Détection et quantification de cellules retenant le marquage dans des incisives de souris à l’aide d’une approche de reconstruction 3D après nettoyage des tissus

Ce protocole décrit une méthode de visualisation et de quantification in vivo et tridimensionnelle des cellules retenant le marquage de la niche de cellules souches incisives de souris. Cette technique permet de gagner du temps et est conviviale pour les nouveaux apprenants. Les images 3D sont acquises sans endommager le tissu.

La quantification 3D rend les données plus fiables et précises. Pour commencer, disséquez les mandibules. Fixez les échantillons dans du paraformaldéhyde à 4% et conservez-les à température ambiante pendant la nuit.

Après l’incubation, retirez les muscles des mandibules. Plongez-les dans une solution d’acide éthylènediaminetétraacétique 0,5 molaire pour décalcifier pendant quatre jours avec un changement de milieu quotidien sur un agitateur à 37 degrés Celsius. Décolorer les mandibules dans 15 millilitres de solution de Quadrol à 25% sur un shaker à 37 degrés Celsius pendant une journée pour éliminer le reste de l’hème sanguin.

Pour la coloration à la 5-éthynyl-2-prime-désoxyuridine de montage entier, préparez un cocktail d’étiquetage 5-éthynyl-2-prime-désoxyuridine frais comme mentionné dans le texte. Rincez les mandibules avec une solution saline tamponnée au phosphate avec Tween 20 ou PBST pendant 30 minutes sur un shaker à 37 degrés Celsius. Répéter le rinçage des mandibules avec une solution saline tamponnée au phosphate trois fois pendant trois minutes chacune, suivi de l’incubation dans un cocktail d’étiquetage 5-éthynyl-2-prime-désoxyuridine fraîchement préparé sur un shaker pendant la nuit.

Répétez le lavage de solution saline tamponnée au phosphate trois fois et effectuez une délipidation en série en plaçant les mandibules dans les solutions mentionnées dans le texte pendant six heures chacune dans un agitateur à 37 degrés Celsius. Déshydrater les mandibules dans une solution de tert-butanol-polyéthylène glycol, ou tB-PEG, pendant deux jours à 37 degrés Celsius avec le changement quotidien du milieu. Après deux jours, nettoyer la mandibule dans le milieu d’élimination du benzoate de benzyle-polyéthylèneglycol contenant 75% de benzoate de benzyle, 22% de méthacrylate de polyéthylèneglycol-méthyl-éther en moyenne 500 ou PEG-MMA500 et 3% de quadrol pour obtenir une correspondance de l’indice de réfraction et jusqu’à ce que la transparence soit atteinte.

Montez la mandibule entière nettoyée par les tissus sur des lames de cavité de marque dans le milieu d’élimination du benzoate de benzyle-polyéthylèneglycol et recouvrez-la de lames de couvercle en verre. Dans le logiciel d’imagerie confocale, définissez les paramètres d’acquisition d’image souhaités. Dans le panneau pour l’excitation fluorescente, activez le laser nécessaire pour exciter les fluorophores de manière optimale.

Dans le panneau de détection fluorescente, déplacez le curseur pour sélectionner les longueurs d’onde à mesurer. Ajouter une goutte d’huile d’immersion avec un indice de réfraction de 1,52 sur le dessus de la lamelle de couverture pour correspondre à l’indice de réfraction de la lamelle de couverture en verre et de l’objectif, et placer la mandibule montée sur la platine du microscope. Allumez les lampes fluorescentes et choisissez un objectif d’agrandissement approprié pour imager les régions d’intérêt.

En mode balayage en direct, identifiez le champ de vision pour visualiser toute la région de la mandibule dans les dimensions X et Y. Définissez les paramètres d’acquisition des stades Z supérieur et inférieur qui couvrent avec précision le volume de la niche de cellules souches dans l’incisive des souris. Utilisez une taille de pas Z de deux micromètres ou selon vos besoins.

Acquérir et enregistrer des fichiers image Z-stack au format lif. Utilisez un convertisseur de fichier de logiciel d’imagerie pour convertir le fichier image Z-stack au type de fichier au format natif. Dans le logiciel d’imagerie, cliquez sur le bouton Arène, puis choisissez Image.

Sélectionnez le fichier lif d’origine, puis choisissez le fichier fusionné. Les images seront importées dans le logiciel d’imagerie. Double-cliquez sur le fichier importé pour ouvrir l’ensemble de données d’image.

Dans le logiciel d’imagerie, accédez au panneau Réglage de l’affichage. Dans le panneau Réglage de l’affichage, cliquez sur le nom de la chaîne. Il est généralement étiqueté comme rouge en mode par défaut.

