Name: Microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Découvrez la microdissection laser couplée au protocole CEL-Seq2 pour l'analyse transcriptomique de tissus individuels chez C. elegans. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique sans outils génétiques spécifiques.

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Ce travail a été financé par les subventions des NIH (R01GM141395) et de la NSF (1656736) à DF et des bourses NIH (F32GM136170) à AW. La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender.com.

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</ol>

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Étapes critiques de la méthode Si elle est effectuée correctement, la méthode décrite ici permettra d’obtenir des profils d’ARN robustes avec un nombre relativement faible d’échantillons disséqués au laser (70 pointes de queue dans cet exemple). Cependant, pour les échantillons provenant d’animaux en développement, une synchronisation étroite est essentielle pour réduire la variabilité entre les échantillons. Pour cette raison, le protocole recommande la méthode hatch-off pour la synchronisation des v...

Les nématodes, en particulier les nématodes rhabditidés liés au système modèle Caenorhabditis elegans, constituent un merveilleux groupe d’animaux pour la biologie évolutive du développement (EDB) pour de nombreuses raisons 1,2. Les avantages comprennent leur petit nombre de cellules, leurs lignées cellulaires définies et cohérentes, leur transparence et leur facilité de culture et d’élevage. Il existe également de nombreuses ressources disponibles, y compris des génomes de haute qualité pour plusieurs espèces, et pour C. elegans, des outils de génétique moléculaire étendus et des connaissances sur le développement, la génétique, l’anatomie et la physiologie 3,4,5,6.
Comme pour beaucoup d’autres organismes, la capacité de caractériser la dynamique du transcriptome dans des tissus uniques ou des cellules individuelles a révolutionné l’analyse du développement chez C. elegans 7,8,9,10. Être capable de comparer des transcriptomes unicellulaires à travers des nématodes transformerait de la même manière l’EDB en utilisant ces organismes. Par exemple, de telles comparaisons permettraient de mieux comprendre comment les réseaux de régulation des gènes ont évolué pour les caractères (traits) qui ont été conservés, pour les caractères qui ont divergé ou pour les caractères qui ont évolué indépendamment.

