Name: La spectroscopie neutronique à haute résolution pour étudier la dynamique picoseconde-nanoseconde des protéines et de l’eau d’hydratation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez la spectroscopie neutronique à rétrodiffusion pour étudier la dynamique des protéines amyloïdes et de l'eau d'hydratation. Cette méthode sans marquage permet d'analyser les mécanismes moléculaires des maladies neurodégénératives.

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Les auteurs remercient Michaela Zamponi du Jülich Centre for Neutron Science du Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Allemagne, pour une partie des expériences de diffusion neutronique menées sur l’instrument SPHERES. Ces travaux ont bénéficié des activités du consortium Deuteration Laboratory (DLAB) financé par l’Union européenne dans le cadre des contrats HPRI-2001-50065 et RII3-CT-2003-505925, et de l’activité financée par le UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) au sein de l’Institut Laue Langevin EMBL DLAB sous les subventions GR/R99393/01 et EP/C015452/1. Le soutien apporté par la Commission européenne au titre du 7e programme-cadre par l’intermédiaire de l’action clé « Renforcer l’Espace européen de la recherche, infrastructures de recherche » est reconnu [Contrat 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot et Christian Beck remercient le ministère fédéral de l’Éducation et de la Recherche (BMBF, numéro de subvention 05K19VTB) pour le financement de leurs bourses postdoctorales.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

La spectroscopie neutronique est la seule méthode qui permet de sonder la dynamique ps-ns moyenne d’ensemble des échantillons de protéines, quelle que soit la taille de la protéine ou la complexité de la solution lorsque la deutération est utilisée6. Plus précisément, en sondant l’autodiffusion d’assemblages protéiques en solution, la taille hydrodynamique de ces assemblages peut être déterminée sans ambiguïté. Néanmoins, la méthode est généralement limitée par le faible flux de neutrons, ce qui i...

