Name: Extraction à petite échelle de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Apprenez une méthode rapide et économique d'extraction d'ADN génomique de Caenorhabditis elegans adaptée aux salles de classe et à la recherche. Ce protocole produit des modèles ADN fiables pour les applications PCR.

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La souche N2 et la bactérie E. coli OP50 ont été obtenues auprès du Caenorhabditis Genetics Center (CGC), financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). La souche blmp-1(tm548) a été obtenue à partir du National Bioresource Project, au Japon. Les auteurs remercient WormBase. Ce travail a été soutenu par NIH R01GM097591 à T.L.G., un financement interne par la Texas Woman’s University à T.L.G, et le Centre de recherche étudiante de TWU à M.F.L.

1. Entretien de C. elegans
REMARQUE : Les souches N2 (type sauvage) et blmp-1(tm548) de C. elegans ont été maintenues sur des plaques de milieux de croissance de nématodes (NGM) standard à 20 °C.
<ol><li>Préparer les plaques de NGM en dissolvant 23,005 g de poudre de NGM dans 973 mL d’eau dans une fiole de 2 L. Couvrez l’ouverture du ballon avec du papier d’aluminium (ou un capuchon autoclavable qui permet la ventilation) et fixez le revêtement avec du ruban adhésif autoclave. Autoclave pour dissoudre la poudre et stériliser le contenu avec un cycle de stérilisation d’au moins 30 min.</li>
	<li>Refroidir le milieu à 60 °C au bain-marie.</li>
	<li>Au milieu refroidi, ajouter 25 mL de tampon stérile de phosphate 1 M (KH2PO4), pH 6,0; 1 mL de solution de chlorure de calcium 1 M; et 1 mL de solution de sulfate de magnésium 1 M.</li>
	<li>Remuer le milieu sur une plaque magnétique pour obtenir un mélange homogène et éviter un refroidissement et une solidification inégaux (~5 min). Assurez-vous que la barre d’agitation tourne assez vite pour créer un vortex, mais pas si vite que des bulles sont introduites (~ 250-300 tr / min).</li>
	<li>Versez ~25 mL du milieu dans chaque plaque de Petri de 10 cm (~40 plaques au total). Sécher les plaques à température ambiante pendant la nuit (généralement 16-25 °C).</li>
	<li>Cultivez une colonie d’Escherichia coli OP50 dans 30 à 50 mL de bouillon LB pendant la nuit à 37 °C.</li>
	<li>Ensemencez chaque plaque avec 500 μL de culture d’E. coli OP50 et laissez-les sécher à température ambiante avant utilisation (généralement 16-25 °C)8. Conserver les plaques à 4 °C jusqu’à 3 semaines.</li>
	<li>Transférer C. elegans sur des plaques ensemencées à l’aide d’un pic à fil ou d’une autre méthode et les laisser grandir jusqu’au stade L4 ou adulte à la température requise pour la souche (généralement 16-25 °C, 1-2 jours si les animaux étaient plaqués affamés comme dauers, 3-4 jours si les animaux étaient plaqués comme embryons)8.</li>
</ol>2. Extraction de l’ADN d’un seul ver
REMARQUE: Cette méthode est utile pour extraire l’ADN d’un seul ver (un ver dans 1,8 μL de volume total). Un mélange maître peut être fait si plusieurs vers sont lysés en même temps.
<ol><li>Programmer un thermocycleur pour un cycle à 55 °C pendant 10 min suivi de 95 °C pendant 3 min (programme de lyse).</li>
	<li>Aliquote 0,8 μL de la solution d’extraction du kit sur la paroi intérieure d’un tube PCR de 0,2 mL sur glace. Ajouter 0,2 μL de la solution de préparation tissulaire du kit à la gouttelette de la solution d’extraction. Mélanger par pipetage.</li>
	<li>Identifier un animal L4 ou adulte sous un microscope à dissection9. Pour identifier les hermaphrodites L4, recherchez une vulve caractéristique visible sous la forme d’un demi-cercle pâle au milieu de l’animal. Identifiez les hermaphrodites adultes en recherchant les plus gros animaux sur la plaque qui peuvent avoir des embryons ovales visibles dans leur utérus.</li>
	<li>À l’aide d’un pic à fil de platine, transférez l’animal sélectionné dans la solution10.</li>
	<li>Centrifugez brièvement le tube (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g) à température ambiante pour en recueillir le contenu au fond du tube.</li>
	<li>Placez le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme de lyse défini à l’étape 2.1.</li>
	<li>Lorsque le programme est terminé, centrifugez brièvement le tube et placez-le sur de la glace. Ajouter 0,8 μL de la solution de neutralisation du kit au mélange. Mélanger par pipetage.</li>
	<li>Centrifuger brièvement le tube à température ambiante (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g).</li>
	<li>Utilisez directement le lysat pour la PCR ou stockez-le à 4 °C ou −20 °C pour une utilisation future. REMARQUE: L’ADN extrait est stable à 4 °C ou −20 °C pendant au moins 6 mois7.</li>
</ol>3. Extraction de l’ADN de quelques individus
