Name: Établir des organoïdes pulmonaires humains et une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez une méthode pour établir des organoïdes pulmonaires humains à partir de tissus primaires et les différencier en organoïdes matures des voies respiratoires. Ce système permet d'étudier la biologie respiratoire et les pathologies.

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Nous remercions le Centre des sciences panoromiques et de l’unité de microscope électronique, Faculté de médecine Li Ka Shing, Université de Hong Kong, pour son aide en imagerie confocale et en cytométrie en flux. Ce travail a été en partie soutenu par le financement du Fonds de recherche médicale et de santé (HMRF, 17161272 et 19180392) du Bureau de l’alimentation et de la santé; Fonds général de recherche (GRF, 17105420) du Conseil des subventions de recherche; et Health@InnoHK, Commission de l’innovation et de la technologie, le gouvernement de la Région administrative spéciale de Hong Kong.

Toutes les expérimentations utilisant des tissus humains décrits dans le présent document ont été approuvées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 et UW21-695). Le consentement éclairé des patients a été obtenu avant le prélèvement de tissus.
1. Dérivation d’organoïdes pulmonaires humains
<ol><li>Préparation de matériel expérimental<ol>
<li>Préparer le milieu basal en complétant le milieu DMEM/F12 avancé avec 2 mM de glutamine, 10 mM d’HEPES, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.</li>
		<li>Préparer le milieu d’expansion organoïde pulmonaire humain en complétant le milieu basal avec 10 % de R-spondine 1 milieu conditionné, 10 % de milieu conditionné noggin, 1x supplément de B27, 1,25 mM de N-acétylcystéine, 10 mM de nicotinamide, 5 μM de Y-27632, 500 nM d’A-83-01, 1 μM de SB202190, 5 ng/mL de facteur de croissance fibroblyte (FGF)-7, 20 ng/mL de FGF-10 et 100 μg/mL de primocine (voir tableau des matériaux). REMARQUE: Le milieu conditionné R-spondin 1 et Noggin peut être remplacé par la R-spondine 1 recombinante commerciale (500 ng / mL) et Noggin (100 ng / mL).</li>
		<li>Préchauffer une plaque de culture en suspension de 24 puits dans un incubateur de culture cellulaire. Utilisez un incubateur de culture cellulaire standard contenant 5 % de CO2 et une atmosphère humidifiée à 37 °C. Décongeler la matrice du sous-sol dans un réfrigérateur à 4 °C. Gardez la matrice du sous-sol et le milieu de culture sur la glace pendant l’expérimentation.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement cellulaire à partir de tissus pulmonaires humains pour la culture organoïde 3D<ol>
<li>Procurez-vous des tissus pulmonaires humains fraîchement réséqués d’une taille d’environ 0,5 cm chez les patients qui subissent une résection chirurgicale en raison de diverses maladies. Transporter les tissus pulmonaires dans 30 mL de milieu basal à température ambiante et traiter le plus rapidement possible à l’intérieur d’une hotte de biosécurité.</li>
		<li>Hacher les tissus pulmonaires en petits morceaux (0,5-1 mm) avec un scalpel stérile dans un plat de culture cellulaire de 10 cm. Laver les morceaux de tissu avec 10 mL de milieu basal froid dans un tube centrifuge de 15 mL, suivi d’une centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 8 mL de milieu basal complété par de la collagénase à une concentration finale de 2 mg/mL. Digérer les morceaux de tissu en secouant le tube à 120 tr/min pendant 30-40 min à 37 °C.</li>
		<li>Pipetez de haut en bas pendant 20x pour cisailler les morceaux de tissu digérés à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Empiler une crépine de 100 μm sur un tube de centrifugeuse de 50 mL et filtrer la suspension.</li>
		<li>Récupérez les morceaux de tissu sur la crépine avec le milieu basal et transférez-les dans un tube de centrifugeuse de 15 mL, suivi d’une deuxième série de cisaillement et de filtrage. Un cisaillement-filtrage supplémentaire peut être effectué 1x-2x pour isoler plus de cellules, en particulier lorsqu’un petit morceau de tissu (par exemple, <0,5 cm) est acheté.</li>
		<li>Ajouter FBS à l’écoulement avec une concentration finale de 2% pour terminer la digestion, suivie d’une centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu basal, puis la centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.</li>
		<li>(Facultatif) Si de nombreux érythrocytes sont vus dans la pastille (estimée par la couleur de la pastille), remettez en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges et incubez à température ambiante pendant 5 min. Ensuite, ajouter 10 mL de milieu basal au tube, suivi d’une centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.</li>
		<li>Remettez en suspension le granulé dans une matrice froide du sous-sol et conservez-le sur la glace. Ajouter 80-160 μL de matrice de sous-sol pour les cellules récupérées à partir d’un tissu pulmonaire de taille d’environ 0,5 cm; la quantité est suffisante pour ensemencer 2-4 gouttelettes.</li>
		<li>Distribuer 40 μL de suspension dans chaque puits d’une plaque de culture de suspension préchauffée de 24 puits. Incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 10-15 min. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier pour former une gouttelette.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de milieu d’expansion des organoïdes pulmonaires humains complété par 5 nM d’Heregulin bêta-1 à chaque puits et incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire.</li>
