Name: Microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Découvrez la microdissection laser couplée au protocole CEL-Seq2 pour l'analyse transcriptomique de tissus individuels chez C. elegans. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique sans outils génétiques spécifiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été financé par les subventions des NIH (R01GM141395) et de la NSF (1656736) à DF et des bourses NIH (F32GM136170) à AW. La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender.com.

<ol><li>Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+%26%2334%3Bthe+worm%26%2334%3B+to+%26%2334%3Bthe+worms%26%2334%3B+and+back+again%3A+the+evolutionary+developmental+biology+of+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">From &#34;the worm&#34; to &#34;the worms&#34; and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes.</a> Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).</li>
<li>Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+model+systems+in+evolution+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nematode model systems in evolution and development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).</li>
<li>WormBase. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wormbase.org/#012-3-6">https://wormbase.org/#012-3-6</a> (2022).</li>
<li>WormAtlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wormatlas.org">https://wormatlas.org</a> (2022).</li>
<li>WormBook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://wormbook.org">http://wormbook.org</a> (2022).</li>
<li>WormBook in Genetics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook">https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook</a> (2022).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li>
<li>Kaletsky, R., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+C.+elegans+adult+cells+and+tissues+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).</li>
<li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 365 (6459), 1971(2019).</li>
<li>Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+bulk%3A+a+review+of+single+cell+transcriptomics+methodologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).</li>
<li>Von Stetina, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+microarray+profiling+experiments+reveal+a+comprehensive+picture+of+gene+expression+in+the+C.+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system.</a> Genome Biology. 8 (7), 135(2007).</li>
<li>Baugh, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeodomain+protein+PAL-1+specifies+a+lineage-specific+regulatory+network+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo.</a> Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).</li>
<li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3%27-end-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).</li>
<li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLoS One. 6 (4), 19505(2011).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Yanai, I., Hashimshony, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2-single-cell+RNA+sequencing+by+multiplexed+linear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification.</a> Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019(2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+grow+or+not+to+grow%3A+nutritional+control+of+development+during+Caenorhabditis+elegans+L1+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest.</a> Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+responses+throughout+the+Caenorhabditis+elegans+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle.</a> Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).</li>
<li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li>
<li>Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+defined+sub-stages+of+C.+elegans+vulval+development+in+the+fourth+larval+stage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage.</a> BMC Developmental Biology. 15, 26(2015).</li>
<li>Lytal, N., Ran, D., An, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+methods+on+single-cell+RNA-seq+data%3A+an+empirical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey.</a> Frontiers in Genetics. 11, 41(2020).</li>
<li>Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((powsimR%3A+power+analysis+for+bulk+and+single+cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).</li>
<li>Bolkova, J., Lanctot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+expression+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+using+single+molecule+RNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH.</a> Methods. 98, 42-49 (2016).</li>
<li>Ji, N., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+of+C.+elegans+worms+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos.</a> WormBook. , 1-16 (2012).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 7 (12), 2357(2017).</li>
<li>Baird, S. E., Chamberlin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+briggsae+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis briggsae methods.</a> WormBook. , 1-9 (2006).</li>
<li>Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+tipulae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Oscheius tipulae.</a> WormBook. , 1-8 (2006).</li>
<li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+transgenesis+efficiency+and+CRISPR-associated+tools+through+codon+optimization+and+native+intron+addition+in+Pristionchus+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes.</a> Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).</li>
<li>Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+dissociation+protocol+for+FACS-based+isolation+of+rare+cell+types+from+Caenorhabditis+elegans+L1+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae.</a> MethodsX. 7, 100922(2020).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
<li>Steiner, F. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+affinity+purification+of+nuclei+for+chromatin+profiling+in+whole+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).</li>
<li>Ebbing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).</li>
<li>Rödelsperger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+nematodes+identifies+sperm+cells+as+a+source+of+genomic+novelty+and+rapid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution.</a> Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
</ol>

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Étapes critiques de la méthode Si elle est effectuée correctement, la méthode décrite ici permettra d’obtenir des profils d’ARN robustes avec un nombre relativement faible d’échantillons disséqués au laser (70 pointes de queue dans cet exemple). Cependant, pour les échantillons provenant d’animaux en développement, une synchronisation étroite est essentielle pour réduire la variabilité entre les échantillons. Pour cette raison, le protocole recommande la méthode hatch-off pour la synchronisation des v...