REMARQUE: Cette méthode est utile pour extraire l’ADN de quelques vers. Un mélange maître peut être préparé si plusieurs souches sont lysées en même temps.
<ol><li>Programmer le thermocycleur pour un cycle à 55 °C pendant 10 min suivi de 95 °C pendant 3 min (programme de lyse).</li>
	<li>Aliquote 2,0 μL de la solution d’extraction du kit sur la paroi intérieure d’un tube PCR de 0,2 mL sur glace. Ajouter 0,5 μL de la solution de préparation tissulaire du kit à la gouttelette de la solution d’extraction. Mélanger par pipetage.</li>
	<li>Identifier L4 ou les animaux adultes sous un microscope à dissection9. Les hermaphrodites L4 ont une vulve caractéristique qui est visible comme un demi-cercle pâle au milieu de l’animal. Les hermaphrodites adultes sont les plus gros animaux de la plaque et peuvent avoir des embryons ovales visibles dans leur utérus.</li>
	<li>À l’aide d’un pic de fil de platine, transférez quelques animaux dans la solution : 9 animaux produisent 1 équivalent animal d’ADN génomique pour 0,5 μL de lysat, et 16 animaux produisent environ 1 équivalent animal d’ADN génomique dans 0,25 μL (3,5 nématodes/μL)10. REMARQUE: Il est difficile de transférer plus de 16 animaux dans ce volume.</li>
	<li>Centrifuger brièvement le tube à température ambiante (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g).</li>
	<li>Placez le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme de lyse défini à l’étape 3.1.</li>
	<li>Lorsque le programme est terminé, centrifugez brièvement le tube et placez-le sur de la glace. Ajouter 2 μL de la solution de neutralisation du kit au mélange. Mélanger par pipetage.</li>
	<li>Centrifuger brièvement le tube à température ambiante (2-3 s, ≤6 000 tr/min/2 000 × g).</li>
	<li>Utilisez directement la lyse pour la PCR ou stockez-la à 4 °C ou −20 °C pour une utilisation future. REMARQUE: L’ADN extrait est stable à 4 °C ou −20 °C pendant au moins 6 mois7.</li>
</ol>4. Réaction PCR
REMARQUE: Une application en aval de cette technique de lyse par ver, détectant une mutation de délétion à l’aide d’une polymérase rapide, est décrite. L’efficacité des deux protocoles de lyse des vers dans la production d’ADN modèle génomique pour une PCR réussie à des dilutions à 1/50ème d’un ver par réaction est également démontrée.
<ol><li>Extraire l’ADN d’un seul ver et de 16 vers à l’aide de N2 de type sauvage et de souches mutantes, comme décrit ci-dessus aux étapes 2 et 3.</li>
	<li>Préparer des dilutions 2, 10, 20 et 50 fois de l’ADN d’un seul ver provenant d’animaux N2 de type sauvage.</li>
	<li>Mettre en place des réactions pcR suivant le protocole du fabricant à l’aide d’amorces spécifiques à la séquence d’intérêt et d’un mélange maître de PCR à démarrage à chaud (tableau 1 et tableau 2). Utilisez 1 μL d’ADN non dilué ou 2 μL d’ADN dilué comme modèle dans chaque réaction.</li>
	<li>Confirmer les produits pcrifiques par électrophorèse sur gel et imagerie11.</li>
</ol>

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).</li>
<li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li>
<li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li>
<li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNPs%3A+introduction+and+two-point+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).</li>
<li>Biron, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiron%2C+D+%22C.+elegans%3A+Methods+and+Applications%22">C. elegans: Methods and Applications</a>. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).</li>
<li>Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).</li>
<li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+SMA-10%2FLRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).</li>
<li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).</li>
<li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li>
<li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRE-1%2FFBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1%2FBLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li>
<li>Huang, T. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1%2FBlimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).</li>
<li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+between+the+DBL-1%2FBMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li>
<li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Déterminer les génotypes de C. elegans est une étape importante lors de la réalisation de croisements génétiques pour créer de nouvelles souches de C. elegans . L’extraction génomique de l’ADN à l’aide d’un seul ou de quelques C. elegans est une étape cruciale dans le génotypage de C. elegans. Ce protocole décrit l’extraction d’ADN génomique de C. elegans à l’aide d’un kit commercial. Cette méthode est rapide et fonctionne de manière robuste. L’ADN génomique extrait à l’aide d...