		<li>Rafraîchissez le support tous les 3 jours. Retirez l’ancien milieu tout en gardant la gouttelette intacte et ajoutez le milieu frais avec prudence. Passage des organoïdes après l’incubation pendant 10-14 jours. Utilisez Heregulin beta-1 uniquement dans la culture initiale avant le premier passage.</li>
		<li>Observez les organoïdes au microscope pour vous assurer que les organoïdes ne sont pas incorporés avec une densité cellulaire très élevée. Si une gouttelette se désintègre en raison d’une densité cellulaire trop élevée, récupérez et réincorporez les organoïdes et les cellules avec un volume plus élevé de matrice sous-jacente pour produire plus de gouttelettes avec une densité cellulaire plus faible et souhaitable.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Expansion des organoïdes pulmonaires humains
<ol><li>Préparez une pipette Pasteur en brûlant l’extrémité d’une pipette Pasteur sur une flamme, comme un brûleur Bunsen, pour réduire l’ouverture de 1,5 mm à environ 1,0 mm de diamètre. Refroidir les pipettes, puis autoclaver pour stériliser. Mouiller les pipettes avec le milieu basal pour éviter la fixation et la perte de cellules lors du cisaillement mécanique.</li>
	<li>Passage des organoïdes pulmonaires avec cisaillement mécanique<ol>
<li>Utilisez une pointe de 1 mL et pipet de haut en bas pour briser les gouttelettes obtenues ci-dessus. Ensuite, transférez les organoïdes avec le milieu dans un tube centrifuge de 15 mL et ajustez le volume à 10 mL avec un milieu basal froid. Jeter le surnageant après centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C</li>
		<li>Laver à nouveau les organoïdes avec 10 mL de milieu basal froid. Remettre en suspension les organoïdes dans 2 mL de milieu basal froid. Pipet de haut en bas pour cisailler les organoïdes en petits morceaux avec une pipette Pasteur.</li>
		<li>Compléter avec le milieu basal jusqu’à un volume total de 10 mL, suivi d’une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez en suspension les fragments organoïdes avec une matrice de sous-sol froide suffisante pour permettre une expansion de 1:3 à 1:5. Restez sur la glace.</li>
		<li>Placer 40 μL de suspension organoïde dans chaque puits d’une plaque préchauffée de 24 puits. Incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 10-15 min. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de milieu d’expansion organoïde pulmonaire à chaque puits et incuber dans un incubateur de culture cellulaire. Rafraîchissez le support tous les 3 jours. Passage des organoïdes toutes les 2 semaines avec un rapport de 1:3 à 1:5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passage des organoïdes pulmonaires avec trypsinisation REMARQUE: La trypsinisation est préférable lorsqu’il est difficile de cisailler l’organoïde pulmonaire en petits morceaux à l’aide d’un pipot Pasteur, ou que la taille des organoïdes est très variable, ou que les expérimentations ultérieures nécessitent des organoïdes de taille plus uniforme.<ol>
<li>Prélevez les organoïdes pulmonaires comme indiqué à l’étape 2.2.1. Remettre l’organoïde en suspension dans 1 mL d’enzyme de dissociation et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 3 à 5 min.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de milieu basal au tube. Cisaillez les organoïdes mécaniquement en pipettant les organoïdes de haut en bas en petits morceaux à l’aide d’un pipet Pasteur. Vérifiez la taille des pièces organoïdes au microscope à un grossissement 4x. Ensuite, ajoutez 40 μL de FBS pour mettre fin à la digestion. REMARQUE: Déterminer la taille des fragments organoïdes au microscope selon l’arrangement expérimental. Si une expérience a besoin de plus d’organoïdes ou d’organoïdes de taille plus uniforme, cisaillez les organoïdes en plus petits morceaux ou même en cellules individuelles. Ensuite, il faut plus de temps, probablement 3 semaines, avant que les organoïdes soient prêts pour l’expérimentation.</li>
		<li>Compléter avec le milieu basal jusqu’à un volume final de 10 mL, suivi d’une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre en suspension les pièces organoïdes dans une matrice de sous-sol froide avec un volume suffisant pour passer avec un rapport de 1:5-1:10. Restez sur la glace.</li>
		<li>Placer 40 μL de suspension organoïde dans chaque puits d’une plaque préchauffée de 24 puits. Incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 10-15 min. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier.</li>
		<li>Complétez avec 500 μL de milieu d’expansion organoïde pulmonaire par puits et incubez dans un incubateur de culture cellulaire. Actualisez le milieu d’expansion tous les 3 jours. Passage des organoïdes après 2-3 semaines. REMARQUE: Environ 100 organoïdes sont montés dans une gouttelette de 40 μL de matrice de sous-sol. Les organoïdes pulmonaires se développent normalement mieux avec une densité cellulaire relativement élevée. Réincorporez les organoïdes avec une densité cellulaire plus faible si les gouttelettes se désintègrent ou si les organoïdes en croissance se fixent ensemble en raison de la densité cellulaire trop élevée.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires
