Caractérisation de la péritonite septique induite par Salmonella Typhimurium chez la souris

La septicémie est une réponse immunitaire dérégulée de l’hôte à une invasion microbienne ou à des lésions tissulaires, entraînant des lésions organiques à un site éloigné de celui de l’infection ou des dommages. Le grand public est devenu plus conscient de ce trouble, pendant la pandémie de COVID-19. En 2017, il y a eu 48,9 millions d’incidents de septicémie et 11 millions de décès dans le monde, ce qui représente près de 20% de tous les décès dans le monde.

Comme on peut s’y attendre, la plupart des cas se trouvent dans des hôpitaux. En fait, une étude a révélé que près de 62% des isolats positifs de patients atteints de septicémie étaient des organismes à Gram négatif. Il existe plusieurs modèles, et certains des modèles de septicémie couramment utilisés chez la souris comprennent l’endotoxémie induite par le LPS, le modèle de ligature et de ponction cæcale et les systèmes de modèle d’infection monobactérienne.

Dans notre laboratoire, nous avons normalisé un système de modèle murin, pour induire une septicémie péritonéale à l’aide de Salmonella Typhimurium. Ce modèle est avantageux par rapport à d’autres, car Salmonella Typhimurium est un agent pathogène intracellulaire qui imite l’état cliniquement pertinent de la septicémie à Gram négatif. Le résultat de la septicémie péritonite dans ce modèle, est systémique avec 100% de mortalité, dans les 96 heures suivant l’infection.

Par conséquent, ce modèle joue un rôle déterminant dans l’étude des réponses inflammatoires de l’hôte. Dans ce modèle, la septicémie est induite par l’injection intrapéritonéale de 0,5 million d’UFC de Salmonella Typhimurium, chez une souris C57BL/6 âgée de 8 à 10 semaines. L’infection systémique peut être confirmée, en évaluant la charge bactérienne des organes, environ 16 heures après l’infection.

Les expériences utilisant Salmonella Typhimurium nécessitent une installation BSL-2 et le respect des directives BSL-2. Il faut prendre soin d’utiliser un EPI approprié, d’assurer la sécurité et de suivre les méthodes standard d’élimination des risques biologiques BSL-2. Toutes les expériences ont été approuvées par le comité institutionnel d’éthique animale.

Préparation de culture de Salmonella Typhimurium. Ajouter une centaine de microlitres de bouillon de glycérol Salmonella Typhimurium NCTC 12023 dans 3 mL de bouillon LB. Incuber la culture à 160 tours par minute, à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Strier 50 microlitres de la culture cultivée pendant la nuit dans un bouillon LB, sur une plaque de gélose Salmonella Shigella, et incuber à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Choisissez une seule colonie dans la plaque de gélose SS striée, à l’aide d’une micro-pointe. Éjecter la micro-pointe dans 3 mL de bouillon LB et la cultiver à 160 tr / min à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Ajouter 0,1 mL de la culture bactérienne dans 50 mL de bouillon LB et incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur agitateur à 160 tr / min, pendant trois à quatre heures, pour atteindre la phase logarithmique de croissance. Diluer la culture par un facteur de deux en utilisant du bouillon LB. Mesurer la densité optique de la culture à 600 nanomètres de longueur d’onde de lumière dans un spectrophotomètre.

Une fois que la DO atteint un, faire deux aliquotes de 1 mL de culture, dans des tubes de microfuge de 1,5 mL. Centrifuger les tubes à 7 750 G pendant 15 minutes. Jetez ce surnageant et lavez la pastille avec 1 mL de 1XPBS deux fois.

Centrifuger les tubes à 7 750 G pendant 15 minutes. Remettre en suspension la pastille dans 0,5 mL de 1XPBS, dans deux tubes de microfuge de 1,5 mL différents. Combinez les suspensions des deux tubes en un tube de 1,5 mL, contenant maintenant environ deux multipliées par 10 élevées à la puissance de huit unités formant des colonies par mL.