Le neutron est une particule massive et sans charge qui a été utilisée avec succès au fil des ans pour sonder des échantillons dans divers domaines allant de la physique fondamentale à la biologie1. Pour les applications biologiques, la diffusion neutronique aux petits angles, la diffusion inélastique des neutrons, la cristallographie et la réflectométrie neutroniques sont largement utilisées 2,3,4. La diffusion inélastique des neutrons fournit une mesure de la dynamique en moyenne d’ensemble sans nécessiter de marquage spécifique en soi, et une qualité de signal qui ne dépend pas de la taille ou de la protéine5. La mesure peut être effectuée en utilisant un environnement très complexe pour la protéine étudiée qui imite le milieu intracellulaire, comme un lysat bactérien deutéré ou même in vivo 3,6,7. Différentes configurations expérimentales peuvent être utilisées pour étudier la dynamique, à savoir i) le temps de vol donnant accès à la dynamique sous-ps-ps, ii) l’accès à la rétrodiffusion donnant accès à la dynamique ps-ns, et iii) l’accès spin-echo-donnant accès à la dynamique de ns à des centaines de ns. La rétrodiffusion neutronique utilise la loi de Bragg 2d sinθ = nλ, où d est la distance entre les plans d’un cristal, θ l’angle de diffusion, n l’ordre de diffusion et λ la longueur d’onde. L’utilisation de cristaux pour la rétrodiffusion vers les détecteurs permet d’obtenir une haute résolution en énergie, typiquement ~0,8 μeV. Pour mesurer l’échange d’énergie, soit un entraînement Doppler transportant un cristal en rétrodiffusion est utilisé pour définir et régler la longueur d’onde neutronique entrante 8,9,10 (Figure 1), soit une configuration de temps de vol peut être utilisée au prix d’une diminution de la résolution d’énergie 11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> Figure 1 : Croquis d’un spectromètre de rétrodiffusion à neutrons avec un entraînement Doppler. Le faisceau entrant frappe le hacheur42 de transformation de l’espace de phase (PST), ce qui augmente le flux à la position de l’échantillon. Il est ensuite rétrodiffusé vers l’échantillon par le lecteur Doppler, qui sélectionne une énergieE1 (flèche cyan). Les neutrons sont ensuite dispersés par l’échantillon (avec différentes énergies représentées par la couleur des flèches) et les analyseurs, constitués de cristaux de Si 111, ne feront que rétrodiffuser des neutrons avec une énergie spécifique E0 (flèches de couleur rouge ici). Par conséquent, le transfert de quantité de mouvement q est obtenu à partir de la position détectée du neutron sur le réseau de détecteurs, et le transfert d’énergie est obtenu à partir de la différence E1- E0. Le temps de vol prévu pour l’impulsion de neutrons produite par le PST est utilisé pour rejeter le signal des neutrons diffusés directement vers les tubes détecteurs. Abréviation : PST = transformation de l’espace de phase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour la spectroscopie de rétrodiffusion, la principale contribution au signal des échantillons riches en protons d’hydrogène, tels que les protéines, provient de la diffusion incohérente, pour laquelle l’intensité de diffusion Sinc(q, ω) est représentée par Eq (1)12
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
Où σinc est la section efficace incohérente de l’élément considéré, k' est la norme du vecteur d’onde diffusé, k la norme du vecteur d’onde entrant, q (= k - k') le transfert de quantité de mouvement, r j(t) le vecteur position de l’atome j au temps t, et ω la fréquence correspondant au transfert d’énergie entre le neutron entrant et le système. Les crochets angulaires indiquent la moyenne de l’ensemble. Par conséquent, la diffusion incohérente sonde l’auto-corrélation d’une seule particule moyenne d’ensemble des positions des atomes avec le temps et donne l’autodynamique moyenne sur tous les atomes du système et différentes origines temporelles (moyenne d’ensemble). La fonction de diffusion est la transformée de Fourier dans le temps de la fonction de diffusion intermédiaire I(q, t), qui peut être vue comme la transformée de Fourier dans l’espace de la fonction de corrélation de van Hove représentée par Eq (2):
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Où ρ(r,t) est la densité de probabilité de trouver un atome à la position r et au temps t 13.
Pour un processus de diffusion de Fickian, la fonction d’autodiffusion résulte (voir Eq (3)) après une double transformée de Fourier dans une fonction de diffusion consistant en un Lorentzien de largeur de droite donnée par γ = Dq2.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
Des modèles plus sophistiqués ont été développés et jugés utiles, tels que le modèle de diffusion de saut de Singwi et Sjölander pour la dynamique des protéines internes ps-ns14 ou le modèle de rotation de Sears pour l’eau d’hydratation15,16,17.
Sur l’instrument de rétrodiffusion de neutrons (NBS) IN16B8,9 à l’ILL, Grenoble, France (Figure supplémentaire S1), une configuration couramment utilisée avec des protéines est constituée de cristaux de Si 111 pour les analyseurs avec un entraînement Doppler pour régler la longueur d’onde entrante (Figure supplémentaire S2A), donnant ainsi accès à la plage de transfert de quantité de mouvement ~0,2 Å-1 &lt; q &lt; ~2 Å-1 et à la plage de transfert d’énergie de -30 μeV &lt; <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> &lt; 30 μeV-correspondant à des échelles de temps allant de quelques ps à quelques ns et des distances de quelques Å. En outre, IN16B offre la possibilité d’effectuer des balayages élastiques et inélastiques à fenêtre fixe (E/IFWS)10, qui incluent l’acquisition de données lors d’un transfert d’énergie fixe. Comme le flux est limité lorsque l’on travaille avec des neutrons, E/IFWS permet de maximiser le flux pour un transfert d’énergie, réduisant ainsi le temps d’acquisition nécessaire pour obtenir un rapport signal sur bruit satisfaisant. Une option plus récente est le spectromètre de rétrodiffusion et de temps de vol (BATS) mode11, qui permet de mesurer une large gamme de transferts d’énergie (par exemple, -150 μeV &lt; <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> &lt; 150 μeV), avec un flux plus élevé qu’avec le lecteur Doppler, mais au prix d’une résolution énergétique inférieure (figure supplémentaire S2B).