<ol><li>Préparer le milieu de différenciation proximal (milieu) en complétant le milieu basal de l’interface air liquide avec 1x supplément d’interface air liquide, 1x supplément d’entretien de l’interface air liquide, 4 μg/mL d’héparine, 1 μM d’hydrocortisone, 10 μM de Y-27632 et 10 μM de DAPT (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Organoïdes 3D des voies respiratoires<ol>
<li>Incuber les organoïdes pulmonaires dans le milieu de dilatation pendant 7 à 10 jours après le passage par cisaillement mécanique. Remplacez le milieu d’expansion par le milieu. Incuber les organoïdes dans le milieu pendant 14 jours dans un incubateur de culture cellulaire.</li>
		<li>Jetez le support dans chaque puits. Ajouter un tampon de lysat cellulaire pour prélever l’organoïde différencié des voies respiratoires pour l’extraction de l’ARN et la détection de l’expression des gènes cellulaires par test RT-qPCR.</li>
		<li>Alternativement, incuber les organoïdes à 37 °C pendant 60 min après l’ajout de 10 mM d’EDTA pour dissocier les organoïdes en cellules individuelles, suivi d’une analyse par cytométrie en flux pour examiner les populations cellulaires. Les organoïdes sont prêts pour diverses manipulations expérimentales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organoïde 2D des voies respiratoires<ol>
<li>Préparez suffisamment d’organoïdes pulmonaires 3D pour la culture de différenciation 2D. Au total, 1,3 x 105 et 4,5 x 105 cellules sont nécessaires pour un insert de support perméable à 24 puits et un insert de support perméable à 12 puits, respectivement.</li>
		<li>Après la croissance des organoïdes pulmonaires 3D dans le milieu d’expansion pendant 2 semaines, digérez les organoïdes en cellules simples et ensemencez dans les inserts de 24 puits et 12 puits pour générer des organoïdes des voies respiratoires 2D.</li>
		<li>Pré-incuber les inserts avec le milieu basal pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire. Ajouter 250 μL et 500 μL de milieu basal dans la chambre supérieure et inférieure d’une plaque de 24 puits, respectivement. Pour une plaque de 12 puits, ajouter 500 μL et 1 000 μL de milieu basal dans la chambre supérieure et inférieure, respectivement.</li>
		<li>Prélever des organoïdes pulmonaires 3D comme décrit à l’étape 2.2.1. Remettre en suspension les organoïdes avec 1 mL d’enzyme de dissociation et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 3-5 min.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de milieu basal au tube. Pipet de haut en bas pour cisailler les organoïdes en cellules individuelles avec un pipet Pasteur et vérifier les cellules au microscope. Ensuite, ajoutez 40 μL de FBS pour mettre fin à la digestion.</li>
		<li>Filtrer les cellules à travers une passoire de 40 μm dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Transférer la suspension de la cellule filtrée dans un tube de 15 mL. Compléter avec le milieu basal jusqu’à un volume total de 10 mL, suivi d’une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Remettre en suspension la pastille, recueillie à partir de 24 gouttelettes (40 μL), dans 1 à 2,5 mL de milieu d’expansion organoïde pulmonaire en fonction de la densité cellulaire dans les gouttelettes. Comptez le nombre de cellules avec un compteur de cellules au microscope. Ajuster la concentration de la cellule à 1,3 x 106/mL (pour les inserts à 24 puits) ou 9 x 105/mL (pour les inserts à 12 puits).</li>
		<li>Retirez le milieu basal des chambres supérieure et inférieure. Ajouter 500 μL et 1 000 μL de milieu d’expansion dans la chambre inférieure de l’insert à 24 puits et de l’insert à 12 puits, respectivement. Ensemencement de 100 μL et 500 μL de suspension cellulaire préparés à l’étape 3.3.7 sur la chambre apicale de l’insert à 24 puits et de l’insert à 12 puits, respectivement.</li>
		<li>Incuber dans un incubateur de culture cellulaire pendant 2 jours. Remplacez le milieu d’expansion par le milieu dans la chambre apicale et inférieure des plaques. Incuber les organoïdes dans un incubateur de culture cellulaire pendant 14 jours et rafraîchir le milieu tous les 3 jours. REMARQUE: Les cils mobiles sont discernables dans les organoïdes 3D et 2D au microscope à partir du jour 7 après l’incubation dans le milieu. Après 14 jours de culture de différenciation dans le milieu, les organoïdes des voies respiratoires sont matures pour diverses manipulations expérimentales.</li>
		<li>Mesurer la résistance électrique trans-épithéliale (TEER) tous les deux jours à l’aide d’un système de mesure de la résistance électrique selon un protocole standard décrit aupoint 17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modelling+in+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li>
<li>Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</a> (2021).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098(2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt%2Fbeta-catenin+and+Wnt%2FPCP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li>
<li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li>
<li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li>
<li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li>
<li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+immunological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li>
<li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508(2021).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li>
<li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li>
</ol>