Les nématodes, en particulier les nématodes rhabditidés liés au système modèle Caenorhabditis elegans, constituent un merveilleux groupe d’animaux pour la biologie évolutive du développement (EDB) pour de nombreuses raisons 1,2. Les avantages comprennent leur petit nombre de cellules, leurs lignées cellulaires définies et cohérentes, leur transparence et leur facilité de culture et d’élevage. Il existe également de nombreuses ressources disponibles, y compris des génomes de haute qualité pour plusieurs espèces, et pour C. elegans, des outils de génétique moléculaire étendus et des connaissances sur le développement, la génétique, l’anatomie et la physiologie 3,4,5,6.
Comme pour beaucoup d’autres organismes, la capacité de caractériser la dynamique du transcriptome dans des tissus uniques ou des cellules individuelles a révolutionné l’analyse du développement chez C. elegans 7,8,9,10. Être capable de comparer des transcriptomes unicellulaires à travers des nématodes transformerait de la même manière l’EDB en utilisant ces organismes. Par exemple, de telles comparaisons permettraient de mieux comprendre comment les réseaux de régulation des gènes ont évolué pour les caractères (traits) qui ont été conservés, pour les caractères qui ont divergé ou pour les caractères qui ont évolué indépendamment.

Cependant, isoler des tissus ou des cellules particuliers des nématodes est l’un des grands défis. Pour de nombreux organismes, les cellules individuelles peuvent être dissociées des tissus et récoltées de manière impartiale ou peuvent être marquées avec l’expression tissulaire spécifique d’une protéine fluorescente et triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)11. Chez C. elegans, l’isolement cellulaire à haut débit (HTP) a été limité principalement aux embryons parce que la cuticule externe dure (et le squelette hydrostatique) a entravé l’isolement cellulaire des larves et des adultes. Pour contourner ce défi, certaines méthodes ont utilisé des outils génétiques chez des vers C. elegans entiers, tels que le marquage de l’ARNm12 spécifique aux tissus et les comparaisons d’expression différentielle entre le type sauvage et les mutants affectant un type cellulaire13. Des méthodes plus récentes ont surmonté le défi en dissolvant la cuticule pour isoler les noyaux14 ou des cellules entières 8,9,15. L’isolement cellulaire et la culture cellulaire présentent toutefois des inconvénients évidents : les cellules sont retirées de leur contexte naturel de développement ou anatomique – par exemple, loin de la signalisation cellule-cellule et du contact avec la matrice extracellulaire – ce qui devrait avoir un impact sur le profil d’expression génique15. De plus, les outils génétiques et les marqueurs spécifiques aux tissus sont spécifiques à l’espèce (c’est-à-dire qu’ils ne peuvent être utilisés que chez C. elegans).
LMD fournit une méthode alternative pour isoler les tissus sans perturber le contexte naturel des cellules. De manière significative pour l’EDB, la LMD permet également de comparer les transcriptomes de tissus homologues de différentes espèces sans avoir besoin de boîtes à outils génétiques spécifiques à l’espèce si des séquences de génome ou de transcriptome entier de ces espèces sont disponibles. La LMD consiste à cibler les tissus par observation microscopique directe et à utiliser un microfaisceau laser – intégré à l’optique du microscope – pour découper et récolter (capturer) le tissu d’intérêt16. Les limites de la LMD sont qu’elle n’est pas propice aux approches très HTP (bien que les profils de transcription pour les pointes de queue, tels que décrits dans ce protocole, étaient robustes avec environ 70 échantillons), certains échantillons peuvent être difficiles à disséquer et les coupes sont limitées à la précision du laser et à ce qui peut être visualisé au microscope.
Le but du présent protocole est de décrire comment la LMD, suivie de l’ARN-Seq à tissu unique, peut être utilisée pour obtenir des données sur le transcriptome spécifiques au stade et aux tissus à partir de nématodes. Plus précisément, il démontre que la LMD isole les extrémités de la queue des larves du quatrième stade (L4) de C. elegans. Cependant, cette méthode peut être adaptée à d’autres tissus et, bien sûr, à différentes espèces.
Chez C. elegans, il y a 4 cellules qui font le bout de la queue chez les mâles et les hermaphrodites. Au cours du stade L4 chez les mâles, mais pas chez les hermaphrodites, les cellules de la pointe de la queue changent de forme et migrent vers l’avant et vers l’intérieur. Ce processus se produit également chez certaines espèces de nématodes rhabditidés, mais pas chez toutes. Par conséquent, l’extrémité de la queue est un bon modèle pour l’évolution de la morphogenèse dimorphique sexuelle. En raison de sa position, l’extrémité de la queue est également facile à isoler par LMD.
