Name: Visualisation de la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Découvrez une méthode simple de détection de la motilité bactérienne basée sur la réaction colorée du TTC avec les déshydrogénases intracellulaires. Cette technique accessible permet d'étudier la pathogénicité de souches comme Staphylococcus aureus et Escherichia coli.

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Cette étude a été soutenue par le développement de programmes académiques prioritaires des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD) et le projet de recherche sur la réforme de l’enseignement de l’Université pharmaceutique de Chine (2019XJYB18).

1. Préparation du milieu semi-solide
<ol><li>Gélose semi-solide traditionnelle
	<ol><li>Préparer la gélose semi-solide traditionnelle selon la recette du milieu d’essai de motilité bactérienne en utilisant les ingrédients de base11. Dissoudre 10 g de tryptose, 15 g de NaCl, 4 g de gélose dans suffisamment d’eau distillée, ajuster le pH à 7,2 ± 0,2 et compléter le volume final à 1 000 mL.</li>
		<li>Autoclaver la gélose à 121 °C pendant 20 min et la distribuer dans des tubes à essai de 10 mL en milieu semi-solide de 3 cm de hauteur.</li>
	</ol></li>
	<li>Gélose semi-solide traditionnelle avec TTC
	<ol><li>Après avoir autoclavé le milieu semi-solide conventionnel, refroidissez-le à 50 °C, ajoutez 5 mL de solution stérile à 1 % de TTC à 100 mL de milieu, mélangez-le et distribuez-le dans des tubes à essai de 10 ml pour former un milieu semi-solide de 3 cm de haut.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Souches bactériennes
REMARQUE : Quatre-vingts souches ont été isolées du milieu aquatique et identifiées à l’aide d’un instrument automatisé d’identification des bactéries (voir le tableau des matières), y compris Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae et Aeromonas hydrophila (tableau 1). Staphylococcus aureus (voir le tableau des matériaux) a été utilisé comme témoin négatif non mobile; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Salmonella typhimurium (voir le tableau des matières) ont été utilisées comme souches témoins positives.
<ol><li>Identifier les souches bactériennes à utiliser pour l’analyse de la motilité.</li>
	<li>Inclure les témoins négatifs non mobiles et les souches témoins positives mobiles.</li>
</ol>3. Observation de la motilité bactérienne améliorée par le TTC
<ol><li>Prélever des colonies individuelles de bactéries d’essai dans des boîtes de gélose et les inoculer dans les deux milieux semi-solides ci-dessus (étapes 1.1.2 et 1.2.1) par perforation à l’aide d’aiguilles d’inoculation.</li>
	<li>Culture des tubes à 37 °C dans l’incubateur pendant 24-48 h pour observer les résultats.</li>
	<li>Observez l’état de croissance : caractérisez la bactérie comme non mobile (-) si seule la ligne de ponction est rouge. Caractériser la bactérie comme mobile (+) si la couleur rouge se propage légèrement vers l’extérieur le long de la ligne de ponction12.</li>
</ol>4. Effet de différentes concentrations de gélose sur la motilité bactérienne
<ol><li>Préparer des milieux semi-solides contenant 0,3 %, 0,5 % et 0,8 % de gélose et les inoculer par perforation, comme décrit ci-dessus. Observez les résultats après 24-48 h d’incubation.</li>
</ol>

<ol><li>Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 27 (2), 165(1934).</li>
<li>Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility+and+its+role+during+initial+stage+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis.</a> Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).</li>
<li>Ding, S. S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+flagella-dependent+motility+and+biofilm+in+bacteria+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Microbiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review.</a> Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).</li>
<li>Zeng, J., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+mechanism+of+bacterial+resistance+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance.</a> Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).</li>
<li>Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+mechanism+of+bacterial+flagellum+motility%2C+adhesion+and+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape.</a> Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).</li>
<li>Leboffe, M. J., Pierce, B. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeboffe%2C+MJ+%22Microbiology%3A+laboratory+theory+and+application.+Third+edition%22">Microbiology: laboratory theory and application. Third edition</a>. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).</li>
<li>Ball, R. J., Sellers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+motility+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improved motility medium.</a> Applied Microbiology. 14, 670-673 (1966).</li>
<li>An, S., Wu, J., Zhang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+dispersal+by+a+cyclic-di-GMP+phosphodiesterase+with+a+putative+hypoxia-sensing+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).</li>
<li>Chouhan, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+site-directed+mutagenesis+at+the+GGEEF+domain+of+the+biofilm+forming+GGEEF+protein+from+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae.</a> AMB Express. 6 (1), 2(2016).</li>
<li>McLaughlin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+colorimetric+microplate+test+of+phage+lysis+in+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica.</a> Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).</li>
<li>Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Difco+Laboratories%22">Difco Laboratories</a>. , Detroit. (1984).</li>
<li>Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+semi-solid+agar+for+the+detection+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 31 (6), 575(1936).</li>
<li>Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explore+the+influencing+factors+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Care+Today%22%5BJournal%5D)">Explore the influencing factors of bacterial motility.</a> Health Care Today. 6, 50-51 (2018).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Phytophthora+pathogens+deploy+effectors+to+interfere+with+bacterial+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 581511(2020).</li>
<li>Kühn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+arrangement+of+several+flagellins+within+bacterial+flagella+improves+motility+in+different+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments.</a> Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).</li>
<li>Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+agar+concentration+on+the+growth+and+morphology+of+submerged+colonies+of+motile+and+non-motile+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria.</a> Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).</li>
<li>Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+mechanism+for+how+sigma+factor+AlgT+and+transcriptional+regulator+AmrZ+inhibit+twitching+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).</li>
<li>Bartley, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+and+invasion+of+Neisseria+meningitidis+to+host+cells+is+related+to+surface+hydrophobicity%2C+bacterial+cell+size+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule.</a> PLoS One. 8, 55798(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