J. Z., C.L. et M.C.C. sont répertoriés comme inventeurs sur le brevet des organoïdes des voies respiratoires (numéro de publication: US-2021-0207081-A1). Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Les voies respiratoires humaines sont tapissées de l’épithélium des voies respiratoires, également connu sous le nom d’épithélium cilié pseudostratifié. Les principaux types de cellules de l’épithélium des voies respiratoires supérieures sont les cellules ciliées qui permettent le mouvement coordonné de leurs cils apicals pour expulser le mucus et les particules inhalées des voies respiratoires, les cellules gobelet qui produisent et sécrètent du mucus et les cellules basales qui tapissent la membrane basale et sont impl...

Les organoïdes sont devenus un outil robuste et universel pour la modélisation in vitro du développement d’organes et l’étude de la biologie et de la maladie. Lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu de culture défini par un facteur de croissance, les cellules souches adultes (ASC) d’une variété d’organes peuvent être étendues en 3 dimensions (3D) et auto-assemblées en grappes cellulaires semblables à des organes composées de plusieurs types de cellules, appelées organoïdes. Le laboratoire de Clevers a rapporté la dérivation du premier organoïde dérivé de l’ASC, l’organoïde intestinal humain, en 2009 1,2. Par la suite, des organoïdes dérivés de l’ASC ont été établis pour une variété d’organes et de tissus humains, y compris la prostate 3,4, le foie 5,6, l’estomac 7,8,9, le pancréas10, la glande mammaire11 et le poumon 12,13 . Ces organoïdes dérivés de l’ASC ont conservé les propriétés cellulaires, structurelles et fonctionnelles critiques de l’organe natif et ont maintenu la stabilité génétique et phénotypique dans la culture d’expansion à long terme14,15.
Les organoïdes peuvent également être dérivés de cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS)16. Alors que les organoïdes dérivés de PSC exploitent les mécanismes de développement des organes pour leur établissement, les ASC peuvent être contraints de former des organoïdes en reconstruisant des conditions qui imitent la niche des cellules souches lors de l’auto-renouvellement physiologique des tissus ou de la réparation des tissus. Les organoïdes dérivés de PSC sont des modèles favorables pour explorer le développement et l’organogenèse, bien qu’incapables d’atteindre le niveau de maturation comparable des organoïdes dérivés de l’ASC. L’état de maturation fœtale des organoïdes dérivés de la CSP et la complexité de l’établissement de ces organoïdes empêchent considérablement leurs vastes applications pour l’étude de la biologie et de la pathologie dans les tissus matures.
Les voies respiratoires humaines, du nez à la bronchiole terminale, sont tapissées de l’épithélium des voies respiratoires, également appelé épithélium cilié pseudostratifié, qui se compose de quatre principaux types de cellules, à savoir les cellules ciliées, les cellules gobelets, les cellules basales et les cellules club. Nous avons créé l’organoïde pulmonaire humain dérivé de l’ASC à partir de tissus pulmonaires humains en collaboration avec le laboratoire12,13 de Clevers. Ces organoïdes pulmonaires sont successivement dilatés dans le milieu d’expansion pendant plus d’un an; la durée précise varie selon les différentes lignées organoïdes obtenues auprès de différents donneurs. Cependant, par rapport à l’épithélium natif des voies respiratoires, ces organoïdes pulmonaires extensibles à long terme ne sont pas assez matures puisque les cellules ciliées, la principale population cellulaire des voies respiratoires humaines, sont sous-représentées dans ces organoïdes pulmonaires. Ainsi, nous avons développé un protocole de différenciation proximale et généré des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D qui phénocopisent morphologiquement et fonctionnellement l’épithélium des voies respiratoires à un niveau quasi physiologique.
Ici, nous fournissons un protocole vidéo pour dériver les organoïdes pulmonaires humains des tissus pulmonaires primaires, élargir les organoïdes pulmonaires et induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D.