Cependant, isoler des tissus ou des cellules particuliers des nématodes est l’un des grands défis. Pour de nombreux organismes, les cellules individuelles peuvent être dissociées des tissus et récoltées de manière impartiale ou peuvent être marquées avec l’expression tissulaire spécifique d’une protéine fluorescente et triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)11. Chez C. elegans, l’isolement cellulaire à haut débit (HTP) a été limité principalement aux embryons parce que la cuticule externe dure (et le squelette hydrostatique) a entravé l’isolement cellulaire des larves et des adultes. Pour contourner ce défi, certaines méthodes ont utilisé des outils génétiques chez des vers C. elegans entiers, tels que le marquage de l’ARNm12 spécifique aux tissus et les comparaisons d’expression différentielle entre le type sauvage et les mutants affectant un type cellulaire13. Des méthodes plus récentes ont surmonté le défi en dissolvant la cuticule pour isoler les noyaux14 ou des cellules entières 8,9,15. L’isolement cellulaire et la culture cellulaire présentent toutefois des inconvénients évidents : les cellules sont retirées de leur contexte naturel de développement ou anatomique – par exemple, loin de la signalisation cellule-cellule et du contact avec la matrice extracellulaire – ce qui devrait avoir un impact sur le profil d’expression génique15. De plus, les outils génétiques et les marqueurs spécifiques aux tissus sont spécifiques à l’espèce (c’est-à-dire qu’ils ne peuvent être utilisés que chez C. elegans).
LMD fournit une méthode alternative pour isoler les tissus sans perturber le contexte naturel des cellules. De manière significative pour l’EDB, la LMD permet également de comparer les transcriptomes de tissus homologues de différentes espèces sans avoir besoin de boîtes à outils génétiques spécifiques à l’espèce si des séquences de génome ou de transcriptome entier de ces espèces sont disponibles. La LMD consiste à cibler les tissus par observation microscopique directe et à utiliser un microfaisceau laser – intégré à l’optique du microscope – pour découper et récolter (capturer) le tissu d’intérêt16. Les limites de la LMD sont qu’elle n’est pas propice aux approches très HTP (bien que les profils de transcription pour les pointes de queue, tels que décrits dans ce protocole, étaient robustes avec environ 70 échantillons), certains échantillons peuvent être difficiles à disséquer et les coupes sont limitées à la précision du laser et à ce qui peut être visualisé au microscope.
Le but du présent protocole est de décrire comment la LMD, suivie de l’ARN-Seq à tissu unique, peut être utilisée pour obtenir des données sur le transcriptome spécifiques au stade et aux tissus à partir de nématodes. Plus précisément, il démontre que la LMD isole les extrémités de la queue des larves du quatrième stade (L4) de C. elegans. Cependant, cette méthode peut être adaptée à d’autres tissus et, bien sûr, à différentes espèces.
Chez C. elegans, il y a 4 cellules qui font le bout de la queue chez les mâles et les hermaphrodites. Au cours du stade L4 chez les mâles, mais pas chez les hermaphrodites, les cellules de la pointe de la queue changent de forme et migrent vers l’avant et vers l’intérieur. Ce processus se produit également chez certaines espèces de nématodes rhabditidés, mais pas chez toutes. Par conséquent, l’extrémité de la queue est un bon modèle pour l’évolution de la morphogenèse dimorphique sexuelle. En raison de sa position, l’extrémité de la queue est également facile à isoler par LMD.
Pour obtenir des profils de transcriptome à partir des extrémités de la queue, le présent protocole utilise CEL-Seq2, une méthode ARN-seq développée pour les cellules individuelles17,18. Cette méthode présente plusieurs avantages pour les tissus dérivés de la LMD. CEL-Seq2 est très sensible et efficace, utilisant des identificateurs moléculaires uniques (UMI) pour permettre une quantification simple des lectures d’ARNm, une transcription in vitro pour assurer une amplification linéaire et un codage à barres qui permet le multiplexage d’échantillons de tissus individuels. La seule limite de CEL-Seq2 est que les lectures récupérées sont biaisées à l’extrémité 3' des ARNm, et la plupart des isoformes ne peuvent donc pas être distinguées.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; 0,5 et micro ; Lames de verre à membrane M PEN sans RNase</td><td>Leica</td><td>11600288</td><td>pour LMD</td></tr><tr><td>500 & micro ; L Tubes PCR (sans nucléase)</td><td>Axygen</td><td>732-0675</td><td>pour couper les pointes de la queue en</td></tr><tr><td>Microscope composé avec objectif 40x et DIC</td><td>n’importe lequel</td><td></td><td>pour vérifier l’âge des vers</td></tr><tr><td>Humidificateur de bureau</td><td>n’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope de dissection avec base en lumière transmise</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>pour tous les vers de terre travail</td></tr><tr><td>verre pasteur pipettes</td><td>n’importe quelle</td><td></td><td>poignée de pic à vis</td></tr><tr><td>lames et lamelles en verre</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>pour vérifier l’âge des vers Système de</td></tr><tr><td>microdissection LMD6</td><td>Leica</td><td>multiple</td><td>pour couper les extrémités de la queue</td></tr><tr><td>Tubes LoBind 0,5 mL Eppendorf</td><td></td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>M9 Recette de tampon</td><td></td><td></td><td>dans WormBook</td></tr><tr><td>Methanol 99,8 %</td> <td>Sigma</td><td>322415</td><td>pour réparer les vers</td></tr><tr><td>Milieu de croissance NGM</td><td>US Des</td> tampons biologiques <td>N1000</td><td>et des sels doivent être ajoutés : Recette dans WormBook</td></tr><tr><td>P10 pipette à volume variable</td>, <td>par exemple Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000, pipette à volume variable</td>, <td>par exemple Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2, pipette à volume variable</td><td>, par exemple Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 1 000 & micro ; L</td><td>n’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette 1-10 & micro ; L filtré</td><td>n’importe quel</td> fil de platine et d’iridium Tritech PT-9010 pour rendre le <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>pic à vis</td></tr><tr><td>stérile et sans nucléase Tubes centrfuge de 1 mL</td><td>n’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Ajouter une très petite quantité au tampon M9 pour empêcher les vers de coller aux pointes de pipette</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri en plastique ventilées de 6 mm</td><td>n’importe quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de TapeStation Pour CEL-Seq2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4200 avec réactifs pour la détection haute sensibilité de l’ARN et de l’ADN</td><td>Système d’électrophorèse automatisé</td><td>Aligent</td><td></td></tr><tr><td>Perles AMPure XP Perles</td><td>de nettoyage d’ADN</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td></tr><tr><td>Tampon de liaison de billes PEG8000 20 %, amorces NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEL-Seq2 2,5 M (voir tableau S1)</td><td>Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf</td><td>6335000020</td><td>Thermocycleur avec couvercle programmable et bloc pour 200 &micro ; L tubes.</td></tr><tr><td>ADN polymérase I (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18052-025</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix 10 mM</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli ADN ligase</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT Pour PCR Nettoyage du produit</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td>solution d’exonucléase</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit de transcription</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>Pour l’étape 4.6.1</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>n’importe quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR haute fidélité Master Mix avec tampon HF</td><td>NEB</td><td>M0531</td><td>Mélange PCR étape 4.9.7</td></tr><tr><td>hexamère aléatoire RT amorce GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN</td><td>IDT</td><td></td><td>une amorce avec 6 nucléotides aléatoires ARN</td></tr><tr><td>Tampon de fragmentation</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’arrêt de fragmentation de l’ARN</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>AMORCES D’INDICE PCR DE L’ARN (RPI1&ndash ; RPI48)</td><td>Illumina, NEB ou IDT</td><td></td><td>RPIX à l’étape de protocole 4.9.7, séquences disponibles à partir des billes Illumina</td></tr><tr><td>RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Décontaminant de surface</td><td>Thermo Scientific</td><td>7000TS1</td><td>ou tout autre produit similaire</td></tr><tr><td>RNaseH (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Inhibiteur de la ribonucléase</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de deuxième brin</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Superscripit II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>transcriptase inverse</td></tr></tbody></table>

microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Les méthodologies unicellulaires ont révolutionné l’analyse des transcriptomes de types cellulaires spécifiques. Cependant, ils nécessitent souvent des « boîtes à outils » génétiques spécifiques à l’espèce, telles que des promoteurs conduisant à l’expression tissulaire spécifique des protéines fluorescentes. De plus, les protocoles qui perturbent les tissus pour isoler les cellules individuelles éliminent les cellules de leur environnement natif (par exemple, la signalisation des voisins) et peuvent entraîner des réponses au stress ou d’autres différences par rapport aux états d’expression des gènes natifs. Dans le présent protocole, la microdissection laser (LMD) est optimisée pour isoler les extrémités individuelles de la queue des nématodes pour l’étude de l’expression génique au cours de la morphogenèse de la pointe de la queue mâle.
LMD permet l’isolement d’une partie de l’animal sans avoir besoin de perturbation cellulaire ou de boîtes à outils spécifiques à l’espèce et est donc applicable à toutes les espèces. Par la suite, des protocoles de préparation de bibliothèque d’ARN-seq unicellulaires tels que CEL-Seq2 peuvent être appliqués à des tissus uniques isolés de LMD et analysés à l’aide de pipelines standard, étant donné qu’un génome ou un transcriptome bien annoté est disponible pour l’espèce. Ces données peuvent être utilisées pour établir dans quelle mesure les transcriptomes sont conservés ou différents qui sous-tendent le développement de ce tissu chez différentes espèces.
Les limites comprennent la capacité de découper le tissu d’intérêt et la taille de l’échantillon. Une analyse de puissance montre qu’aussi peu que 70 embouts de queue par condition sont nécessaires pour une puissance de 80%. Une synchronisation étroite du développement est nécessaire pour obtenir ce nombre d’animaux au même stade de développement. Ainsi, une méthode de synchronisation des animaux à des intervalles de 1 heure est également décrite.

Après la microdissection par capture laser, les extrémités individuelles de la queue des mâles et des hermaphrodites à 4 points temporels (L3 22 h après l’éclosion; L4 24, 26 et 28 h après l’éclosion) ont été préparés pour le séquençage de l’ARN à l’aide du protocole CEL-Seq2. Les amorces CEL-Seq2 contiennent des codes-barres uniques qui permettent d’identifier bioinformatiquement les lectures de séquençage d’un échantillon particulier (dans ce cas, une pointe de queue individuelle). Des données de séquençage ont été gén...

Un protocole est décrit qui utilise la microdissection laser pour isoler des tissus de nématodes individuels pour le séquençage de l’ARN. Le protocole ne nécessite pas de boîtes à outils génétiques spécifiques à l’espèce, ce qui permet de comparer les profils d’expression génique entre différentes espèces au niveau d’échantillons de tissus uniques.

Microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Nous combinons la microdissection de capture laser avec un protocole de recherche d’ARN à cellule unique appelé CEL-Seq2 pour générer des ensembles de données transcriptomiques pour de petits échantillons de tissus individuels. Cette technique nous permet d’étudier l’expression des gènes dans les tissus ou les espèces qui ne peuvent pas être étudiés à l’aide de méthodes traditionnelles de tri cellulaire. De plus, il offre plus de spécificité qu’une approche de séquençage d’ARN en vrac.Ici, nous avons démontré cette technique pour les quatre extrémités de la queue cellulaire des mâles et hermaphrodites du quatrième stade larvaire de C.elegans. Mais la beauté de cette approche est qu’elle peut même être appliquée à des espèces non modèles. Mme Raya Jallad, doctorante de mon laboratoire, et le Dr Antonio Herrera, scientifique biomédical en chef à l’école Baylor de Chattanooga, au Tennessee, feront la démonstration de la procédure.Commencez par pipeter doucement un à deux millilitres de tampon M9 contre la paroi de la plaque sans gicler. Faites tourbillonner la plaque pour déloger les vers. Retirez et jetez tout le liquide et les vers en plaçant la pointe de la pipette contre la paroi de la plaque au bord de la gélose pour éviter de percer des trous.Cette vidéo montre la plaque avant que les mères et les larves ne soient enlevées. Seuls les embryons doivent être laissés après le retrait des mères et des larves. La larve L1 commencera à apparaître après l’incubation pendant environ une heure.Ensuite, placez la plaque à 25 degrés Celsius. Après une heure, retirez la plaque de l’incubateur. Laissez tomber soigneusement un millilitre de tampon M9 sur la gélose et faites tourbillonner la plaque pour déloger les L1 mais pas les embryons.Centrifugez le tube et pipetez les L1 directement sur la pelouse bactérienne d’une plaque ensemencée. Gardez les vers à 25 degrés Celsius. Sous un microscope à dissection à grossissement de 30 à 50 X, commencez à prélever les mâles et les hermaphrodites des plaques de synchronisation sur des plaques séparées non assises.Les mâles se distinguent des hermaphrodites par la forme bombée et la couleur plus claire des queues mâles par rapport à la forme pointue et à la couleur plus foncée des queues hermaphrodites. Lavez les vers de la plaque avec un à deux millilitres de tampon M9 à l’aide d’une pointe de pipette prélavée avec un tampon M9 contenant 0,01% de détergent. Transférer les vers dans un tube de centrifugeuse d’un millilitre, tourner pendant une minute et ajouter un millilitre de tampon M9.Encore une fois, tournez pendant une minute. Ajouter un millilitre de méthanol glacé à 70% et bien mélanger. Répétez le lavage avec un millilitre de méthanol, mélangez bien.Faites-le tourner pendant une minute et ajoutez 500 microlitres de méthanol à 70%. Mélangez-le et conservez-le à quatre degrés Celsius pendant une heure ou toute la nuit. Pipette 20 microlitres des vers fixes sur le côté revêtu d’une lame de verre en polyéthylène naphtalate ou à membrane PEN.Attendez que le méthanol s’évapore. Retirez le bouclier en plastique au-dessus de la scène et cliquez sur le bouton de déchargement avec la flèche vers le haut pour charger les glissières de membrane. Assurez-vous que la glissière est complètement sèche, retournez de sorte que la membrane soit tournée vers le bas et insérez la glissière.Cliquez sur Continuer dans la fenêtre Modifier l’échantillon. Le support de diapositive se déplacera. Ensuite, remplacez le bouclier en plastique, en bas de l’écran, choisissez quel support de diapositive contient la diapositive et cliquez sur le bouton de déchargement avec la flèche vers le bas pour charger les tubes.Retirez le plateau et retirez le bloc de tube. Insérez les capuchons de quatre tubes PCR de 500 microlitres dans le support et pliez le tube en dessous. Retournez le bloc dans le plateau et faites-le glisser dans l’étage du microscope.Dans la fenêtre contextuelle du périphérique collecteur de modifications, sélectionnez Tubes PCR, puis cliquez sur OK. Cliquez sur l’emplacement du tube vide en bas à gauche de l’écran sous les capuchons du tube du dispositif collecteur et dans le panneau de commande du microscope, sélectionnez TLBF pour l’éclairage en champ lumineux de la lumière transmise. À l’aide