Dans la fenêtre Propriétés de l’image, cliquez sur l’onglet Couleur mappée. Dans l’option Fichier à onglet Couleur, choisissez Fire Flow, puis cliquez sur OK. Sélectionnez la couleur d’affichage pour distinguer la fluorescence d’arrière-plan et la fluorescence positive de l’échantillon. Dans le coin supérieur gauche de l’écran, dans le volet Propriétés de la scène, cliquez sur l’icône bleue intitulée Ajouter une nouvelle surface.

Désélectionnez l’icône Volume pour supprimer la majeure partie de la fluorescence d’arrière-plan, ce qui donne une fluorescence positive nettement visible lors de la segmentation manuelle. Ensuite, lancez la segmentation manuelle de la région d’intérêt, ou ROI, en cliquant sur l’onglet Créer et en sélectionnant l’onglet Ignorer la création automatique, modifier manuellement. Dans l’assistant de création manuelle de surface, cliquez sur l’onglet Contour pour choisir l’orientation en fonction des échantillons afin de contourner facilement le retour sur investissement.

Ensuite, assurez-vous que le menu du pointeur dans le coin droit est en mode Sélection. Ajustez la position de la tranche pour localiser le retour sur investissement dans le tissu. Comme mentionné précédemment, la plupart des fluorescence de fond sont déjà supprimées.

Cliquez sur le bouton Dessiner et dessinez une zone d’intérêt provisoire. Sélectionnez l’option Visibilité sur Aucune pour éviter les interférences provenant d’autres zones que le retour sur investissement, puis segmentez la région d’intérêt tranche par tranche. Une fois le dessin ROI terminé, cliquez sur Créer une surface pour obtenir une géométrie 3D du ROI.

Cliquez sur le bouton Modifier dans l’assistant de création manuelle de surface, puis sélectionnez Masquer tout. Dans la fenêtre contextuelle Masque de canal, sélectionnez Canal 1 dans les options de sélection de canal. Ensuite, sélectionnez Dupliquer le canal avant d’appliquer le masque.

Dans les paramètres du masque, sélectionnez Constant intérieur/extérieur et réglez la surface extérieure du voxel sur zéro. Dans le volet Propriétés de la scène, désélectionnez l’objet Surface, puis sélectionnez l’objet Volume. Dans Réglage de l’affichage, désélectionnez la couche rouge d’origine, puis sélectionnez la couche rouge masquée.

Et ajustez les intensités de couleur pour obtenir le retour sur investissement de fluorescence 3D et marqué positivement souhaité. Créez un objet spot en cliquant sur l’icône Spots pour quantifier les cellules de rétention d’étiquettes rendues en 3D en créant des taches 3D qui chevauchent de manière comparable les cellules de rétention d’étiquettes rendues en 3D. Utilisez les flèches du bas pour passer d’une étape à l’autre de l’assistant de création de spots.

Cliquez sur le bouton Terminer et sélectionnez le bouton Statistique. Ensuite, sélectionnez l’onglet Globale pour rechercher la valeur du nombre total de points dans l’image. Après le marquage de la 5-éthynyl-2-prime-désoxyuridine et le processus de nettoyage tissulaire associé au système de solvants au polyéthylèneglycol, la mandibule transparente a été obtenue.

L’échantillon modifié a été comparé à une mandibule normale sans processus de nettoyage tissulaire, et une mandibule transparente marquée par la 5-éthynyl-2-prime-désoxyuridine a été soumise à une imagerie confocale. La coupe optique de l’incisive montrait des cellules retenant le marquage dans la niche des cellules souches de l’apex de l’incisive dans le plan XY. La construction d’images 3D d’un apex incisif a montré des cellules souches quiescentes positives à la 5-éthynyl-2-prime-désoxyuridine dans la niche des cellules souches épithéliales et mésenchymateuses.

Les cellules positives à la 5-éthynyl-2-prime-désoxyuridine ont été transférées dans des points de quantification qui chevauchaient de manière comparable les cellules mésenchymateuses retenant le marquage. Les taches créées uniquement pour les cellules de rétention de marquage mésenchymateuses et uniquement pour les cellules de rétention de marquage épithéliales sont visibles dans l’image. La quantification des cellules retenant le marquage épithéliale et mésenchymateuse a également été effectuée.

Les propriétés de traitement et d’élimination sont les étapes les plus importantes et doivent être optimisées en fonction de l’utilisation du tissu pour obtenir des résultats satisfaisants. Cette méthode peut également être modifiée pour visualiser les LRC de niveau S2VGFP et dans le traçage de la lignée cellulaire pour obtenir des détails sur l’emplacement de la descendance et leur quantification ou contributions.