<table><tbody><tr><td>Réactifs pour la culture d’organoïdes pulmonaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>12634010-A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500nM</td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Cultrex Reduced Growth Factor Bottom Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td><td>Trevigen</td><td>3533-010-0</td><td>70-80 %</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamine)</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Heregulin &beta ;-1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin (moyen conditionnel)</td><td>fait</td><td></td> <td>maison-10x</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>1x</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Rsrépondin1 (moyen conditionnel)</td><td>fait</td><td></td> <td>maison-10x</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>1 &micro ; M</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 & micro ; M</td></tr><tr><td><fort>Différenciation proximale moyenne</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris</td><td>2634</td><td>10 &micro ; M</td></tr><tr><td>Heparine Solution</td><td>StemCell Technology</td><td>7980</td><td>4 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de solution mère d’hydrocortisone</td><td>StemCell Technology</td><td>7925</td><td>1 & micro ; M</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 10X Supplément</td><td></td><td></td><td>d’interface air-liquide</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Milieu basal</td><td>StemCell Technology</td><td>05001</td><td>interface air-liquide milieu basal</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Supplément</td><td></td><td></td><td>d’entretien d’interface air-liquide Supplément d’entretien</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>10 &micro ; M</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enceinte de sécurité biologique</td><td>Baker</td><td>1-800-992-2537</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss LSM 780 ou 800</td><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>42093483</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31SF</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5418BG040397</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Eppendorf</td> Micropipette Eppendorf <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ZEN noir ou ZEN bleu Logiciel</td><td>d’analyse</td> <td>Zeiss</td><td></td></tr> <tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12mm Trans-well</td><td>StemCell Technology</td><td>#38023</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 12 puits</td><td>Cellstar</td><td>665970</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 et 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L6BF5Z8118</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 24 puits</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6,5 mm Trans-well</td><td>StemCell Technology</td><td>#38024</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtre pour seringue médicale, 0,22 & micro ; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microfuges</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embouts de micropipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TFLR140-200-Q21190531</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en verre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-378893</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (5ml, 10ml, 25ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BA08003, 08004, 08005</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps > <forts</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti-souris Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Souris, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Lapin Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Lapin Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Rat Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-Cytokératine 5</td><td>Abcam</td><td>ab128190</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-FOX J1</td><td>Invitrogen</td><td>14-9965-82</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-Mucine 5AC</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-&beta ;-tubuline 4</td><td>Sigma</td><td>T7941</td><td></td></tr><tr><td>Lapin Anti-p63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Anti-utéroglobine chez le rat/CC-10</td><td>R& D Systems</td><td>MAB4218-SP</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Autre réactif</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217701</td><td>enzyme de dissociation</td></tr></tbody></table>

Établir des organoïdes pulmonaires humains et une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

L’absence d’un modèle in vitro robuste de l’épithélium respiratoire humain entrave la compréhension de la biologie et de la pathologie du système respiratoire. Nous décrivons un protocole défini pour dériver des organoïdes pulmonaires humains à partir de cellules souches adultes dans le tissu pulmonaire et induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires. Les organoïdes pulmonaires sont ensuite étendus consécutivement pendant plus de 1 an avec une grande stabilité, tandis que les organoïdes différenciés des voies respiratoires sont utilisés pour simuler morphologiquement et fonctionnellement l’épithélium des voies respiratoires humaines à un niveau quasi physiologique. Ainsi, nous établissons un modèle organoïde robuste de l’épithélium des voies respiratoires humaines. L’expansion à long terme des organoïdes pulmonaires et des organoïdes différenciés des voies respiratoires génère une source stable et renouvelable, permettant aux scientifiques de reconstruire et d’étendre les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines dans les boîtes de culture. Le système organoïde pulmonaire humain fournit un modèle in vitro unique et physiologiquement actif pour diverses applications, y compris l’étude de l’interaction virus-hôte, le dépistage de médicaments et la modélisation de la maladie.