Pour obtenir des profils de transcriptome à partir des extrémités de la queue, le présent protocole utilise CEL-Seq2, une méthode ARN-seq développée pour les cellules individuelles17,18. Cette méthode présente plusieurs avantages pour les tissus dérivés de la LMD. CEL-Seq2 est très sensible et efficace, utilisant des identificateurs moléculaires uniques (UMI) pour permettre une quantification simple des lectures d’ARNm, une transcription in vitro pour assurer une amplification linéaire et un codage à barres qui permet le multiplexage d’échantillons de tissus individuels. La seule limite de CEL-Seq2 est que les lectures récupérées sont biaisées à l’extrémité 3' des ARNm, et la plupart des isoformes ne peuvent donc pas être distinguées.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; 0,5 et micro ; Lames de verre à membrane M PEN sans RNase</td><td>Leica</td><td>11600288</td><td>pour LMD</td></tr><tr><td>500 & micro ; L Tubes PCR (sans nucléase)</td><td>Axygen</td><td>732-0675</td><td>pour couper les pointes de la queue en</td></tr><tr><td>Microscope composé avec objectif 40x et DIC</td><td>n’importe lequel</td><td></td><td>pour vérifier l’âge des vers</td></tr><tr><td>Humidificateur de bureau</td><td>n’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope de dissection avec base en lumière transmise</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>pour tous les vers de terre travail</td></tr><tr><td>verre pasteur pipettes</td><td>n’importe quelle</td><td></td><td>poignée de pic à vis</td></tr><tr><td>lames et lamelles en verre</td><td>n’importe quel</td><td></td><td>pour vérifier l’âge des vers Système de</td></tr><tr><td>microdissection LMD6</td><td>Leica</td><td>multiple</td><td>pour couper les extrémités de la queue</td></tr><tr><td>Tubes LoBind 0,5 mL Eppendorf</td><td></td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>M9 Recette de tampon</td><td></td><td></td><td>dans WormBook</td></tr><tr><td>Methanol 99,8 %</td> <td>Sigma</td><td>322415</td><td>pour réparer les vers</td></tr><tr><td>Milieu de croissance NGM</td><td>US Des</td> tampons biologiques <td>N1000</td><td>et des sels doivent être ajoutés : Recette dans WormBook</td></tr><tr><td>P10 pipette à volume variable</td>, <td>par exemple Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000, pipette à volume variable</td>, <td>par exemple Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2, pipette à volume variable</td><td>, par exemple Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 1 000 & micro ; L</td><td>n’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette 1-10 & micro ; L filtré</td><td>n’importe quel</td> fil de platine et d’iridium Tritech PT-9010 pour rendre le <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>pic à vis</td></tr><tr><td>stérile et sans nucléase Tubes centrfuge de 1 mL</td><td>n’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Ajouter une très petite quantité au tampon M9 pour empêcher les vers de coller aux pointes de pipette</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri en plastique ventilées de 6 mm</td><td>n’importe quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de TapeStation Pour CEL-Seq2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4200 avec réactifs pour la détection haute sensibilité de l’ARN et de l’ADN</td><td>Système d’électrophorèse automatisé</td><td>Aligent</td><td></td></tr><tr><td>Perles AMPure XP Perles</td><td>de nettoyage d’ADN</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td></tr><tr><td>Tampon de liaison de billes PEG8000 20 %, amorces NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEL-Seq2 2,5 M (voir tableau S1)</td><td>Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf</td><td>6335000020</td><td>Thermocycleur avec couvercle programmable et bloc pour 200 &micro ; L tubes.</td></tr><tr><td>ADN polymérase I (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18052-025</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix 10 mM</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli ADN ligase</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT Pour PCR Nettoyage du produit</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td>solution d’exonucléase</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit de transcription</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>Pour l’étape 4.6.1</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>n’importe quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR haute fidélité Master Mix avec tampon HF</td><td>NEB</td><td>M0531</td><td>Mélange PCR étape 4.9.7</td></tr><tr><td>hexamère aléatoire RT amorce GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN</td><td>IDT</td><td></td><td>une amorce avec 6 nucléotides aléatoires ARN</td></tr><tr><td>Tampon de fragmentation</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’arrêt de fragmentation de l’ARN</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>AMORCES D’INDICE PCR DE L’ARN (RPI1&ndash ; RPI48)</td><td>Illumina, NEB ou IDT</td><td></td><td>RPIX à l’étape de protocole 4.9.7, séquences disponibles à partir des billes Illumina</td></tr><tr><td>RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Décontaminant de surface</td><td>Thermo Scientific</td><td>7000TS1</td><td>ou tout autre produit similaire</td></tr><tr><td>RNaseH (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Inhibiteur de la ribonucléase</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de deuxième brin</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Superscripit II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>transcriptase inverse</td></tr></tbody></table>

microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Les méthodologies unicellulaires ont révolutionné l’analyse des transcriptomes de types cellulaires spécifiques. Cependant, ils nécessitent souvent des « boîtes à outils » génétiques spécifiques à l’espèce, telles que des promoteurs conduisant à l’expression tissulaire spécifique des protéines fluorescentes. De plus, les protocoles qui perturbent les tissus pour isoler les cellules individuelles éliminent les cellules de leur environnement natif (par exemple, la signalisation des voisins) et peuvent entraîner des réponses au stress ou d’autres différences par rapport aux états d’expression des gènes natifs. Dans le présent protocole, la microdissection laser (LMD) est optimisée pour isoler les extrémités individuelles de la queue des nématodes pour l’étude de l’expression génique au cours de la morphogenèse de la pointe de la queue mâle.
LMD permet l’isolement d’une partie de l’animal sans avoir besoin de perturbation cellulaire ou de boîtes à outils spécifiques à l’espèce et est donc applicable à toutes les espèces. Par la suite, des protocoles de préparation de bibliothèque d’ARN-seq unicellulaires tels que CEL-Seq2 peuvent être appliqués à des tissus uniques isolés de LMD et analysés à l’aide de pipelines standard, étant donné qu’un génome ou un transcriptome bien annoté est disponible pour l’espèce. Ces données peuvent être utilisées pour établir dans quelle mesure les transcriptomes sont conservés ou différents qui sous-tendent le développement de ce tissu chez différentes espèces.
Les limites comprennent la capacité de découper le tissu d’intérêt et la taille de l’échantillon. Une analyse de puissance montre qu’aussi peu que 70 embouts de queue par condition sont nécessaires pour une puissance de 80%. Une synchronisation étroite du développement est nécessaire pour obtenir ce nombre d’animaux au même stade de développement. Ainsi, une méthode de synchronisation des animaux à des intervalles de 1 heure est également décrite.

Après la microdissection par capture laser, les extrémités individuelles de la queue des mâles et des hermaphrodites à 4 points temporels (L3 22 h après l’éclosion; L4 24, 26 et 28 h après l’éclosion) ont été préparés pour le séquençage de l’ARN à l’aide du protocole CEL-Seq2. Les amorces CEL-Seq2 contiennent des codes-barres uniques qui permettent d’identifier bioinformatiquement les lectures de séquençage d’un échantillon particulier (dans ce cas, une pointe de queue individuelle). Des données de séquençage ont été gén...

Un protocole est décrit qui utilise la microdissection laser pour isoler des tissus de nématodes individuels pour le séquençage de l’ARN. Le protocole ne nécessite pas de boîtes à outils génétiques spécifiques à l’espèce, ce qui permet de comparer les profils d’expression génique entre différentes espèces au niveau d’échantillons de tissus uniques.

Microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Nous combinons la microdissection de capture laser avec un protocole de recherche d’ARN à cellule unique appelé CEL-Seq2 pour générer des ensembles de données transcriptomiques pour de petits échantillons de tissus individuels. Cette technique nous permet d’étudier l’expression des gènes dans les tissus ou les espèces qui ne peuvent pas être étudiés à l’aide de méthodes traditionnelles de tri cellulaire. De plus, il offre plus de spécificité qu’une approche de séquençage d’ARN en vrac.Ici, nous avons démontré cette technique pour les quatre extrémités de la queue cellulaire des mâles et hermaphrodites du quatrième stade larvaire de C.elegans. Mais la beauté de cette approche est qu’elle peut même être appliquée à des espèces non modèles. Mme Raya Jallad, doctorante de mon laboratoire, et le Dr Antonio Herrera, scientifique biomédical en chef à l’école Baylor de Chattanooga, au Tennessee, feront la démonstration de la procédure.Commencez par pipeter doucement un à deux millilitres de tampon M9 contre la paroi de la plaque sans gicler. Faites tourbillonner la plaque pour déloger les vers. Retirez et jetez tout le liquide et les vers en plaçant la pointe de la pipette contre la paroi

laser-microdissection-for-species-agnostic-single-tissue-applications

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Microdissection laser des tissus de mammifères

La vidéo décrit la dissection laser du modèle de co-culture organotypique 3D avec une précision au micron. Dans les modèles organotypiques 3D, les constituants stromaux tels que les fibroblastes sont co-cultivés en 3 dimensions avec des cellules épithéliales cancéreuses. Le modèle 3D sert d’outil expérimental qui permet d’étudier l’invasion et les interactions cancer-stroma dans des conditions quasi physiologiques.