Préparer une suspension de cellules bactériennes de 10 puissance six UFC/mL, en diluant la solution mère. Remarque importante, optimisez l’UFC correspondant à OD dans votre laboratoire, pour déterminer l’UFC pour OD un, avant de lancer les expériences. Souris et infections.

Le jour de l’infection, tenez la souris d’une main, essuyez la peau abdominale avec 70% d’éthanol et écartez les pattes postérieures pour une meilleure accessibilité de la paroi abdominale. Injecter 0,5 mL de 10 soulevés à la puissance six UFC/mL suspension bactérienne par voie intrapéritonéale, à l’aide d’une seringue de 1 mL. Après l’infection, plaquez la culture pour vérifier l’UFC injectée, qui peut varier de 0,2 à 0,8 million d’UFC par 0,5 mL.

Évaluation des organes par ufc. La souris a été sacrifiée en utilisant l’asphyxie au dioxyde de carbone. Après avoir sacrifié la souris infectée, essuyez l’abdomen avec un morceau de coton, trempé dans de l’éthanol à 70%.

Coupez la peau abdominale. Reportez-vous à l’article de Ray and Dittle, pour un protocole vidéo, sur la façon de collecter le liquide de lavage péritonéal. Ouvrez la cavité péritonéale et collectez l’organe d’intérêt.

Dans cette vidéo, nous démontrons le dénombrement de l’UFC d’organe du foie. Le foie subit des dommages histopathologiques étendus, dans ce modèle de septicémie. Coupez un petit morceau de foie et placez-le dans un tube de microfuge.

Cela peut être stocké dans de la glace pendant deux à trois heures, avant de passer à l’étape suivante. Pesez la pièce et transférez-la dans un tube de microfuge. De préférence, coupez les morceaux pesant environ 10 à 15 mg, pour une homogénéisation correcte.

Ajouter 0,5 mL de 1XPBS dans le tube et homogénéiser les organes à l’aide d’un homogénéisateur à main. Assurez-vous que les organes sont complètement homogénéisés. Augmentez le volume à 1 mL, en ajoutant 0,5 mL de 1XPBS.

Centrifugez les tubes à 200 G pendant cinq minutes, à quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant dans des tubes de microfuge frais. Préparer des dilutions de 10 à la puissance moins un, et de 10 à la puissance moins deux, dans une plaque de 96 puits.

Étaler 50 microlitres du diluant sur des plaques de gélose SS fraîches et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Comptez le nombre de colonies qui apparaissent dans chaque condition et normalisez les données avec le poids de l’organe, en utilisant la formule suivante. L’UFC/mg est égal au nombre de colonies, multiplié par 20, multiplié par le facteur de dilution, le tout divisé par le poids de l’organe en mg.

Notez que le nombre 20 est utilisé dans la formule, pour convertir les colonies par plaque en UFC/mL. Ce nombre est obtenu, en divisant 1 mL de la quantité d’un volume donné de culture plaquée. Dans ce cas, 50 microlitres.

Par exemple, si vous trouvez une centaine de colonies dans une plaque de gélose SS, où 50 microlitres de 10 puissance moins une dilution d’organe homogénéisé, pesant 10 mg est étalé, alors UFC / mg sera égal à 100 multiplié par 20, multiplié par 10, le tout divisé par 10, ce qui est égal à 2000 UFC / mg. Analyse cytométrique en flux de diverses populations de cellules immunitaires dans l’exsudat péritonéal. Recueillir les cellules péritonéales comme décrit précédemment, par Ray et Dittle.

Remettre en suspension la pastille cellulaire du liquide de lavage péritonéal, dans 1 mL de RPMI complété par 10% FBS. Dénombrer le nombre total de cellules dans le lavage péritonéal à l’aide d’un hémocytomètre. Ajustez le nombre de cellules de manière à ce que chaque tube reçoive deux à cinq multipliés par 10 élevés à la puissance de cinq cellules.