Ce protocole permet la dérivation d’organoïdes pulmonaires humains avec un taux de réussite élevé. Le tissu pulmonaire humain frais est haché en petits morceaux, puis décomposé avec de la collagénase. Les cellules uniques résultantes sont incorporées dans la matrice du sous-sol et incubées dans le milieu d’expansion organoïde pulmonaire complété par un cocktail de facteurs de niche pour l’excroissance des cellules souches épithéliales (étape 1.1.2). La figure 1 montre la microphotographie de...

Le protocole présente une méthode permettant de dériver des organoïdes pulmonaires humains à partir de tissus pulmonaires primaires, d’élargir les organoïdes pulmonaires et d’induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D qui phénopient fidèlement l’épithélium des voies respiratoires humaines.

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Nous introduisons une méthode pour établir la culture organoïde de l’épithélium des voies respiratoires humaines dans des plaques de culture. Nous dérivons des organoïdes pulmonaires humains directement à partir de tissus pulmonaires primaires avec une grande efficacité. Les organoïdes pulmonaires humains dérivés sont développés de manière stable pendant plus d’un an, et un protocole de différenciation proximale permet la génération d’organoïdes des voies respiratoires matures qui peuvent simuler fidèlement l’épithélium des voies respiratoires humaines à un niveau proche de celui physiologique.Par conséquent, le système de culture permet aux scientifiques de reconstruire et d’étendre l’épithélium des voies respiratoires humaines dans des plaques de culture. Man Chun Chiu et Yifei Yu, doctorants dans notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure Pour commencer l’isolement cellulaire des tissus pulmonaires humains pour la culture organoïde 3D, hacher les tissus pulmonaires en petits morceaux d’un millimètre avec un scalpel stérile et laver les morceaux de tissu avec 10 millilitres de milieu basal froid. Centrifuger les tissus à 400 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant avant de remettre la pastille dans huit millilitres de milieu basal complété par de la collagénase à une concentration finale de deux milligrammes par millilitre.Ensuite, digérez les morceaux de tissu en secouant le tube à 120 tr / min pendant 30 à 40 minutes à 37 degrés Celsius. Après la digestion, pipettez de haut en bas 20 fois à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres pour cisailler les morceaux de tissu digérés. Ensuite, filtrez la suspension avec une passoire de 100 microns dans un tube de 50 millilitres.Récupérez et transférez les morceaux de tissu de la passoire dans un tube centrifuge de 15 millilitres avec le milieu basal. Pour terminer la digestion, ajouter le sérum bovin fœtal au flux jusqu’à une concentration finale de 2%Ensuite, centrifuger le tube et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres du milieu basal comme décrit précédemment. Après centrifugation, remettre en suspension la pastille dans 80 à 160 microlitres de milieu de matrice de sous-sol froid et placer les tubes sur de la glace.Ensuite, distribuez 40 microlitres de la suspension à chaque puits d’une plaque de culture de suspension préchauffée à 24 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier et former une gouttelette.Après l’incubation, ajouter 500 microlitres de milieu d’expansion des organoïdes pulmonaires humains complétés par cinq nanomolaires d’héréguline-bêta 1 à chaque puits et incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Après trois jours, retirez l’ancien milieu tout en gardant la gouttelette intacte et ajoutez soigneusement le milieu frais. Après 10 à 14 jours de passage, observez les organoïdes au microscope et assurez-vous que les organoïdes ne sont pas incrustés avec une densité cellulaire très élevée.Pour passer les organoïdes pulmonaires avec cisaillement, cassez les gouttelettes en pipetant de haut en bas avec une pointe d’un millilitre. Ensuite, transférez les organoïdes avec le milieu dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et ajustez le volume à 10 millilitres avec un milieu basal froid. Centrifugez le tube à 300 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, jetez le surnageant et lavez les organoïdes avec 10 millilitres de milieu basal froid.Ensuite, remettez en suspension les organoïdes dans deux millilitres de milieu basal froid et cisaillez en petits morceaux avec une pipette Pasteur. Ensuite, ajoutez le milieu basal à un volume total de 10 millilitres et centrifugez avant de remettre en suspension les fragments organoïdes avec une matrice de sous-sol froide suffisante pour permettre une expansion de 1:3 à 1:5 et placez les tubes sur de la glace. Distribuer 40 microlitres de suspension organoïde dans chaque puits d’une plaque préchauffée de 24 puits pour incuber à 37 degrés Celsius afin de permettre à la matrice du sous-sol de se solidifier pendant 10 à 15 minutes.Plus tard, ajoutez 500 microlitres de milieu d’expansion organoïde pulmonaire à chaque puits et incubez dans un incubateur de culture cellulaire. Rafraîchissez le milieu tous les trois jours et passez les organoïdes toutes les deux semaines. Pour passer les organoïdes pulmonaires avec trypsinisation, ressuspendez les organoïdes