La détection de la motilité bactérienne par la méthode en milieu semi-solide est affectée par de nombreux facteurs13,14. Les conditions de croissance bactérienne, telles que l’oxygène (aérobie sur la surface de la gélose, non aérobie au fond du tube avec le milieu semi-solide), le pH et la température, peuvent affecter la viabilité des flagelles bactériens, ce qui peut entraîner une motilité réduite ou même une perte de motilité15. De plus...

La motilité bactérienne joue un rôle essentiel dans la pathogénicité bactérienne, la formation de biofilms et la résistance aux médicaments1. La motilité bactérienne est étroitement associée à la pathogénicité et est nécessaire à la colonisation bactérienne lors de l’infection précoce des cellules hôtes2. La formation de biofilm est étroitement liée à la motilité bactérienne, où les bactéries adhèrent à la surface des milieux solides par motilité. La motilité bactérienne a longtemps été considérée comme positivement corrélée à la formation de biofilm. Un degré élevé de résistance bactérienne aux médicaments dû au biofilm peut entraîner des infections persistantes qui constituent une menace pour la santé humaine 3,4,5. Par conséquent, il est important de détecter la motilité bactérienne. Le test de motilité bactérienne est principalement utilisé pour examiner la motilité de différentes formes de bactéries à l’état vivant, ce qui peut déterminer indirectement la présence ou l’absence de flagelles et, par conséquent, joue un rôle important dans l’identification des bactéries.
Il existe des méthodes directes et indirectes pour détecter la motilité bactérienne6. Comme les bactéries avec flagelles montrent la motilité, il est possible de détecter si les bactéries sont mobiles indirectement en détectant la présence ou l’absence de flagelles. Par exemple, il est possible de détecter la motilité indirectement par microscopie électronique et coloration flagellaire pour indiquer que les bactéries sont mobiles. Il est également possible de détecter par des méthodes directes, telles que la chute de suspension et les méthodes de ponction semi-solide. 
La méthode de ponction semi-solide couramment utilisée dans les laboratoires de microbiologie de premier cycle pour détecter la motilité bactérienne inocule les bactéries dans la ponction dans le milieu gélose semi-solide contenant 0,4 à 0,8% d’agar, selon la direction de la croissance bactérienne. Si les bactéries se développent le long de la ligne de ponction pour se propager, des traces de croissance en forme de nuage (en forme de brosse) apparaissent, indiquant la présence de flagelles et, par conséquent, la motilité. S’il n’y a pas de traces de croissance de la ligne de ponction, la bactérie n’est ni flagellée ni mobile. 
Cependant, cette méthode a ses inconvénients: les bactéries sont incolores et transparentes, l’activité flagellaire est affectée par les caractéristiques physiologiques des bactéries vivantes et d’autres facteurs, ainsi que par la concentration de gélose et le petit diamètre du tube à essai. De plus, les bactéries aérobies ne conviennent qu’à la croissance sur la surface de la gélose, ce qui affecte l’observation de la motilité bactérienne. Par conséquent, pour améliorer cette expérience, du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) (incolore) a été ajouté au milieu afin d’établir une méthode plus fiable et intuitive de détermination de la motilité bactérienne que la méthode actuelle de ponction directe utilisant des déshydrogénases intracellulaires pour catalyser la formation d’un produit rouge de TTC 7,8,9,10.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>ATCC25922</td><td>Contrôle positif</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC27853</td><td>Contrôle positif</td></tr><tr><td>Salmonella typhimurium</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td>Contrôle positif</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td>Témoin non mobile négatif</td></tr><tr><td>Tryptose</td><td>&nbsp ; OXOID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>VITEK 2 système automatisé d’identification microbienne</td><td>Bio M&eacute ; rieux</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