de l’objectif 2,5X, ajustez la mise au point jusqu’à ce que les vers et la structure de surface de la membrane PEN soient visibles.Passez à l’objectif 20X et déplacez la scène dans une région sans vers. Ajustez la mise au point de manière à ce que les structures en forme de bulle dans la membrane aient une couleur jaunâtre pour focaliser le laser sur le plan focal correct, puis définissez les paramètres du laser. Pour les pointes de queue, commencez par la puissance 45 ouverture 30 en vitesse 20.Dans le panneau de commande laser, sélectionnez calibrer et suivez les instructions. Ensuite, en bas de l’écran, au niveau des capuchons de tube du dispositif collecteur, cliquez sur la position A, sur le côté droit de l’écran, sélectionnez une forme unique, puis dessinez et coupez. Sélectionnez ensuite point à point et tracez une ligne.Cliquez sur Démarrer la découpe pour que le laser coupe à travers la membrane. Trouvez un ver et basculez pour déplacer et couper. Utilisez la souris pour couper à travers la queue.Pour collecter l’échantillon, passez au réglage de dessin et de coupe avec la fonction point à point et dessinez la forme pour terminer la coupe d’une section de membrane. Sélectionnez le tube suivant au niveau du capuchon du tube du dispositif collecteur au bas de l’écran et coupez l’embout de queue suivant. Une fois que quatre queues sont coupées, déchargez le porte-tubes en cliquant sur décharger avec la flèche vers le bas.Trouvez les sections de membrane sous un microscope à dissection et poursuivez le traitement de l’échantillon en aval. Ici séquençage de l’ARN avec CEL-Seq2. Pipette 1,2 microlitre d’un mélange maître d’apprêt CEL-Seq2 directement sur le dessus de l’échantillon et fermer le tube.Étiquetez avec le numéro d’apprêt et placez immédiatement le bouchon du tube directement sur un morceau de glace carbonique pour geler l’échantillon, empêchant ainsi la dégradation de l’ARN. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les échantillons aient été prélevés. Enfin, stockez les tubes à moins 70 degrés Celsius.C.elegans L3 hermaphrodites et mâles à 21 à 23 heures après l’éclosion peuvent être distingués au microscope à dissection par la morphologie de leur queue. L’histoire de l’hermaphrodite est étroite tandis que celle des mâles est enflée et semble claire. L’apparence de la structure de la glissière de la membrane PEN et de la queue du ver est montrée dans ces images.Ici, la mise au point est correcte pour les objectifs 20X et 40X au microscope. La queue disséquée découpée de manière impartiale de la membrane PEN est visible ici. Après avoir comblé l’espace dans la coupe, la pièce de membrane tombera dans le capuchon du tube sous la glissière.Un capuchon de tube avec une section de membrane PEN contenant une extrémité de queue disséquée est montré ici. L’image graphique représente l’identificateur moléculaire unique transformé par log naturel ou le nombre d’UMI par extrémité de queue individuelle pour différents points temporels et sexes. Le logiciel powsimR est utilisé pour déterminer combien d’échantillons indépendants sont nécessaires pour détecter les gènes exprimés différentiellement ou DE à différents niveaux d’expression.L’image graphique ici représente le taux positif réel pour détecter les gènes DE entre deux conditions pour quatre simulations différentes incorporant différentes tailles d’échantillon par condition. La ligne pointillée indique un taux positif réel de 80 %. Le taux de fausses découvertes et les quatre mêmes simulations sont montrés ici.La ligne pointillée indique un taux de fausse découverte de 10 %. Les graphiques ont montré qu’une taille d’échantillon de 70 extrémités de queue par condition est suffisante pour détecter les gènes DE, à l’exception des gènes avec de très faibles niveaux d’expression. Pour une bonne synchronisation, assurez-vous que seuls les embryons sont présents sur la plaque.Pour éviter toute perte d’échantillon, pipettez le mélange d’apprêt directement sur la section de la membrane PEN dans le capuchon et soyez extrêmement doux en fermant le bouchon. Parce qu’il est indépendant des espèces, nous pouvons utiliser ce protocole pour explorer comment les réseaux de régulation des gènes ont évolué pour les structures homologues chez différentes espèces.

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