Name: Identification de fragments d’ARN résultant d’une dégradation enzymatique à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez la caractérisation de fragments d'ARN par spectrométrie de masse MALDI-TOF après dégradation enzymatique in vitro. Cette méthode fiable utilise de petites quantités d'échantillon et nécessite une formation minimale pour les études de biopolymères.

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Il est important de noter que ce travail était un effort de collaboration entre trois institutions, deux groupes de recherche et une installation centrale. La distribution et la charge de travail ont été effectuées comme suit: L’expression de la protéine (Xrn-1) a été réalisée à l’Université de Denver (Denver, CO). La synthèse, la quantification et l’expérimentation d’oligonucléotides (principalement la dégradation enzymatique) ont été menées à l’Université du Colorado à Denver (Denver, CO). L’optimisation y a également été réalisée. La détection, l’acquisition et l’analyse de MALDI-TOF ont été effectuées à l’Analytical Resources Core Facility de la Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS aimerait reconnaître un prix UROP (CU Denver) et des subventions Eureca (CU Denver) pour leur soutien. E. G.C. reconnaît le soutien de NIGMS, via R00GM115757. MJER reconnaît le soutien de NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. reconnaît l’ID de ressource : SCR_021758. Le travail a également été soutenu par un Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, de la Fondation Henry Dreyfus.

<ol><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+polymer+analyses+up+to+m%2Fz+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li>
<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10%2C000+daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li>
<li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73(2003).</li>
<li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin%3A+Source%2C+synthesis%2C+characterization%2C+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Forests%22%5BJournal%5D)">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516(2021).</li>
<li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn%2C+emmer+spelt%2C+common+wheat%2C+and+tritordeum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li>
<li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li>
<li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li>
<li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+%28MALDI%29+mass+spectrometry%3A+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li>
<li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li>
<li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li>
<li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li>
<li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2(2013).</li>
<li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+%CE%B7+and+%CE%BA+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124(2021).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176(2016).</li>
<li>Su, K. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862(2018).</li>
<li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS%2FMS+and+Top-Down+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577(2021).</li>
<li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+%288-oxoG%29+by+the+exoribonuclease+Xrn-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315(2021).</li>
<li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2%27-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189(2017).</li>
<li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li>
<li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5%27-mononucleotides+by+a+5%27+leads+to+3%27+mode+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li>
<li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611(2019).</li>
<li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li>
<li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149(2021).</li>
<li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li>
<li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule%2Fpeptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li>
<li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521(2022).</li>
<li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le principal défi dans ce flux de travail s’est posé entre la finalisation des expériences et la réalisation des analyses spectrométriques de masse. Les expériences ont été menées et achevées à l’Université du Colorado à Denver et expédiées (pendant la nuit) aux installations de l’Université d’État du Colorado. L’acquisition des données a été effectuée dès réception, selon la commodité. Plusieurs circonstances inattendues ont entraîné des retards dans le processus. Dans un cas, des dysfonctionnements inattendus de l’inst...

MALDI-TOF 1,2,3 est une technique largement utilisée pour la caractérisation et/ou la détection de molécules de tailles et de caractéristiques variables. Certaines de ses utilisations comprennent diverses applications telles que la détection de tanins à partir de ressources naturelles4, l’imagerie des métabolites dans les aliments5, la découverte ou la surveillance de cibles ou de marqueurs de médicaments cellulaires6, et les diagnostics cliniques7, pour n’en nommer que quelques-uns. L’utilisation de MALDI-TOF avec de l’ADN ou de l’ARN, dont l’utilisation sur des oligonucléotides remonte à plus de trois décennies8, où plusieurs limitations ont été notées, est pertinente pour les présents travaux. Cette technique a maintenant évolué vers un moyen fiable et couramment utilisé pour caractériser les biopolymères9 et identifier/comprendre les réactions chimiques et biochimiques, par exemple, la caractérisation des sites platinés dans l’ARN10, l’identification des fragments d’ARN après le clivage des brins11,12, ou la formation de liaisons croisées protéine-ADN13 . Ainsi, il est utile d’illustrer et de mettre en évidence les aspects importants de l’utilisation de cette technique. Les bases de MALDI-TOF ont également été décrites au format vidéo14 et ne seront pas développées plus en détail ici. En outre, son application dans un contexte d’ADN ou de protéine a déjà été décrite et illustrée dans ledit format 15,16,17.
Le protocole de détection des fragments d’ARN formés après hydrolyse enzymatique est rapporté ici. Le modèle expérimental a été choisi sur la base d’une découverte récente publiée par notre groupe18, où MALDI-TOF a été utilisé pour déterminer la réactivité unique entre l’exoribonucléase Xrn-1 et les oligonucléotides de l’ARN contenant la lésion oxydative 8-oxoG. Les 20-nucléotides longs brins ont été obtenus par synthèse en phase solide19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] et [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], tandis que Xrn-1 a été exprimé et purifié suite au rapport20 décrit précédemment. En bref, Xrn-121 est une exoribonucléase de 5'-3' avec divers rôles biologiques clés qui dégradent plusieurs types d’ARN, y compris l’ARNoxydé 22. Il a été constaté que la processivité de l’enzyme se bloque lors de la rencontre du 8-oxoG, ce qui conduit à des fragments d’ARN contenant des extrémités 5'-phosphorylées [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], et [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Enfin, il est important de noter que la spectrométrie de masse est une méthode puissante qui, grâce à diverses méthodologies, peut être adaptée à d’autres fins23,24; ainsi, le choix de la bonne méthode d’ionisation ainsi que d’autres installations expérimentales est de la plus haute importance.

