Étude de l’interaction spatiale entre les astrocytes et les neurones dans les cerveaux nettoyés

La technique de clarté décrite pour la première fois en 2013 est une technique de nettoyage des tissus qui permet d’échantillonner de plus grandes quantités de cellules, de vaisseaux sanguins, de sorte que même des protéines une résolution cellulaire unique dans des tranches de cerveau épaisses. Cette technique permet d’étudier des structures microscopiques intactes en rendant l’ensemble du cerveau transparent. Ce protocole est une puce simple et un pipeline direct pour les tissus clairs.

Cette technique peut être utilisée pour nettoyer les tissus dans d’autres systèmes en plus des tissus cérébraux. Pour commencer, scellez le tube et le bouchon à l’aide d’un parafilm et perforez deux trous dans le bouchon. Ensuite, transférez l’azote gazeux du réservoir à l’aide d’un tuyau flexible de cinq millimètres de diamètre interne et d’une aiguille de calibre 19 connectée à son extrémité.

Commencez le dégazage en fixant le tuyau au tube et en permettant l’échange de gaz pendant 30 minutes à température ambiante. Détachez le tuyau et scellez immédiatement les trous avec de la pâte à modeler. Ensuite, transférez les tubes scellés au dégazage dans un bain de 37 degrés Celsius pendant 3 heures et demie pour polymériser la solution d’hydrogel.

Sortez le cerveau du tube. À l’aide de lingettes de laboratoire, retirez l’hydrogel polymérisé autour du cerveau en veillant à ce qu’aucun gel résiduel ne reste attaché à la surface du cerveau. Divisez le cerveau en tranches épaisses qui contiennent toutes les zones d’intérêt.

Mettez les tranches dans la première solution de nettoyage et incubez à 37 degrés Celsius avec une rotation à 70 RPM pendant 24 heures. En attendant, préparez un tube perforé pour placer le cerveau. Placez le tube perforé dans un bécher rempli d’une deuxième solution de nettoyage sur un dispositif d’agitation.

Ensuite, placez le cerveau dans le bécher et scellez-le avec du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment. Une fois que le tissu devient transparent, transférez le cerveau dans pbST en incubé à 37 degrés Celsius avec une rotation à 70 RPM pendant 24 heures. Remplacez la solution par du PBST frais et poursuivez l’incubation pendant encore 24 heures.

Ensuite, transférez le cerveau au PBS à température ambiante pendant 24 heures. Après 24 heures, retirez le cerveau du PBS et transférez-le dans une solution d’appariement de l’indice de réfraction. Incuber le cerveau à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Tout d’abord, placez l’échantillon au milieu de la diapositive. À l’aide de colle chaude, créez des murs sur les bords de la glissière, presque aussi hauts que le tissu. Assurez-vous de laisser un petit espace à l’un des coins.

Lorsque la couche de colle chaude approche de la hauteur de la tranche cérébrale, appliquez une à deux gouttes de la solution correspondant à l’indice de réfraction sur l’échantillon pour humidifier la surface supérieure et empêcher la formation de bulles. Pendant que la colle chaude est encore liquide, scellez le dessus avec un couvercle, en le plaçant aussi uniformément que possible, puis remplissez la chambre avec la solution d’appariement de l’indice de réfraction. Comblez l’écart avec de la colle chaude.

Si les parois de colle chaude s’étendent au-delà des bords de la glissière, coupez les bords d’extension. Si un objectif d’immersion dans l’huile est utilisé pour l’imagerie, ajoutez deux à trois millimètres de colle supplémentaires aux parois au-dessus du couvercle pour retenir la solution d’immersion. Après ce protocole, le tissu cérébral sera nettoyé.

Des tranches de cerveau claires ont été préparées à l’aide de ce protocole pour visualiser les populations d’astrocytes et de neurones dans la région CA1 de l’hippocampe de la souris. Tous les astrocytes ont exprimé tdTomato et les neurones excitateurs ont exprimé H2B-GFP dans leurs noyaux. La chambre préparée pour le tissu clarifié était optimale pour l’imagerie sous un microscope à deux photons ou confocale.

À l’aide d’un microscope à deux photons, plus de 300 astrocytes ont été observés dans une section dégagée de la région CA1 de l’hippocampe de la souris. Les astrocytes de l’hippocampe dans les cellules rouges et pyramidales, les somata en vert étaient des tissus visibles et épais et transparents représentant la proximité spatiale entre ces deux types de cellules. À l’aide d’un microscope confocal laser à balayage, des faisceaux axonaux de neurones excitateurs ont été tracés sur tout un hémisphère.

Des faisceaux verts ont été tracés de l’hippocampe dorsal vers les corps super mamillaires. Les faisceaux rouges ont été tracés à partir des corps mamillaires jusqu’à leur origine à l’hippocampe d’évent. Des facteurs tels que la température, les concentrations et le temps d’incubation ont influencé le résultat de la procédure de clarté.

Par conséquent, la précision à chaque étape du protocole est vitale pour le succès de l’obtention de tissus clairs. En utilisant cette technique, nous mesurons les distances entre les neurones et les astrocytes dans plusieurs structures cérébrales. Ce protocole a permis d’analyser deux à trois ordres de grandeur de plus de cellules que dans les études précédentes.