les résultats de chaque réaction.Analysez l’ADN dans un volume de réaction total de 20 microlitres et définissez les conditions quantitatives de PCR décrites dans le manuscrit textuel. Calculez le nombre de copies de gènes WSP et RPS6 dans les cellules selon la courbe standard établie. Calculez ensuite la densité relative de Wolbachia par le nombre de copies de wsp/RPS6.Analysez les données à l’aide d’un test t d’échantillons indépendants. Ajouter 200 microlitres de tampon de lyse à la pastille cellulaire et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifuger les lysats à 12 000 RCF pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le surnageant.Analyser la concentration de wsp du surnageant à l’aide d’un kit de dosage de protéine bCA, en suivant les instructions du fabricant. Chargez des quantités égales de protéines sur un gel SDS-PAGE à 15%. Transférer la protéine dans les membranes de nitrocellulose et bloquer les membranes avec du lait écrémé à 5% pendant deux heures à température ambiante.Ensuite, lavez les membranes trois fois avec TBST. Incuber les membranes pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec 100 microlitres d’anticorps polyclonaux anti-wsp préparés en diluant l’anticorps primaire avec du lait écrémé à 5%. Lavez l’anticorps primaire trois fois avec TBST.Ajouter 100 microlitres d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort aux membranes et l’incuber sur un agitateur pendant une heure à température ambiante. Lavez les membranes trois fois avec TBST et mélangez 20 microlitres de solution A et 20 microlitres de solution B dans le kit de détection de chimiluminescence dans un rapport de un à un. Plongez simultanément toute la membrane dans la solution de luminescence et observez les signaux à l’aide d’un système d’imagerie multifonctionnel.Sur une boîte de Petri confocale laser, incuber les cellules Aa23 et Aa23-T pendant trois à quatre jours à 28 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone atmosphérique. Lorsque la cellule atteint 60 à 70% de confluence, lavez les cellules trois fois avec PBS. Fixez les cellules dans un mL de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Lavez les cellules fixes à l’aide de PBST pendant cinq minutes et lavez les cellules deux fois avec PBS. Incuber la boîte de Petri dans un mL d’albumine sérique bovine à 3% pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ajouter 100 microlitres d’anticorps polyclonaux anti-wsp de souris et de sérum de souris aux lames et l’incuber pendant la nuit dans une boîte humide à quatre degrés Celsius.Retirez la boîte de Petri de la boîte humide et remettez-la à température ambiante. Lavez-les trois fois avec pbS et retirez le PBS. Protégez les procédures suivantes de la lumière.Incuber la boîte de Petri avec 100 microlitres d’un anticorps anti-souris de chèvre conjugué Alexa Fluor 488 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Incuber l’échantillon de boîte de Petri avec 50 microlitres de DAPI dilués dans du PBS à 10 microgrammes/mL à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis les laver trois fois avec du PBS. Observez l’immunocoloration au microscope confocal.Avant de détecter Wolbachia, les cellules Aa23 et Aa23-T ont été observées au microscope optique pour déterminer les différences morphologiques entre les deux lignées cellulaires. Les cellules Aa23 et AA23-T avaient au moins deux morphologies cellulaires, mais aucune différence morphologique apparente n’a été observée entre les deux types de cellules. En utilisant les amorces diagnostiques 81F/691R, une amplification positive du gène Wolbachia wsp a été détectée dans les cellules Aa23 mais pas dans les cellules Aa23-T.L’analyse de la densité de Wolbachia dans les lignées cellulaires a montré un rapport wsp/rps6 de 2,4 dans les cellules Aa23 mais pas de Wolbachia dans les cellules Aa23-T. L’analyse par transfert Western d’extraits de protéines a montré un fort signal wsp pour Aa23, mais aucun signal n’a été détecté pour Aa23-T. Le test d’immunofluorescence indirecte a détecté la protéine wsp dans les cellules Aa23, tandis que seul l’ADN coloré DAPI a été détecté dans les cellules Aa23-T.S’assurer que les flacons de culture sont incubés à 28 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone atmosphérique pendant cinq à sept jours. Cette procédure peut être suivie par la microscopie électronique où il faut accorder une attention particulière à la préparation et au sectionnement des échantillons. Les quatre méthodes expérimentales utilisées dans cette étude ont confirmé la précision de la détection de l’infection à Wolbachia dans les cellules, qui est également applicable à d’autres types de cellules et de tissus.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Wolbachia infection bactérienne chez la drosophile

Cette vidéo décrit un procédé de purification Wolbachia pipientis partir d'une ligne de cellules Anopheles gambiae et la culture de la endosymbiote dans la cellule sans moyen. Un test pour la viabilité de la bactérie est démontrée.