<table><tbody><tr><td>0,6 mL MCT Gradué Violet</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-127</td><td></td></tr><tr><td>6'-Trihydroxyacétophénone monohydraté 98 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile 99,9 %, grade HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine triphosphate, 10 mM</td><td>New Englang Bioscience</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Citrate d’ammonium, dibasique 98 % </td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure d’ammonium 98,0 %, grade ACS</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Norme de test bactérien</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8255343</td><td></td></tr><tr><td>Source commerciale de Xrn-1</td><td>New England BioLabs</td><td>M0338S</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle, 97 %</td> <td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Analyse de la flexion logiciel</td><td>Bruker daltonics</td><td></td><td>FlexAnalysis version 3.4, Bruker Daltonics</td></tr><tr><td>Lambda 365 Spectrophotomètre UV-vis</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque MALDI : MSP 96 cible en acier rectifié</td><td>Bruker Daltonics</td><td>280799</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex LRFTOF (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td></tr><tr><td>Mili-Q IQ 7000</td><td>Le système Milipore Sigma</td><td></td><td>A Mili-Q a été utilisé pour purifier toute l’eau utilisée dans ce travail</td></tr><tr><td>Dispositifs centrifuges Nanosep avec membrane OmegaTM 10 K, bleu (24/pqt)</td><td>Média filtrant Pall Corporation</td><td>OD010C33</td>, <td>Omega (polyéthersulfone modifié) Taille des pores 10 K</td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>B7003S</td><td>Il s’agit de la solution B</td></tr><tr><td>Outil d’analyse d’oligo-empreintes</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td></tr><tr><td>Pointes de pipette P10</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-441</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette P200</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-419</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucléotide kinase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Tampon de réaction polynucléotidique kinase</td><td>Nouveau Angleterre BioLabs</td><td>B0201S</td><td>Il s’agit de la solution A</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Xrn-1 exoribonucléase</td><td>Exprimée en interne</td><td>Voir réf. 20</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip Pointes de pipette pour la préparation d’échantillons</td><td>Millipore</td><td>ZTC 18S 096</td><td>10 &micro ; L pointes de pipette chargées d’un C18 standard 0.6 & micro ; Lit L</td></tr></tbody></table>

identification de fragments d’arn résultant d’une dégradation enzymatique à l’aide de la spectrométrie de masse maldi-tof

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

L’ARN est un biopolymère présent dans tous les domaines de la vie, et ses interactions avec d’autres molécules et/ou espèces réactives, par exemple l’ADN, les protéines, les ions, les médicaments et les radicaux libres, sont omniprésentes. En conséquence, l’ARN subit diverses réactions qui incluent son clivage, sa dégradation ou sa modification, conduisant à des espèces biologiquement pertinentes avec des fonctions et des implications distinctes. Un exemple est l’oxydation de la guanine en 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), qui peut se produire en présence d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Dans l’ensemble, les procédures qui caractérisent ces produits et transformations sont largement précieuses pour la communauté scientifique. À cette fin, la spectrométrie de masse à temps de vol par ionisation laser de désorption assistée par matrice (MALDI-TOF) est une méthode largement utilisée. Le présent protocole décrit comment caractériser les fragments d’ARN formés après un traitement enzymatique. Le modèle choisi utilise une réaction entre l’ARN et l’exoribonucléase Xrn-1, où la digestion enzymatique est arrêtée aux sites oxydés. Deux séquences d’ARN long de 20 nucléotides [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] et [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ont été obtenues par synthèse en phase solide, quantifiées par spectroscopie UV-vis, et caractérisées par MALDI-TOF. Les brins obtenus ont ensuite été (1) 5'-phosphorylés et caractérisés par MALDI-TOF ; 2° traité avec Xrn-1; 3° filtré et dessalé; (4) analysé via MALDI-TOF. Cette configuration expérimentale a conduit à l’identification sans équivoque des fragments associés au décrochage de Xrn-1 : [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], et [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Les expériences décrites ont été réalisées avec 200 picomols d’ARN (20 pmol utilisés pour les analyses MALDI); cependant, des quantités plus faibles peuvent entraîner des pics détectables avec des spectromètres utilisant des sources laser plus puissantes que celle utilisée dans ce travail. Il est important de noter que la méthodologie décrite peut être généralisée et potentiellement étendue à l’identification de produits pour d’autres processus impliquant de l’ARN et de l’ADN, et peut aider à la caractérisation / élucidation d’autres voies biochimiques.