Une propriété importante de la diffusion des neutrons est que la section efficace incohérente σinc a une valeur 40 fois plus élevée pour l’hydrogène que pour le deutérium et est négligeable pour d’autres éléments couramment trouvés dans les échantillons biologiques. Par conséquent, la dynamique des protéines dans un environnement liquide peut être étudiée en utilisant un tampon deutérisé, et l’état de la poudre permet l’étude soit de la dynamique interne des protéines avec de la poudre de protéine hydrogénée hydratée avec D2O, soit de l’étude de l’eau d’hydratation pour la poudre de protéine perdeutérée hydratée avecH2O. À l’état liquide, la rétrodiffusion neutronique permet généralement d’accéder simultanément à l’autodiffusion du centre de masse des protéines (diffusion de type fickien) et à leur dynamique interne. Ces derniers sont des mouvements de colonne vertébrale et de chaîne latérale généralement décrits par le modèle dit de diffusion de saut ou d’autres 3,18. Dans les poudres de protéines hydrogénées, la diffusion des protéines est absente et seule la dynamique interne doit être modélisée. Pour l’eau d’hydratation, les contributions des mouvements translationnels et rotationnels des molécules d’eau présentent une dépendance différente du transfert de quantité de mouvement q, ce qui permet leur distinction dans le processus d’analyse des données17.
Cet article illustre la méthode de rétrodiffusion des neutrons avec l’étude des protéines qui se sont avérées capables de se déplier, de s’agréger sous une forme canonique composée d’empilements de brins β - le motif dit de βcroisée 19,20 - et de former des fibres allongées. C’est ce qu’on appelle l’agrégation amyloïde, qui est largement étudiée en raison de son rôle central dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson21,22. L’étude des protéines amyloïdes est également motivée par le rôle fonctionnel qu’elles peuvent jouer 23,24 ou leur fort potentiel pour le développement de nouveaux biomatériaux25. Les déterminants physico-chimiques de l’agrégation amyloïde restent flous, et aucune théorie générale de l’agrégation amyloïde n’est disponible, malgré d’énormes progrès au cours des dernières années21,26.
L’agrégation amyloïde implique des changements dans la structure et la stabilité des protéines avec le temps, dont l’étude implique naturellement une dynamique, liée à la stabilité de la conformation des protéines, à la fonction protéique et au paysage énergétique des protéines27. La dynamique est directement liée à la stabilité d’un état spécifique par la contribution entropique pour les mouvements les plus rapides28, et la fonction protéique peut être maintenue par des mouvements sur différentes échelles de temps de sub-ps pour les protéines sensibles à la lumière29 à ms pour les mouvements de domaine, ce qui peut être facilité par la dynamique picoseconde-nanoseconde30.
Deux exemples d’utilisation de la spectroscopie de rétrodiffusion neutronique pour étudier les protéines amyloïdes seront présentés, l’un à l’état liquide pour étudier la dynamique des protéines et l’autre à l’état de poudre hydratée pour étudier la dynamique de l’hydratation de l’eau. Le premier exemple concerne l’agrégation du lysozyme en sphères de taille μm (appelées particules) suivies en temps réel5, et le second une comparaison de la dynamique de l’eau aux états natifs et agrégés de la protéine humaine tau31.
Le lysozyme est une enzyme impliquée dans la défense immunitaire et est composé de 129 résidus d’acides aminés. Le lysozyme peut former des particules dans un tampon deutéré à une température de 10,5 et à une température de 90 °C. Avec la diffusion neutronique, nous avons montré que l’évolution temporelle du coefficient de diffusion du centre de masse du lysozyme suit la cinétique exponentielle unique de la fluorescence T de la thioflavine (une sonde fluorescente utilisée pour surveiller la formation de motifs de β croisée amyloïde32), indiquant que les superstructures particulaires de formation et les modèles de β croisée se produisent en une seule étape avec le même taux. De plus, la dynamique interne est restée constante tout au long du processus d’agrégation, ce qui peut s’expliquer soit par un changement conformationnel rapide qui ne peut être observé sur les instruments NBS, soit par l’absence de changement significatif de l’énergie interne des protéines lors de l’agrégation.
La protéine tau humaine est une protéine intrinsèquement désordonnée (PDI) constituée de 441 acides aminés pour l’isoforme dite 2N4R, qui est notamment impliquée dans la maladie d’Alzheimer33. En utilisant la rétrodiffusion neutronique sur des poudres de protéine tau perdeutérée, nous avons montré que la dynamique de l’eau d’hydratation est augmentée à l’état fibreux, avec une population plus élevée de molécules d’eau subissant des mouvements de translation. Le résultat suggère qu’une augmentation de l’entropie de l’eau d’hydratation pourrait conduire la fibrillation amyloïde de tau.