Faites tourner les cellules vers le bas à 200 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le surnageant. Lavez les cellules une fois avec 1XPBS.

Centrifuger les cellules à 200 G pendant 10 minutes. Bloquez les récepteurs Fc à l’aide du bloqueur FcR. L’une est à 400 dilution, préparée dans un tampon bloquant, composé de 5% FBS et 0,02% d’azoture de sodium dans PBS.

Incuber sur de la glace pendant 15 minutes. Centrifuger les cellules à 200 G pendant 10 minutes. Jetez le surnageant.

Diluer les anticorps conjugués au fluorochrome d’intérêt pour bloquer le tampon. Ici, nous utilisons une dilution est à 500 de Ly6G anti-souris, pour tacher les neutrophiles. Notez que d’autres populations de cellules immunitaires peuvent également être montrées, en utilisant anti-souris B220 pour les cellules B, anti-souris CD3 pour les cellules T, anti-souris F4/80 pour les macrophages, et cetera.

Incuber environ 0,2 million de cellules dans 200 microlitres de solutions diluées d’anticorps, dans des tubes séparés. Comme témoin négatif, mettez de côté un tube dans chaque type de fluorochrome, pour un contrôle non coloré. Dans ce tube, incuber les cellules avec 200 microlitres de tampon bloquant sans anticorps.

Incuber les échantillons sur de la glace pendant 45 minutes, en tapotant par intermittence toutes les 15 minutes. Centrifuger les cellules à 200 G pendant 10 minutes, à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant.

Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes à température ambiante, si nécessaire pour les stocker pendant plusieurs jours. Remettre en suspension les cellules dans 200 microlitres de tampon de coloration FACS, 2% FBS dans PBS. Acquérir les données dans le cytomètre en flux.

Les images des plaques de gélose SS montrées ici indiquent la charge d’UFC dans le foie et la rate des souris septiques. L’organe homogénéisé Lys6 a été étalé à une dilution de 10 à la puissance moins un, et incubé à 37 degrés Celsius. Les colonies de S.Typhimurium à pigment noir sont apparues environ 12 heures après l’incubation.

Une partie de la plaque est montrée ici sous forme d’encart zoomé pour mettre en évidence les colonies. Ces résultats suggèrent que l’agent pathogène s’est disséminé avec succès de manière systémique et a colonisé les organes internes. Cette figure montre les sérums isolés de souris saines et septiques.

Le volume de sang collectable de souris septiques est inférieur à celui des témoins sains, de sorte que le sérum obtenu est moindre. Cela se produit en raison de la coagulation accrue dans la septicémie. De plus, les sérums de souris septiques présentent une coloration rouge distincte, indiquant l’apparition d’une hémolyse étendue.

La figure montre des tracés cytométriques de cellules péritonéales de souris saines et septiques, colorées avec des anticorps anti-Ly6G. Ces images sont représentatives d’une souris en bonne santé et de deux souris infectées. Les souris septiques ont vu une infiltration accrue de neutrophiles dans la cavité péritonéale.

Dans cette vidéo, nous avons montré une méthode d’induction de la septicémie bactérienne chez la souris, par injection intrapéritonéale de Salmonella Typhimurium. Il s’agit d’un modèle utile pour étudier les effets des interventions thérapeutiques sur l’atténuation de la septicémie. Dans ce système modèle, la composition cellulaire de la cavité péritonéale change radicalement afin de lutter contre l’agent pathogène.

Par conséquent, c’est un modèle utile, dans l’étude des changements cinétiques dans les compositions et les fonctions des cellules immunitaires pendant la septicémie. Le modèle est également utile pour comprendre l’augmentation des espèces réactives intercellulaires de l’oxygène, les niveaux de cytokines pro-inflammatoires, l’hémolyse et la coagulation sanguine, qui se produisent tous pendant la septicémie.