Microdissection laser pour les applications mono-tissulaires indépendantes des espèces

Nous combinons la microdissection de capture laser avec un protocole de recherche d’ARN à cellule unique appelé CEL-Seq2 pour générer des ensembles de données transcriptomiques pour de petits échantillons de tissus individuels. Cette technique nous permet d’étudier l’expression des gènes dans les tissus ou les espèces qui ne peuvent pas être étudiés à l’aide de méthodes traditionnelles de tri cellulaire. De plus, il offre plus de spécificité qu’une approche de séquençage d’ARN en vrac.

Ici, nous avons démontré cette technique pour les quatre extrémités de la queue cellulaire des mâles et hermaphrodites du quatrième stade larvaire de C.elegans. Mais la beauté de cette approche est qu’elle peut même être appliquée à des espèces non modèles. Mme Raya Jallad, doctorante de mon laboratoire, et le Dr Antonio Herrera, scientifique biomédical en chef à l’école Baylor de Chattanooga, au Tennessee, feront la démonstration de la procédure.

Commencez par pipeter doucement un à deux millilitres de tampon M9 contre la paroi de la plaque sans gicler. Faites tourbillonner la plaque pour déloger les vers. Retirez et jetez tout le liquide et les vers en plaçant la pointe de la pipette contre la paroi de la plaque au bord de la gélose pour éviter de percer des trous.

Cette vidéo montre la plaque avant que les mères et les larves ne soient enlevées. Seuls les embryons doivent être laissés après le retrait des mères et des larves. La larve L1 commencera à apparaître après l’incubation pendant environ une heure.

Ensuite, placez la plaque à 25 degrés Celsius. Après une heure, retirez la plaque de l’incubateur. Laissez tomber soigneusement un millilitre de tampon M9 sur la gélose et faites tourbillonner la plaque pour déloger les L1 mais pas les embryons.

Centrifugez le tube et pipetez les L1 directement sur la pelouse bactérienne d’une plaque ensemencée. Gardez les vers à 25 degrés Celsius. Sous un microscope à dissection à grossissement de 30 à 50 X, commencez à prélever les mâles et les hermaphrodites des plaques de synchronisation sur des plaques séparées non assises.

Les mâles se distinguent des hermaphrodites par la forme bombée et la couleur plus claire des queues mâles par rapport à la forme pointue et à la couleur plus foncée des queues hermaphrodites. Lavez les vers de la plaque avec un à deux millilitres de tampon M9 à l’aide d’une pointe de pipette prélavée avec un tampon M9 contenant 0,01% de détergent. Transférer les vers dans un tube de centrifugeuse d’un millilitre, tourner pendant une minute et ajouter un millilitre de tampon M9.

Encore une fois, tournez pendant une minute. Ajouter un millilitre de méthanol glacé à 70% et bien mélanger. Répétez le lavage avec un millilitre de méthanol, mélangez bien.

Faites-le tourner pendant une minute et ajoutez 500 microlitres de méthanol à 70%. Mélangez-le et conservez-le à quatre degrés Celsius pendant une heure ou toute la nuit. Pipette 20 microlitres des vers fixes sur le côté revêtu d’une lame de verre en polyéthylène naphtalate ou à membrane PEN.

Attendez que le méthanol s’évapore. Retirez le bouclier en plastique au-dessus de la scène et cliquez sur le bouton de déchargement avec la flèche vers le haut pour charger les glissières de membrane. Assurez-vous que la glissière est complètement sèche, retournez de sorte que la membrane soit tournée vers le bas et insérez la glissière.

Cliquez sur Continuer dans la fenêtre Modifier l’échantillon. Le support de diapositive se déplacera. Ensuite, remplacez le bouclier en plastique, en bas de l’écran, choisissez quel support de diapositive contient la diapositive et cliquez sur le bouton de déchargement avec la flèche vers le bas pour charger les tubes.

Retirez le plateau et retirez le bloc de tube. Insérez les capuchons de quatre tubes PCR de 500 microlitres dans le support et pliez le tube en dessous. Retournez le bloc dans le plateau et faites-le glisser dans l’étage du microscope.