pulmonaires prélevés dans un millilitre d’enzyme de dissociation.Incuber l’organoïde dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu basal au tube et cisaillez mécaniquement les organoïdes en pipetant de haut en bas. Vérifiez la taille des pièces organoïdes au microscope à un grossissement de 100X avant de terminer la digestion avec 40 microlitres de sérum bovin fœtal.Porter le volume à 10 millilitres avec le milieu basal et la centrifugeuse avant de remettre les pièces organoïdes dans une matrice de sous-sol froide avec un volume suffisant pour passer avec un rapport de 1:5 à 1:10. Plus tard, distribuez 40 microlitres de suspension organoïde dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et cultivez la plaque comme démontré précédemment. Pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D, incuber les organoïdes pulmonaires dans le milieu d’expansion pendant sept à 10 jours après le passage par cisaillement mécanique.Ensuite, remplacez le milieu d’expansion par un milieu de différenciation proximal et incubez les organoïdes dans un incubateur de culture cellulaire. Après 14 jours, jeter le milieu dans chaque puits et ajouter un tampon de lysat cellulaire pour prélever l’organoïde différencié des voies respiratoires pour l’extraction de l’ARN et la détection de l’expression des gènes cellulaires par test RT-qPCR. Pré-incuber les inserts dans l’incubateur de culture cellulaire avec 250 et 500 microlitres du milieu basal dans la chambre supérieure et inférieure d’une plaque de 24 puits, respectivement.Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu basal au tube et pipetez de haut en bas pour cisailler les organoïdes en cellules individuelles. Observez les cellules au microscope avant de terminer la digestion avec 40 microlitres de sérum bovin fœtal. Filtrer les cellules à travers une passoire de 40 microns dans un tube de 50 millilitres et transférer la suspension cellulaire filtrée dans un tube de 15 millilitres.Complétez la suspension avec un milieu basal jusqu’à un volume total de 10 millilitres. Après centrifugation, remettre en suspension la pastille recueillie à partir de 24 gouttelettes dans 1 à 2,5 millilitres de milieu d’expansion organoïde pulmonaire, selon la densité cellulaire. Comptez le nombre de cellules avec le compteur de cellules au microscope, puis ajustez la concentration cellulaire à 1,3 fois 10 à six par millilitre pour les inserts de 24 puits.Retirez le milieu basal des chambres supérieure et inférieure avant d’ajouter 500 microlitres de milieu d’expansion dans la chambre inférieure. Ensemencez 100 microlitres de suspension cellulaire préparés plus tôt sur la chambre apicale de l’insert à 24 puits et incubez. Après deux jours, remplacez le milieu d’expansion par un milieu de différenciation proximal dans la chambre apicale et inférieure de la plaque.Incuber les organoïdes pendant 14 jours et rafraîchir le milieu tous les trois jours. Mesurez la résistance électrique trans-épithéliale tous les jours à l’aide d’un système de mesure de la résistance électrique. Dans la microphotographie représentative, les cellules pulmonaires fraîchement isolées peuvent être vues incorporées dans la matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit de type deux.Les organoïdes kystiques sont apparus et ont grandi au fil du temps. Les organoïdes pulmonaires après le quatrième passage sont démontrés ici. Dans les deux heures suivant le cisaillement mécanique, les fragments organoïdes incorporés dans l’extrait de la membrane basale ont formé les domaines kystiques.La microphotographie du même champ le cinquième jour a confirmé la croissance organoïde au fil du temps. Les organoïdes en expansion abritaient les quatre principaux types de cellules épithéliales des voies respiratoires, y compris les cellules ciliées ACCTUB positives ou FOXJ1 positives, les cellules basales P63 positives, les cellules club CC10 positives et les cellules gobelet MUC5AC positives dans un état prématuré. Les organoïdes incubés dans le milieu d’expansion et de différenciation proximale ont développé une morphologie distincte au fil du temps.Après deux semaines de différenciation dans le milieu de différenciation proximal, des cils mobiles étaient discernables dans chaque organoïde. Il a été observé que la célia battant de manière synchrone entraînait les débris cellulaires à l’intérieur de la lumière organoïde et les tourbillonnait unidirectionnellement pour éliminer les particules inhalées. En outre, l’analyse par cytométrie en flux a démontré que les organoïdes différenciés accueillaient quatre types de cellules épithéliales des voies respiratoires dans un milieu de différenciation et d’expansion proximal.Après deux semaines de différenciation, les organoïdes des voies respiratoires 2D ont développé une barrière épithéliale intacte. Un test de blocage de dextran a été effectué pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale formée dans les organoïdes des voies respiratoires 2D. Les organoïdes 2D contenaient des cellules ciliées abondantes.L’organoïde pulmonaire extensible à long terme et l’organoïde différencié des voies respiratoires fournissent un système modèle physiologiquement actif et universel pour l’étude de la biologie et de la pathologie respiratoires, y compris la COVID-19.