Ici, deux protocoles connexes sont présentés pour la lyse de Caenorhabditis elegans afin de rendre l’ADN accessible pour les applications basées sur la PCR. La PCR est une technique moléculaire couramment utilisée pour de nombreuses applications, y compris le génotypage et l’amplification de fragments d’ADN pour le clonage et le séquençage, entre autres. Le petit ver rond (1 mm) vivant librement C. elegans est un système animal populaire pour la recherche biologique. L’obtention d’ADN génomique approprié à partir d’un seul animal ou de quelques animaux est suffisante pour amplifier la séquence par PCR. Les larves et les adultes de la fin de la L4 ne contiennent que ~1 000 cellules somatiques (y compris certaines cellules polyploïdes multinucléaires), des cellules germinales et (si l’animal est un hermaphrodite gravide) une progéniture in utero1. Cependant, ces animaux sont protégés par une cuticule qui doit être perturbée pour extraire l’ADN génomique2. Les méthodes standard pour préparer un modèle d’ADN génomique de nématode pour la PCR impliquent plusieurs étapes et prennent plusieurs heures. Les animaux sont d’abord congelés dans un tampon de lyse de ver contenant de la protéinase K (−70 °C ou moins) pendant au moins 15 à 45 min (plus longtemps est recommandé par certains protocoles)3,4,5,6. Cette étape ouvre les animaux.
Après congélation, les animaux sont incubés pendant 1 h à 60-65 °C pour que la protéinase K fonctionne, puis l’enzyme est inactivée pendant 15-30 min à 95 °C. La protéinase K détruit les nucléases qui dégradent l’ADN. L’inactivation de la protéinase K avant la PCR est importante pour empêcher la protéinase K de dégrader l’ADN polymérase. Les deux protocoles basés sur des kits décrits ici sont des méthodes rapides, fiables et rentables pour extraire l’ADN génomique d’un seul animal ou de quelques nématodes pour la recherche quotidienne et l’enseignement des applications de laboratoire. Le kit utilisé a été optimisé à l’origine par le fabricant pour extraire l’ADN des tissus animaux, de la salive et des cheveux7. Il utilise une solution exclusive de préparation tissulaire et une solution d’extraction pour lyser les cellules et rendre l’ADN génomique accessible. Une solution de neutralisation exclusive neutralise ensuite les composants qui peuvent inhiber la PCR (par exemple, les sels, les ions et les molécules de liaison Mg2+).
Lors du génotypage, un seul animal peut être testé. Pour déterminer si une souche est homozygote, le fait de tester six descendants ou plus d’un seul animal donne une grande confiance qu’une lignée est homozygote ou non (il y a 0,02 % de chances de choisir au hasard six descendants mutants homozygotes d’un parent hétérozygote [(1/4)6 × 100 % = 0,02 %]). Cette méthode 1) est simple, avec moins d’étapes que la méthode de la protéinase K, et 2) réduit le temps de préparation du gabarit à 15 min. Les résultats de ce travail démontrent que le protocole développé fonctionne de manière robuste dans l’extraction de l’ADN génomique d’un ou de quelques vers, qui peut être utilisé de manière fiable pour des applications en aval qui ne nécessitent pas d’ADN hautement purifié, y compris la PCR.