Microdissection laser : une technique pour isoler les cellules envahissantes du cancer colorectal à partir d’un modèle de culture organotypique 3D

Cette vidéo décrit la technique d’obtention d’une cellule unique à partir d’une population cellulaire hétérogène à l’aide de la microdissection par capture laser. La cellule isolée peut être utilisée pour d’autres études génomiques ou des recherches sur le cancer.

Échantillonnage de cellules uniques à l’aide de la microdissection par capture laser : une technique pour récolter des cellules cibles d’une population cellulaire hétérogène

Microdissection a été largement utilisé pour l'examen de l'ADN, de l'ARN et de la protéine dans le tissu. microscopie de capture laser (LCM) est la méthode la plus couramment utilisée, mais une nouvelle technique de fraisage, mesodissection, est disponible depuis peu. Nous démontrons extraction d'ARN à partir mesodissected formol paraffine fixe des lames de tissus intégrés de granulomes de Mycobacterium tuberculosis.

Une nouvelle approche microdissection de la récupération<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Transcriptions spécifiques de formol paraffine fixe embarqué poumon granulomes

L'isolement des neurones dopaminergiques individuels ou l'aire tegmentale ventrale par immunohistochimie directe ou indirecte est démontrée en utilisant microdissection laser. Les paramètres pour l'isolement d'un tissu à partir d'une lame de verre en utilisant un laser infrarouge et de diapositives membrane en utilisant la combinaison d'un laser infrarouge et ultraviolet sont discutés.

Microdissection laser - une démonstration de l&#39;isolement de la dopamine neurones individuels et de l&#39;Espace ventrale tegmentale entière

Nous présentons ici un protocole de microdissection assistée par laser de types spécifiques de cellules végétales pour le profilage transcriptionnel. Bien que le protocole convienne à différentes espèces et types de cellules, l’accent est mis sur les cellules hautement inaccessibles de la lignée germinale féminine importantes pour la reproduction sexuée et apomictique dans le genre de crucifères Boechera.

assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels

La microdissection laser (LMD) est une technique sensible et hautement reproductible qui peut être utilisée pour découvrir des voies qui médité glioma hétérogénéité et invasion. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour isoler les zones discrètes du tissu de gliome utilisant le LMD laser suivi de l’analyse transcriptomique.

Microdissection laser de sous-régions de Glioma pour la caractérisation spatiale et moléculaire de l’hétérogénéité intratumorale, des oncostreams et de l’invasion

Ce protocole décrit un flux de travail à haut débit pour la segmentation basée sur l’intelligence artificielle des régions d’intérêt confirmées par la pathologie à partir d’images de coupes de tissus minces et colorées pour l’enrichissement des populations cellulaires résolues par histologie à l’aide de la microdissection laser. Cette stratégie comprend un nouvel algorithme permettant le transfert de démarcations désignant des populations cellulaires d’intérêt directement aux microscopes laser.

Microdissection laser industrialisée guidée par l’intelligence artificielle pour l’analyse protéomique à micro-échelle du microenvironnement tumoral

La microdissection par capture laser des tissus de fibrose sous-muqueuse buccale permet d’extraire avec précision des cellules des régions histologiques d’intérêt pour l’analyse de données multi-omiques avec des informations morphologiques et spatiales.

Isolement de cellules avec des informations morphologiques et spatiales à partir d’échantillons de fibrose sous-muqueuse buccale par microdissection par capture laser

Ce protocole décrit une méthode pour isoler l’ARN à partir de régions histologiques définies de tissu hépatique de souris fixé au paraformaldéhyde et à la température optimale de coupe, en utilisant une microdissection par capture laser, permettant une analyse ciblée de l’expression génique en aval.

Microdissection par capture laser du tissu hépatique de souris fixé au paraformodéhyde pour l’analyse de l’ARN

Découvrez la microdissection laser couplée au protocole CEL-Seq2 pour l'analyse transcriptomique de tissus individuels chez C. elegans. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique sans outils génétiques spécifiques.

Microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces

Explorer plus de vidéos