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Biologie

Ce protocole dirige efficacement la souris souches embryonnaires endoderme définitif dérivé des cellules matures voies respiratoires cellules épithéliales. Cette technique de différenciation utilise trois dimensions échafauds pulmonaires décellularisé pour diriger la spécification de la lignée de poumon, dans un environnement de culture exempt de sérum défini.

Génération de cellules de souris Airway épithéliales ESC dérivés Utilisation décellularisé Lung échafauds

Cet article fournit une méthodologie détaillée pour les approches de dissociation tissulaire et de fractionnement cellulaire permettant l’enrichissement de cellules épithéliales viables à partir de régions proximales et distales du poumon humain. Ici, ces approches sont appliquées pour l’analyse fonctionnelle des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires grâce à l’utilisation de modèles de culture d’organoïdes 3D.

Isolement et enrichissement des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines pour la culture organoïde

Nous décrivons un protocole simple pour développer des organoïdes épithéliales mucociliary des cellules profondes d’ectoderm isolées des embryons de Xenopus laevis. Les progéniteurs multipotents régénèrent les précurseurs épithéliales des cellules gobelet et permettent un suivi en direct de l’initiation et de la progression des transitions cellulaires à la surface des organoïdes.

Organoïdes épithéliales mucociliaires des cellules embryonnaires de Xenopus : génération, culture et imagerie vivante haute résolution

L’article décrit la différenciation dirigée par étapes des cellules souches pluripotentes induites en organoïdes pulmonaires entiers tridimensionnels contenant à la fois des cellules pulmonaires épithéliales proximales et distales ainsi que du mésenchyme.

Génération d’organoïdes pulmonaires entiers 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites pour la modélisation de la biologie et de la maladie du développement pulmonaire

Le protocole décrit un bioréacteur basé sur l’imagerie qui permet l’élimination sélective de l’épithélium endogène de la trachée du rat et la distribution homogène des cellules exogènes à la surface de la lumière, suivie d’une culture in vitro à long terme de la construction du tissu cellulaire.

Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie

Les progrès récents dans les protocoles de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme permettent la dérivation par étapes de types de cellules spécifiques à un organe. Ici, nous fournissons des étapes détaillées pour la maintenance et l’expansion des cellules basales des voies respiratoires dérivées de l’iPSC et leur différenciation en épithélium mucociliaire dans des cultures d’interface air-liquide.

Génération de cultures d’interface air-liquide de cellules épithéliales des voies respiratoires à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Cet article décrit la génération d’un modèle complexe de barrière respiratoire multicellulaire composé d’épithélium pulmonaire, de mésenchyme, de cellules endothéliales et de macrophages dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans une culture d’interface air-liquide.

Co-culture de cellules épithéliales, mésenchymateuses, endothéliales et immunitaires dérivées d’iPSC pour modéliser l’intégrité de la barrière des voies respiratoires dans la santé et les maladies pulmonaires

Dans ce protocole vidéo, nous expliquons étape par étape la transduction lentivirale dans les organoïdes de l’épithélium intestinal primaire et le traitement et l’analyse en aval de ces cultures par RT-PCR quantitative, ARN-microarray et immunohistochimie.

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

La culture d’agrégats d’adipocytes matures de membrane (MAAC) est une nouvelle méthode pour la culture des adipocytes humains mûrs. Ici, nous détaillons comment isoler les adipocytes de l’adipose humain et comment mettre en place MAAC.

Isolement et culture des adipocytes matures humains utilisant les cultures agrégées d’adipocytemûr mûr de membrane (MAAC)

Toute la structure 3D et la teneur cellulaire des organoïdes, ainsi que leur ressemblance phénotypique avec le tissu d’origine peuvent être capturés à l’aide du protocole d’imagerie 3D à résolution unicellulaire décrit ici. Ce protocole peut être appliqué à un large éventail d’organoïdes variant dans l’origine, la taille et la forme.

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Découvrez une méthode pour établir des organoïdes pulmonaires humains à partir de tissus primaires et les différencier en organoïdes matures des voies respiratoires. Ce système permet d'étudier la biologie respiratoire et les pathologies.

Établir des organoïdes pulmonaires humains et une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires (Vidéo) | JoVE Journal

Établir des organoïdes pulmonaires humains et une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires

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