Dans la fenêtre contextuelle du périphérique collecteur de modifications, sélectionnez Tubes PCR, puis cliquez sur OK. Cliquez sur l’emplacement du tube vide en bas à gauche de l’écran sous les capuchons du tube du dispositif collecteur et dans le panneau de commande du microscope, sélectionnez TLBF pour l’éclairage en champ lumineux de la lumière transmise. À l’aide de l’objectif 2,5X, ajustez la mise au point jusqu’à ce que les vers et la structure de surface de la membrane PEN soient visibles.

Passez à l’objectif 20X et déplacez la scène dans une région sans vers. Ajustez la mise au point de manière à ce que les structures en forme de bulle dans la membrane aient une couleur jaunâtre pour focaliser le laser sur le plan focal correct, puis définissez les paramètres du laser. Pour les pointes de queue, commencez par la puissance 45 ouverture 30 en vitesse 20.

Dans le panneau de commande laser, sélectionnez calibrer et suivez les instructions. Ensuite, en bas de l’écran, au niveau des capuchons de tube du dispositif collecteur, cliquez sur la position A, sur le côté droit de l’écran, sélectionnez une forme unique, puis dessinez et coupez. Sélectionnez ensuite point à point et tracez une ligne.

Cliquez sur Démarrer la découpe pour que le laser coupe à travers la membrane. Trouvez un ver et basculez pour déplacer et couper. Utilisez la souris pour couper à travers la queue.

Pour collecter l’échantillon, passez au réglage de dessin et de coupe avec la fonction point à point et dessinez la forme pour terminer la coupe d’une section de membrane. Sélectionnez le tube suivant au niveau du capuchon du tube du dispositif collecteur au bas de l’écran et coupez l’embout de queue suivant. Une fois que quatre queues sont coupées, déchargez le porte-tubes en cliquant sur décharger avec la flèche vers le bas.

Trouvez les sections de membrane sous un microscope à dissection et poursuivez le traitement de l’échantillon en aval. Ici séquençage de l’ARN avec CEL-Seq2. Pipette 1,2 microlitre d’un mélange maître d’apprêt CEL-Seq2 directement sur le dessus de l’échantillon et fermer le tube.

Étiquetez avec le numéro d’apprêt et placez immédiatement le bouchon du tube directement sur un morceau de glace carbonique pour geler l’échantillon, empêchant ainsi la dégradation de l’ARN. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les échantillons aient été prélevés. Enfin, stockez les tubes à moins 70 degrés Celsius.

C.elegans L3 hermaphrodites et mâles à 21 à 23 heures après l’éclosion peuvent être distingués au microscope à dissection par la morphologie de leur queue. L’histoire de l’hermaphrodite est étroite tandis que celle des mâles est enflée et semble claire. L’apparence de la structure de la glissière de la membrane PEN et de la queue du ver est montrée dans ces images.

Ici, la mise au point est correcte pour les objectifs 20X et 40X au microscope. La queue disséquée découpée de manière impartiale de la membrane PEN est visible ici. Après avoir comblé l’espace dans la coupe, la pièce de membrane tombera dans le capuchon du tube sous la glissière.

Un capuchon de tube avec une section de membrane PEN contenant une extrémité de queue disséquée est montré ici. L’image graphique représente l’identificateur moléculaire unique transformé par log naturel ou le nombre d’UMI par extrémité de queue individuelle pour différents points temporels et sexes. Le logiciel powsimR est utilisé pour déterminer combien d’échantillons indépendants sont nécessaires pour détecter les gènes exprimés différentiellement ou DE à différents niveaux d’expression.

L’image graphique ici représente le taux positif réel pour détecter les gènes DE entre deux conditions pour quatre simulations différentes incorporant différentes tailles d’échantillon par condition. La ligne pointillée indique un taux positif réel de 80 %. Le taux de fausses découvertes et les quatre mêmes simulations sont montrés ici.

La ligne pointillée indique un taux de fausse découverte de 10 %. Les graphiques ont montré qu’une taille d’échantillon de 70 extrémités de queue par condition est suffisante pour détecter les gènes DE, à l’exception des gènes avec de très faibles niveaux d’expression. Pour une bonne synchronisation, assurez-vous que seuls les embryons sont présents sur la plaque.

Pour éviter toute perte d’échantillon, pipettez le mélange d’apprêt directement sur la section de la membrane PEN dans le capuchon et soyez extrêmement doux en fermant le bouchon. Parce qu’il est indépendant des espèces, nous pouvons utiliser ce protocole pour explorer comment les réseaux de régulation des gènes ont évolué pour les structures homologues chez différentes espèces.