<table><tbody><tr><td>Porte-échantillon</td><td></td><td></td><td>en aluminium Non disponible dans le commerce. Soit le contact local sur l’instrument peut les fournir, soit ils peuvent être fabriqués sur la base d’un dessin technique qui peut être fourni par le contact local.</td></tr><tr><td>Chlorure de deutérium, 35 % en poids dans D2O, &ge ; 99 atomes % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> 543047</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium (D, 99,9 %)</td><td>Eurisotop</td><td>DLM-4DR-PK</td><td></td></tr><tr><td>Graisse silicone sous vide poussé Dow Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 96 %, EMSURE Reag. Ph Eur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.5901</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur en verre</td><td>VWR</td><td>&nbsp ; 75871-660</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de dessiccateur en verre, 140 mm</td><td>VWR</td><td>89038-068</td><td></td></tr><tr><td>Fil d’indium, 1,0 mm (0,04 in) dia, Puratronic, 99,999 %</td> <td>Alfa Aesar</td><td>00470.G1</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme de blanc d’œuf de poule dialysé, lyophilisé, poudre, ~100 000 U/mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62970</td><td></td></tr><tr><td>nPDyn</td><td></td><td>v3.x</td><td>voir github.com/kpounot/nPDyn, fonctions du modèle pour raccord également inclus dans le logiciel</td></tr><tr><td>OHAUS AX324 Balance Adventurer, étalonnage interne</td><td>Dutscher</td><td>92641</td><td></td></tr><tr><td>Pentoxyde de phosphore, ReagentPlus, 99 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>214701</td><td></td></tr><tr><td>Pipette ErgoOne 0.5-10 &mu ; L</td><td>Starlab</td><td>S7100-0510</td><td></td></tr><tr><td>Pipette ErgoOne 100-1 000 &mu ; L</td><td>Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipette ErgoOne 20-200 &mu ; L</td><td>Starlab</td><td>S7100-2200</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de pipette TipOne 1,000 &mu ; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de pipette TipOne 10 &mu ; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-3200</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de pipette TipOne 200 &mu ; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Solution de deutéroxyde de sodium, 40 % en poids dans D2O, 99,5 % d’atomes</td><td>D Sigma-Aldrich</td><td>372072</td><td></td></tr></tbody></table>