<table><tbody><tr><td>ruban d’autoclave</td><td>Defend</td><td>43237-2</td><td></td></tr><tr><td>feuille d’aluminium,</td><td>Reynolds Wrap</td><td>2182934</td><td></td>chlorure de</tr><tr><td>calcium</td><td>Millipore Sigma</td><td>102382 (CAS 10035-04-8)</td><td></td></tr><tr><td>Kit Extract-N-Amp (comprend une solution de préparation des tissus, une solution d’extraction et une solution de neutralisation)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>XNAT2-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp plaque chauffante/agitateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-495H</td><td></td></tr><tr><td>LB média, Lennox, capsules</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>3002-131</td><td></td></tr><tr><td>sulfate de magnésium, pur à 97 %, anhydre</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifugeuse</td><td>Labnet International, Inc.</td><td>PrismR, C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>NEB Q5U ADN polymérase haute fidélité à démarrage à chaud</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>M0515S</td><td>"Pol E » utilisé dans la figure supplémentaire S1, une polymérase haute vitesse et haute fidélité (20&ndash ; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>NGM poudre de milieu</td><td>US Biological Life Sciences</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix avec tampon HF</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>M0531S</td><td>"Pol D » dans la figure 1B, une polymérase haute vitesse et haute fidélité (15&ndash ; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>amorces Technologies</td><td>d’ADN intégrées</td><td>Oligos d’ADN</td><td></td>personnalisés</tr><tr><td>PrimeSTAR GXL polymérase</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>R050B</td><td>"Pol C » dans la figure 1B, une polymérase haute fidélité (1 min/kb) pour les matrices riches en GC et les modèles jusqu’à 30 kb</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0,1&ndash ; 10.0 kb)</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR350A</td><td>"Pol A » sur la figure 1B, polymérase utilisée sur la figure 1A, C, D, une polymérase à grande vitesse (10 s/kb) pour des cibles jusqu’à 5 kb</td></tr><tr><td>Sigma ReadyMix Taq Mélange réactionnel PCR</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>P4600</td><td>"Pol B » sur la figure 1B, une polymérase (1 min/kb) pour des cibles jusqu’à 7 kb</td></tr><tr><td>Thermocycleur SimpliAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24812</td><td></td></tr><tr><td>barre d’agitation</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-126</td><td></td></tr><tr><td>mélangeur vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>pic à vis Genesee</td><td>Scientific Corporation</td><td>59-AWP</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction à petite échelle de l’adn génomique de caenorhabditis elegans

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

L’extraction génomique de l’ADN à partir d’un ou de quelques Caenorhabditis elegans a de nombreuses applications en aval, y compris la PCR pour les lignées de génotypage, le clonage et le séquençage. Les méthodes traditionnelles à base de protéinase K pour l’extraction de l’ADN génomique de C. elegans prennent plusieurs heures. Les kits d’extraction commerciaux qui ouvrent efficacement la cuticule de C. elegans et extraient l’ADN génomique sont limités. Une méthode facile, plus rapide (~ 15 min) et rentable d’extraction de l’ADN génomique de C. elegans qui fonctionne bien pour les applications en classe et en recherche est rapportée ici. Cette méthode d’extraction de l’ADN est optimisée pour utiliser un ou quelques nématodes larvaires tardifs (L4) ou adultes comme matériau de départ pour obtenir un modèle fiable pour effectuer la PCR. Les résultats indiquent que la qualité de l’ADN convient à l’amplification de cibles génétiques de différentes tailles par PCR, permettant le génotypage d’un ou de quelques animaux, même à des dilutions à un cinquantième de l’ADN génomique d’un seul adulte par réaction. Les protocoles signalés peuvent être utilisés de manière fiable pour produire rapidement un modèle d’ADN à partir d’un seul ou d’un petit échantillon de C. elegans pour des applications basées sur la PCR.

L’ADN génomique d’un ou de quelques adultes de type sauvage a été extrait à l’aide du kit commercial ou du protocole de lyse traditionnel pour comparer l’efficacité de ces deux méthodes. Ces lysats ont ensuite été utilisés comme modèles pour la PCR afin d’amplifier soit une cible plus grande d’environ 2 100 pb (codage blmp-1), soit une cible plus petite d’environ 500 pb (codant une partie de sma-10). Les deux méthodes ont permis d’obtenir des produits de PCR appropriés (figure 1A</s...

Voici une description de l’isolement simple et relativement rapide de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans à partir d’un ou de quelques animaux à l’aide d’un kit de tissus disponible dans le commerce. La préparation d’ADNg qui en résulte est un modèle approprié pour la PCR.

