Purification et identification de protéines spécifiques de type cellulaire à partir de tissus complexes à l’aide d’une lignée de souris mutante d’ARNt synthétase de méthionine

Ce protocole permet de marquer les protéines d’une manière spécifique au type cellulaire. C’est la première technique qui offre une telle possibilité et elle peut être réalisée in vitro ou in vivo. Le principal avantage de la technique est que les protéines spécifiques du type de cellule marqué peuvent être purifiées non identifiées ou visualisées in situ par immunofluorescence.

Pour commencer, préparez le lysat tissulaire en ajoutant un tampon de lyse à un volume de 12 à 15 fois le poids humide du tissu et triturez le tissu jusqu’à ce qu’il soit homogénéisé. Chauffer cet homogénat pendant 15 minutes à 75 degrés Celsius pour dénaturer la protéine, puis centrifuger l’échantillon et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Cet échantillon peut être conservé à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, pour l’alkylation, diluer l’échantillon homogénéisé deux à trois fois dans un tampon saline de phosphate contenant un inhibiteur de protéase sans EDTA. Ajoutez ensuite de l’iodoacétamide fraîchement préparé jusqu’à une concentration finale de 20 millimoles. Laissez l’échantillon pendant une à deux heures à 20 degrés Celsius dans l’obscurité.

Répétez deux fois les étapes d’ajout et d’incubation d’iodoacétamide. Préparez la colonne selon les instructions du fabricant en faisant d’abord tourbillonner les colonnes. Ensuite, retirez le couvercle en coupant la partie inférieure et en les centrifugeant.

Ensuite, effectuez un échange de tampon en équilibrant d’abord les colonnes d’échange de tampon à l’aide du tampon d’échange de chimie de clic, puis en échangeant tous les échantillons alkylés. Pour évaluer l’incorporation d’azidonorleucine, prélever 40 microlitres de l’échantillon mentionné et ajouter un tampon de phosphate salin à un volume final de 120 microlitres. Ensuite, configurez la réaction de chimie de clic en tourbillonnant la réaction pendant 20 secondes.

Après avoir ajouté chaque réactif dans l’ordre indiqué le plus rapidement possible, incuber les échantillons dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec une rotation continue. Le lendemain, centrifuger les échantillons pendant cinq minutes à 17 000 fois G après centrifugation une pastille légèrement turquoise sera visible. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et conserver l’échantillon à moins 80 degrés Celsius.

Pour la purification des protéines étiquetées. Soumettre tous les échantillons à une procédure d’échange tampon comme démontré pour nettoyer les restes d’alcyne libre en utilisant un tampon de liaison à la neutravidine comme tampon d’équilibre. Ensuite, lavez les perles de haute capacité neutravidine trois fois en mélangeant les perles avec le tampon de liaison.

Centrifuger le mélange, jeter le surnageant et répéter cette opération trois fois. Préparez ensuite une suspension individuelle en ajoutant le même volume de billes sèches de neutravidine et de tampon de liaison de neutravidine. Réservez 20 à 40 microlitres de chaque échantillon comme lysat pré-purifié et conservez-le à moins 20 degrés Celsius.

Après avoir mesuré la concentration en protéines de l’échantillon, mélangez un milligramme de protéines avec 40 microlitres de boue de billes. Incuber le mélange pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec une rotation continue permettant aux protéines marquées de se lier aux billes. Le lendemain, prélever le surnageant par centrifugation.

Mettez de côté une partie aliquote de 20 à 40 microlitres du surnageant pour une analyse ultérieure et congelez le reste à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, lavez les perles trois fois en ajoutant un tampon de lavage de neutravidine réfrigéré. Sédimenter les perles et jeter le surnageant.

Ajoutez ensuite le même tampon et incuber les billes pendant 10 minutes en rotation continue à quatre degrés Celsius avant de jeter le surnageant. Répéter le lavage avec les tampons de lavage de neutravidine deux et trois, et éluer les protéines cliquetées en incubant les billes pendant 30 minutes à 20 degrés Celsius avec un volume de tampon d’élution de neutravidine, correspondant à un volume des billes sèches utilisées. Pendant l’élution, maintenir les billes en suspension à 1000 tours par minute dans un agitateur thermobloc éluder deux fois et combiner les deux élus.

Les réactions au clic ont été analysées par page SDS et Western immuno blot. Des images représentatives des expériences sont présentées pour l’administration d’azidonorleucine par injection intrapéritonéale et pour l’administration d’azidonorleucine par eau potable. Une autre expérience fournit un exemple pour la détermination de la concentration optimale d’alcyne clivable en disulfure de biotine.

Dans cet exemple, le changement de pli entre l’échantillon marqué et le témoin est le plus élevé à 14 concentrations d’alcyne micromolaire. Un exemple de résultat de spectrométrie de masse avec un enrichissement clair dans l’échantillon marqué à l’azidonorleucine par rapport au témoin est montré ici. Cette différence était déjà visible dans la coloration protéique totale.

Outre les changements d’intensité peptidique, il existe également des protéines uniques trouvées dans les deux échantillons. Il s’agit d’un protocole techniquement complexe et c’est une étape qui doit être soigneusement suivie en utilisant une alkylation de contrôle négatif appropriée, un nettoyage approprié (indistinct) et adéquat de l’archive sans clic. Nos étapes clés dans ce protocole, les protéines purifiées peuvent être identifiées soit par spectrométrie de masse si l’intérêt des chercheurs est d’étudier les protéines, soit les charger dans un gel pour étudier les protéines d’intérêt par transfert Western.

La capacité de cette méthode à marquer des protéines d’origine cellulaire spécifique a de nombreuses applications telles que la tension des protéines ou l’étude de la synthèse des protéines in vitro ou in vivo.