Le maintien de Wolbachia dans la cellule sans moyen

Les analyses RNA-Seq deviennent de plus en plus importantes pour identifier les fondements moléculaires des traits adaptatifs dans les organismes non modèles. Ici, un protocole permettant d’identifier les gènes exprimés de manière différentielle entre les moustiques Aedes albopictus diapause et non diapause est décrit, de l’élevage des moustiques au séquençage de l’ARN et aux analyses bioinformatiques des données RNA-Seq.

Un protocole expérimental et de la bioinformatique pour les analyses d'ARN-Seq de la photopériode diapause dans le Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia sont libérés dans les populations naturelles de supprimer la transmission des arbovirus. Nous décrivons des méthodes arrière Ae. aegypti Wolbachia infections en laboratoire pour des expériences et sortie de terrain, prendre des précautions pour réduire au minimum la sélection et l’adaptation de laboratoire.

Maintenir les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia

Ce protocole décrit comment établir une infection virale in vivo chez Drosophila melanogaster en utilisant la méthode de nano-injection et les techniques de base pour analyser l’interaction virus-hôte.

Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Décrit est une méthode permettant de gagner du temps et de l’espace pour compter les œufs et déterminer les taux d’éclosion des moustiques individuels à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire dans les puits, ce qui peut augmenter considérablement l’échelle et la vitesse des essais de fécondité et de fertilité.

Amélioration de la fécondité et de la fertilité pour Aedes aegypti à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire de puits (plaques EAgaL)

Un protocole pour la culture du parasite microsporidien Edhazardia aedis. Le parasite est transmis d’une génération de moustiques Aedes aegypti à l’autre par transfert horizontal au stade larvaire suivi d’une transmission verticale au stade adulte. Les sporoplasmes vivants survivent à long terme dans les œufs infectés.

Propagation du parasite microsporidien Edhazardia aedis chez les moustiques Aedes aegypti

Nous présentons ici un protocole pour étudier la compétitivité d’accouplement du mâle Aedes aegypti en utilisant un colorant fluorescent comme marqueur. Les moustiques femelles sont exposées à des mâles marqués et non marqués pour la copulation. Après l’accouplement, leurs spermathèques sont examinées au microscope à fluorescence pour déterminer leur partenaire d’accouplement.

Utilisation du colorant fluorescent, Rhodamine B, pour étudier la compétitivité de l’accouplement chez les moustiques mâles Aedes aegypti

La manipulation de l’interférence ARN (ARNi) présente un défi formidable chez de nombreuses espèces de parasitoïdes de petite taille, telles que les guêpes Trichogramma . Cette étude a permis de définir une méthode ARNi efficace chez Trichogramma denrolimi. La présente méthodologie fournit un modèle robuste pour étudier la régulation des gènes chez les guêpes Trichogramma .

Interférence de l’ARN chez le parasitoïde de l’œuf, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Les communautés microbiennes chez les moustiques sont très prometteuses pour les stratégies de biocontrôle vectoriel. La plupart des symbiotes sont incultivables et nécessitent des analyses métagénomiques. Nous décrivons une méthode pour disséquer les moustiques femelles et séparer les ovaires, l’intestin moyen et les glandes salivaires, en évitant la contamination croisée, en facilitant les études du microbiome au niveau des organes et en améliorant la compréhension des rôles des...

Dissection des ovaires, de l’intestin moyen et des glandes salivaires de moustiques pour l’analyse du microbiome au niveau des organes

Les lignées cellulaires sont utiles dans les études sur les organismes intracellulaires qui ne peuvent pas être cultivés en dehors de leurs cellules hôtes. Bien que les lignées infectées par Wolbachia aient permis de nombreuses découvertes, l’hétérogénéité au sein de ces lignées peut conduire à des résultats expérimentaux variables. Nous présentons un protocole pour générer des clones unicellulaires et des cultures continues à partir de cellules JW18 infectées par Wolbachia.

Génération de cultures monoclonales à partir de la lignée cellulaire de Drosophila melanogaster JW18 infectée par Wolbachia

Découvrez quatre méthodes complémentaires pour détecter Wolbachia dans les cellules d'Aedes albopictus. Ce protocole améliore la précision de détection des infections intracellulaires et facilite l'étude des interactions hôte-bactérie.

Détection de la souche wAlbB de Wolbachia dans les lignées cellulaires d’Aedes albopictus

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