La motilité bactérienne est cruciale pour la pathogénicité bactérienne, la formation de biofilms et la résistance aux médicaments. La motilité bactérienne est cruciale pour l’invasion et/ou la dissémination de nombreuses espèces pathogènes. Par conséquent, il est important de détecter la motilité bactérienne. Les conditions de croissance bactérienne, telles que l’oxygène, le pH et la température, peuvent affecter la croissance bactérienne et l’expression des flagelles bactériens. Cela peut entraîner une réduction de la motilité ou même une perte de motilité, ce qui entraîne une évaluation inexacte de la motilité bactérienne. Sur la base de la réaction de couleur du chlorure de 2,3,5-triphényle tétrazolium (TTC) par les déshydrogénases intracellulaires de bactéries vivantes, le TTC a été ajouté à la gélose semi-solide traditionnelle pour la détection de la motilité bactérienne. Les résultats ont montré que cette méthode de gélose semi-solide TTC pour la détection de la motilité bactérienne est simple, facile à utiliser et n’implique pas de gros instruments coûteux. Les résultats ont également montré que la motilité la plus élevée a été observée en milieu semi-solide préparé avec de la gélose à 0,3%. Par rapport au milieu semi-solide traditionnel, les résultats sont plus faciles à évaluer et plus précis.

Les souches standard et les souches isolées ont été comparées pour la détection de la motilité, et les résultats sont présentés dans le tableau 1. En raison de l’absence de flagelles, Staphylococcus aureus et Klebsiella pneumoniae ne se sont développés que le long de la ligne inoculée sur des milieux semi-solides traditionnels et TTC. En revanche, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli et Salmonella typhimurium ont montré une croissance dans toutes les direc...

Ici, nous présentons un protocole pour détecter la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est facile à évaluer et plus précise, et ne nécessite pas d’équipement spécialisé.

Visualisation de la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...

La détection de la motilité bactérienne est importante car elle est cruciale pour la pathogénicité. Le protocole décrit ici est une méthode fiable pour la détection de la motilité bactérienne, car il est basé sur la réaction de couleur de la TTC avec les déshydrogénases intracellulaires des bactéries vivantes. La méthode de gélose semi-solide TTC pour détecter la motilité bactérienne est simple, facile à utiliser et n’implique pas d’instruments volumineux et coûteux.La méthode peut être utilisée par les microbiologistes cliniques ou les chercheurs pour étudier les bactéries pathogènes. La démonstration de la procédure sera faite par Xiyi Zhuang, un expérimentateur senior de mon laboratoire. Pour commencer, préparez le milieu semi-solide traditionnel en ajoutant 10 grammes de tryptose, 15 grammes de chlorure de sodium et quatre grammes de gélose dans un volume adéquat d’eau distillée.Ajustez le pH à 7,2 et augmentez le volume final à 1 000 millilitres. Autoclavez le milieu à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes et distribuez le milieu dans des tubes à essai de 10 millilitres à une hauteur de trois centimètres. Pour préparer le milieu TTC, refroidissez le milieu traditionnel autoclavé à 50 degrés Celsius, puis ajoutez cinq millilitres de solution stérile à 1 % TTC à 100 millilitres de milieu.Mélangez et distribuez le milieu dans des tubes à essai de 10 millilitres jusqu’à une hauteur de trois centimètres. Prélevez des colonies uniques de bactéries dans des plaques de gélose et inoculancez-les dans les deux milieux semi-solides par perforation à l’aide d’aiguilles d’inoculation. N’oubliez pas d’inclure les déformations non modales comme témoins négatifs et les déformations modales comme témoins positifs.Pour observer l’effet de la concentration de gélose sur la motilité bactérienne, préparez des milieux semi-solides contenant différentes concentrations de gélose et inoculez-les par ponction. Incuber les tubes à 37 degrés Celsius et observer les résultats après 24 à 48 heures d’incubation. Si seule la ligne de perforation est rouge, caractérisez la bactérie comme non modale.Si la couleur rouge se propage vers l’extérieur le long de la ligne de ponction, caractérisez la bactérie comme modale. La motilité bactérienne a été comparée pour diverses souches sur des milieux semi-solides traditionnels et TTC et résumée dans ce tableau. Après une culture de 24 heures sur un milieu semi-solide TTC, Staphylococcus aureus a montré une croissance le long de la lignée inoculée.Alors qu’Escherichia coli a montré une croissance dans toutes les directions autour de la ligne inoculée. La motilité la plus élevée pour Escherichia coli a été observée dans un milieu semi-solide TTC préparé avec une gélose à 0,3 %, dans lequel le milieu est devenu presque entièrement rouge. En revanche, la zone de diffusion rouge a diminué à 0,5 % de gélose et la diffusion a été prolongée avec l’augmentation de la concentration de gélose à 0,8 %. Il est important d’ajuster le pH à 7,2 et de refroidir le milieu autoclavé à 50 degrés Celsius avant l’inoculation à l’aide des aiguilles.Les bactéries doivent être inoculées par perforation dans le milieu semi-solide contenant du TTC. Il s’agit d’une méthode directe de détection de la motilité bactérienne. Il est également possible de détecter la motilité indirectement par microscope électronique et

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