Extraction à petite échelle de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Nous avons développé une méthode simple, rapide et rentable d’extraction de l’ADN génomique de C.elegans qui fonctionne très bien pour les applications en classe et de recherche. Ces protocoles peuvent être utilisés de manière fiable pour produire rapidement des modèles d’ADN à partir d’un seul ou d’un petit échantillon de C.elegance pour les applications basées sur la PCR. Les utilisateurs qui n’ont pas d’expérience dans la cueillette de vers ou l’utilisation d’un micropipetter peuvent avoir du mal à suivre les étapes nécessitant ces compétences.Regarder un pratiquant qualifié et pratiquer peut aider. Farhan Lakdawala, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour extraire l’ADN d’un seul ver Caenorhabditis elegans, définissez d’abord le programme de lyse consistant en un cycle à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivi de 95 degrés Celsius pendant trois minutes dans un thermocycleur.Pour préparer la solution de lyse, ajoutez d’abord 0,8 microlitre de solution d’extraction du kit à la paroi intérieure d’un tube PCR de 0,2 millilitre sur glace. Ajoutez ensuite 0,2 microlitre de solution de préparation tissulaire du kit à la gouttelette de solution d’extraction et mélangez par caresses. Avec la sélection d’un ver pour l’extraction de l’ADN, identifiez d’abord un animal L4 ou adulte sous un microscope à dissection.Un hermaphrodite L4 peut être identifié par une vulve caractéristique qui est visible comme un demi-cercle pâle au milieu de l’animal. Pour identifier un hermaphrodite adulte, sélectionnez l’un des plus grands animaux de la plaque qui peut avoir des embryons ovales visibles dans son utérus. Ensuite, à l’aide d’un pic de fil en platine, transférez l’animal sélectionné dans la solution.Pour recueillir le contenu au fond du tube, centrifugez le tube pendant deux à trois secondes à 2000 x g à température ambiante. Placez ensuite le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme de lyse défini précédemment. Une fois ce programme de lyse terminé, centrifugez brièvement le tube et mettez-le sur la glace.Ajoutez ensuite 0,8 microlitre de solution de neutralisation du kit et mélangez par pipetage. Encore une fois, centrifugez le tube pendant deux à trois secondes à 2000 x g à température ambiante. Si le lysat n’est pas utilisé immédiatement, conservez le tube à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.Pour extraire l’ADN d’un ver individuel aussi, d’abord, réglez le programme de lyse d’un cycle à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivi de 95 degrés Celsius pendant trois minutes dans un thermocycleur. Ensuite, préparez la solution de lyse en ajoutant d’abord deux microlitres de la solution d’extraction du kit sur la paroi intérieure d’un tube PCR de 0,2 millilitre sur de la glace, suivi de l’ajout de 0,5 microlitre de la solution de préparation tissulaire du kit à la gouttelette de solution d’extraction, puis mélangez le contenu par pipetage. Après avoir identifié L4 ou des animaux adultes, utilisez un pic à fil de platine pour transférer un nombre suffisant d’animaux dans la solution.Ensuite, centrifugez le tube pendant deux à trois secondes à 2000 x g à température ambiante, puis placez le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme de lyse précédemment défini. Une fois le programme terminé, centrifugez brièvement le tube et placez-le sur de la glace. Ajoutez ensuite deux microlitres de la solution de neutralisation du kit au tube et mélangez par pipetage.Encore une fois, centrifugez le tube pendant deux à trois secondes à 2000 x g à température ambiante. S’il n’est pas utilisé immédiatement, conservez le lysat à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. L’ADN génomique extrait par le protocole pourrait être utilisé avec succès comme modèle de PCR, à la fois le kit commercial et la méthode traditionnelle de protéinase K ont produit de l’ADN avec des niveaux similaires d’amplification PCR d’un produit de paire de base 2100 et d’un produit de paire de bases 500.La méthode du kit pour la lyse de l’ADN a également fourni des modèles de PCR efficaces pour une variété d’enzymes d’ADN polymérase. Même à différentes dilutions, l’ADN extrait d’un seul animal par le kit commercial a pris en charge l’amplification par PCR d’un fragment d’ADN de 2100 paires de bases avec une efficacité équivalente. Cependant, l’amplification d’un fragment d’ADN de 500 paires de bases variait avec la concentration du gabarit.La pertinence de l’ADN extrait d’un seul animal ou de plusieurs animaux comme modèle de PCR pour déterminer le génotype a également été démontrée par l’amplification réussie d’un gène et de sa variante mutée. Comme ce protocole implique le pipetage d’un petit volume de réactifs, pour assurer la cohérence, utilisez un mélange maître pour les réactions multiples, une bonne technique de tuyauterie et des pipettes bien calibrées. En outre, la rotation du contenu du tube assure une lyse appropriée.Cette méthode pourrait être mise à l’échelle, adaptée pour extraire l’ADN génomique de C.elegans pour d’autres applications en aval, et pourrait être utilisée pour extraire l’ADN d’autres espèces de nématodes. Compte tenu de la simplicité, de la rapidité, de la robustesse et du faible coût du protocole, il est bien adapté aux applications de recherche et de classe où le temps et les ressources sont limités.

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