Les oligonucléotides utilisés dans ce travail ont été synthétisés, caractérisés et quantifiés avant utilisation. La concentration de tous les oligonucléotides a été déterminée par spectroscopie UV-vis enregistrée à 90 °C afin d’éviter des lectures erronées résultant de la formation potentielle des structures secondaires. La figure 3 montre les spectres du modèle d’oligonucléotides d’ARN utilisé dans ce travail, pris à température ambiante et après application de chaleur.
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MALDI-TOF a été utilisé pour caractériser des fragments obtenus à partir de la réactivité entre l’ARN oxydé et l’exoribonucléase Xrn-1. Le présent protocole décrit une méthodologie qui peut être appliquée à d’autres processus impliquant l’ARN et/ou l’ADN.

Identification de fragments d’ARN résultant d’une dégradation enzymatique à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

La spectrométrie de masse a été largement adoptée pour diverses applications. La méthodologie de cet article fournit la caractérisation sans équivoque de fragments d’ARN obtenus à partir d’un processus enzymatique in vitro. Les avantages de cette technique comprennent que le pic de fer moléculaire est obtenu, que les expériences peuvent être réalisées avec de petites quantités de matériel pour des applications in vitro et que le protocole peut être accompli avec un minimum de formation.La méthodologie décrite peut être largement appliquée aux processus d’étude impliquant l’ADN, l’ARN ou les protéines. Les exemples incluent les transformations biochimiques telles que les informations croisées, l’identification des modifications chimiques ou d’autres interactions et réactivités des biopolymères. Une difficulté peut survenir en raison de l’accessibilité à un spectromètre MALDI ou à des installations de base qui offrent ce service.Un autre aspect est l’établissement de la limite de détection qui peut être plus ou moins élevée selon l’instrument. Pour commencer, allumez le spectrophotomètre UV-Vis, puis cliquez sur l’icône PerkinElmer UV WinLab pour ouvrir la fenêtre de contrôle du fonctionnement de l’instrument. Allumez le spectrophotomètre du régulateur de température Peltier à l’aide de l’interrupteur situé à droite de l’instrument et cliquez sur Scan-Lambda 365, présent sous Méthodes de base.Un autre écran s’ouvrira et invitera l’utilisateur à s’assurer que les supports de cellule sont vides. Cliquez sur OK et laissez l’instrument effectuer ses vérifications du système. Maintenant, ajustez les paramètres d’analyse en sélectionnant Collecte de données.Dans la nouvelle fenêtre sous Paramètres de numérisation, modifiez le début à 350 nanomètres et la fin à 215 nanomètres. Activez le Peltier en sélectionnant le plus à gauche de l’accessoire. Cliquez ensuite sur Multiple Cell Peltier, modifiez les degrés de température Celsius à 25, puis cliquez sur Peltier On.Accédez à l’onglet d’informations sur l’échantillon et entrez le nombre d’échantillons, les noms et la position de cellule souhaités.Cliquez sur Autozero et insérez la cuvette contenant la solution d’arrière-plan. Cliquez sur Démarrer et insérez la cuvette dans la cellule souhaitée et assurez-vous que la fenêtre de la cuvette est orientée parallèlement à la face avant de l’instrument. Maintenant, cliquez sur OK pour commencer la première analyse à 25 degrés Celsius.Pour des mesures à des températures plus élevées, cliquez sur Multiple Cell Peltier, modifiez la température à la température d’échantillon souhaitée et répétez le balayage. Cliquez sur Fichier, Exporter et choisissez l’emplacement de fichier souhaité et sélectionnez XY Data pour obtenir un fichier texte. Pour effectuer une phosphorylation de 5' de l’ARN, préparer une solution dans un tube de microcentrifugation de 0,6 microlitre en ajoutant 33,5 microlitres d’eau sans RNase, cinq microlitres de solution A, six microlites d’adénosine triphosphate de 10 millimolaires, une microlite de solution aqueuse d’ARN micromolaire de 200 et 4,5 microlitres de polynucléotide kinase et mélanger doucement la solution.Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes en le plaçant dans un bain-marie. Ensuite, inactiver l’enzyme en plaçant le tube de réaction dans un bloc thermique, préchauffé à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Laisser la solution refroidir à température ambiante pour obtenir une solution finale d’ARN phosphorylé de 5'.Après l’incubation, utilisez 50 microlitres de cette solution, ajoutez cinq microlitres de solution B et cinq microlitres de solution de 1 femtomole de Xrn-1 pour effectuer l’hydrolyse de l’ARN. Incuber le tube de réaction à température ambiante pendant deux heures. Transférer ce mélange réactionnel dans un dispositif centrifuge de la taille d’un pore de 10 kilodaltons et filtrer les enzymes en les centrifugant pendant 10 minutes à 700 fois G.Transférer le filtrat dans un tube centrifuge de 0,6 millilitre.Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’eau sans RNase pour laver l’ARN résiduel sur le tube centrifuge, suivi d’une centrifugation. Enfin, combinez ce filtrat avec le filtrat résultant obtenu précédemment par centrifugation dans un dispositif centrifuge de la taille d’un pore de 10 kilodaltonnes, et congelez la solution à zéro degré Celsius ou expédiez pour analyse. Pour dessaler et concentrer l’échantillon, utilisez des embouts de pipette C18 échangeurs de cations disponibles dans le commerce chargés d’un lit de milieu de chromatographie en C18 à son extrémité.Pour cela, positionnez la pointe de la pipette à 10 microlitres sur une pipette à 10 microlitres et lavez cette pointe deux fois avec une solution aqueuse d’acétyl nitrile à 50%. Jeter les volumes utilisés dans un tube de déchets séparé à chaque fois et équilibrer la pointe C18 avec 10 microlitres de solution aqueuse d’acide trifluoroacétique à 0,1% deux fois. Retirez manuellement la pointe C18 de la pipette et fixez-la sur une pipette de 200 microlitres contenant une pointe de pipette P200.Ensuite, immergez la pointe C18 dans la solution résultante préparée lors de l’hydrolyse des oligonucléotides de l’ARN par Xrn-1 et aspirez la libération de la solution à travers la pointe C18 10 fois. Maintenant, détachez la pointe C18 de la pipette P200, positionnez-la sur une pipette de 10 microlitres et lavez la pointe C18 à l’aide d’une solution aqueuse d’acide trifluoroacétique à 0,1% deux fois. Jetez les volumes usagés dans un tube à déchets séparé à chaque fois.Lavez la pointe C18 avec 10 microlitres d’eau sans RNase deux fois. Pour repérer sur la plaque MALDI, éluez l’oligonucléotide d’ARN de la pointe C18 en immergeant l’échantillon dans la matrice souhaitée et en redistribuant la solution dans le tube 10 fois. Pipeter cette solution sur deux points séparés d’un microlitre chacun sur la plaque et laisser sécher les taches à l’air.La concentration d’ARN utilisée dans ce travail a été déterminée par spectroscopie UV-Visible enregistrée à 90 degrés Celsius pour éviter les lectures erronées résultant de la formation potentielle des structures secondaires. La séquence globale des événements comprenait deux parties. Premièrement, la phosphorylation efficace de l’ARN à 5', mise en évidence par l’apparition d’un seul pic correspondant au produit attendu.Et deuxièmement, le fragment de décrochage résultant du traitement du mélange d’échantillons avec Xrn-1. Les mêmes résultats ont été obtenus en utilisant une séquence différente qui contenait deux lésions oxydatives. Les changements potentiels à envisager comprennent l’élimination de l’utilisation du dispositif de filtrage ou la prise en compte de différentes matrices pour le repérage MALDI.Par exemple, l’acide sinapinique ou l’acide picolinique. Les fragments d’ARN ont été obtenus à partir d’un processus enzymatique. Ce processus a été établi en couplant MALDI, l’analyse électrophorétique, la synthèse en phase solide et le dichroïsme circulaire.Le protocole décrit a le potentiel d’être utilisé dans divers domaines, de la recherche en sciences chimiques aux applications dans le domaine biomédical.

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