la spectroscopie neutronique à haute résolution pour étudier la dynamique picoseconde-nanoseconde des protéines et de l’eau d’hydratation

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

La diffusion neutronique offre la possibilité de sonder la dynamique dans les échantillons pour une large gamme d’énergies d’une manière non destructive et sans marquage autre que le deutérium. En particulier, la spectroscopie de rétrodiffusion neutronique enregistre les signaux de diffusion à plusieurs angles de diffusion simultanément et est bien adaptée pour étudier la dynamique des systèmes biologiques sur l’échelle de temps ps-ns. En utilisant des composants tampons D2O et éventuellement deutérés, la méthode permet de surveiller à la fois la diffusion du centre de masse et les mouvements du squelette et de la chaîne latérale (dynamique interne) des protéines à l’état liquide.
De plus, la dynamique de l’eau d’hydratation peut être étudiée en utilisant des poudres de protéines perdeutérées hydratées avecH2O. Cet article présente le flux de travail utilisé sur l’instrument IN16B à l’Institut Laue-Langevin (ILL) pour étudier la dynamique des protéines et de l’eau d’hydratation. La préparation d’échantillons de solution et d’échantillons de poudre de protéines hydratées par échange de vapeur est expliquée. La procédure d’analyse des données pour la dynamique des protéines et de l’eau d’hydratation est décrite pour différents types d’ensembles de données (spectres quasi-élastiques ou balayages à fenêtre fixe) qui peuvent être obtenus sur un spectromètre de rétrodiffusion de neutrons.
La méthode est illustrée par deux études portant sur des protéines amyloïdes. L’agrégation du lysozyme en agrégats sphériques de taille μm - notés particules - se produit dans un processus en une étape sur l’espace et la plage temporelle sondés sur IN16B, tandis que la dynamique interne reste inchangée. De plus, la dynamique de l’hydratation de l’eau de tau a été étudiée sur des poudres hydratées de protéines perdeutérées. Il est montré que les mouvements de translation de l’eau sont activés lors de la formation de fibres amyloïdes. Enfin, les étapes critiques du protocole sont discutées quant à la position de la diffusion neutronique par rapport à l’étude de la dynamique par rapport à d’autres méthodes biophysiques expérimentales.

L’agrégation du lysozyme en particules a été réalisée à 90 °C avec une concentration protéique de 50 mg/mL dans un tampon deutéré (0,1 M NaCl à 10,5). La formation de particules est déclenchée par l’augmentation de la température jusqu’à 90 °C et se produit dans les 6 heures (figure supplémentaire S8). L’acquisition des données a été effectuée sur IN16B, comme décrit dans le protocole ci-dessus (les données sont conservées en permanence par le PEB et accessibles au http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04...

La spectroscopie de rétrodiffusion neutronique offre un accès non destructif et sans marquage à la dynamique ps-ns des protéines et de leur eau d’hydratation. Le flux de travail est présenté avec deux études sur les protéines amyloïdes: sur la dynamique résolue dans le temps du lysozyme pendant l’agrégation et sur la dynamique de l’eau d’hydratation de tau lors de la formation de fibres.

La spectroscopie neutronique à haute résolution pour étudier la dynamique picoseconde-nanoseconde des protéines et de l’eau d’hydratation

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

La rétrodiffusion des neutrons mesure la diffusion globale et la dynamique interne des protéines et de l’eau d’hydratation sans dommages causés par les radiations. La spectroscopie neutronique accède simultanément aux corrélations spatiales et temporelles au niveau moléculaire. Dans la matière molle et les matériaux biologiques, il est particulièrement intéressant d’obtenir des informations indirectes sur l’ordre local sur ces systèmes de désordres à longue distance.Ainsi, la rétrodiffusion des neutrons peut être utilisée pour étudier la dynamique en biologie, en chimie ou en sens matériel. Un autre domaine fort est celui de l’énergie, avec des études, par exemple, sur les batteries et les piles à combustible. La rétrodiffusion des neutrons a été utilisée avec succès pour étudier la dynamique moléculaire des protéines impliquées dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson.Les résultats obtenus nous aident à mieux comprendre les caractéristiques moléculaires de ces pathologies et pourraient ouvrir la voie à de meilleurs diagnostics. Pour préparer le porte-échantillon, commencez par nettoyer soigneusement un porte-échantillon plat

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