Name: Ex Vivo Libération d’un peptide lié au gène de la calcitonine du système trigéminovasculaire chez les rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Découvrez un modèle ex vivo pour quantifier la libération de CGRP du système trigéminovasculaire chez les rongeurs. Cette méthode permet d'évaluer les effets pharmacologiques sur trois sites distincts pour la recherche en neurosciences.

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Ce travail a été financé par la Fondation Candys.

Toutes les procédures de soins aux animaux et d’expérimentation ont été effectuées conformément au guide communautaire pour le soin et l’utilisation des animaux (2010/63/UE). Des souris C57BL/6JBomTac mâles, âgées de 10 semaines, et des rats Sprague Dawley mâles, âgés de 10 semaines, ont été utilisés pour démontrer ce protocole.
1. Préparation du liquide interstitiel synthétique
<ol><li>Préparer le liquide interstitiel synthétique (SIF) selon la recette suivante : 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mM MgSO4, 26 mM NaHCO 3, 11,70 mMNaH2PO4, 1,50 mM CaCl2, 9,60 mM Na-gluconate, 5,50 mM glucose et7,60 mM saccharose (voir tableau des matières). REMARQUE: Le SIF peut varier en fonction de la cible de stimulation, par exemple, une solution sans calcium peut être utilisée lors de l’étude des canaux calciques.</li>
	<li>Ajuster le pH à 7,4 et stabiliser le pH par gazage de carbogène (5 % de CO2 et 95 % d’O2)46.</li>
</ol>2. Euthanasie
<ol><li>Anesthésier les souris adultes et les rats avec un mélange de 70% de CO2 et 30% d’O2. Décapitater les souris à l’aide d’une paire de ciseaux et les rats à l’aide d’une guillotine (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : Utilisez une souche et un âge qui correspondent à l’objectif de la recherche. Les mâles et les femelles peuvent être utilisés dans ce modèle.</li>
	<li>Séparez la tête du corps au niveau C3-C4 de la moelle épinière. NOTE: L’euthanasie peut également être réalisée avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital (100-150 mg / kg).</li>
</ol>3. Dissection
<ol><li>Préparez le tissu de rat en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Enlevez la peau et le muscle autour de la tête et du cou à l’aide d’une paire de ciseaux (Figure 1A).</li>
		<li>Utilisez une tondeuse et des ciseaux pour séparer les mâchoires inférieures de la tête (figure 1B-C).</li>
		<li>Ouvrez la moelle épinière en insérant une tondeuse osseuse caudale dans la partie dorsale des vertèbres et retirez la partie dorsale des vertèbres pour exposer la moelle épinière et le tronc cérébral (figure 1D).</li>
		<li>Couper la partie caudale du crâne par les bords des os occipital et interpariétal pour enlever ces structures osseuses exposant le cervelet (Figure 1E). REMARQUE: Il est important de ne pas endommager le tronc cérébral et la moelle épinière lors de la coupe et de l’enlèvement des vertèbres.</li>
		<li>Isoler le TNC (Sp5C) qui coule caudalement à environ 13-16 mm du bregma de chaque côté en coupant la partie dorsolatérale du tronc cérébral avec des ciseaux à ressort. Immergez le CTN gauche et droit dans le SFI (Figure 1E-I). NOTE: La description correspond à des rats adultes.</li>
		<li>Couper la tête à mi-sagitalement pour diviser le crâne en deux à l’aide d’une scie (figure 1J-L).</li>
		<li>Retirez délicatement le cerveau sans toucher la dure-mère attachée au crâne à l’aide d’une spatule et en coupant le nerf trijumeau à l’endroit où il pénètre dans le tronc cérébral (figure 1M-P).</li>
		<li>Pour isoler le TG, coupez-le, y compris ses branches autour des bordures visuelles. Couper la branche mandibulaire où elle pénètre dans le foramen ovale. Coupez les branches ophtalmiques et maxillaires entrant dans le crâne car elles ne sont pas divisées macroscopiquement. Lors de la dissection du TG, retirez la dure-mère qui recouvre le TG (Figure 1Q-T).</li>
		<li>Immergez les moitiés crâniennes et les TG dans SIF.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez le tissu de souris en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Enlevez la peau et les muscles autour de la tête et du cou à l’aide de petits ciseaux (figure 2A-B).</li>
		<li>Ouvrez la moelle épinière en insérant une paire de petits ciseaux caudale dans la partie dorsale des vertèbres et retirez la partie dorsale des vertèbres pour exposer la moelle épinière et le tronc cérébral (figure 2C). REMARQUE: Il est important de ne pas endommager la moelle épinière lors de la coupe et de l’enlèvement des vertèbres.</li>
		<li>Couper le crâne par les bords des os occipital et interpariétal pour enlever ces structures osseuses exposant le cervelet (Figure 2D-F).</li>
		<li>Ensuite, coupez l’os pariétal à mi-sagital et retirez l’os pour exposer le cerveau (Figure 2G-I).</li>
		<li>Retirez délicatement le cervelet à l’aide d’une spatule pour exposer le tronc cérébral (figure 2J).</li>
		<li>Isoler la partie du tronc cérébral contenant du TNC à l’aide de ciseaux à ressort (Figure 2K-N). Immergez le tronc cérébral avec TNC dans SIF (Figure 2O).</li>
		<li>Retirez le cerveau et coupez le nerf trijumeau à l’endroit où il pénètre dans le tronc cérébral (Figure 2P-Q).</li>
		<li>Pour isoler le TG, coupez-le, y compris ses branches autour des bordures visuelles. Couper la branche mandibulaire où elle pénètre dans le foramen ovale. Coupez les branches ophtalmiques et maxillaires entrant dans le crâne car elles ne sont pas divisées macroscopiquement. Lors de la dissection du TG, retirez la dure-mère qui le recouvre (figure 2R-S).</li>
		<li>Immerger les TG dans le FSI (figure 2T).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Lavage
<ol><li>Lavez les moitiés de crâne, les CTN et les TG dans le SIF pendant 30 minutes tout en remplaçant le SIF toutes les 5 minutes à température ambiante. REMARQUE : Les étapes de lavage peuvent être effectuées tout en conservant le mouchoir en papier dans des contenants en plastique munis d’un couvercle en tulle pour faciliter l’échange des SIF (figure 3A-B).</li>
	<li>Préparez le tissu de rat en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Transférer les moitiés de TNC dans des bouchons de tubes microcentrifugés séparés contenant 350 μL de SIF (figure 3C).</li>
		<li>Transférer les TG dans des bouchons de tubes de microcentrifugeuses - un TG par bouchon de tube de microcentrifugeuse contenant 350 μL de SIF (figure 3C).</li>
		<li>Placez les moitiés du crâne sur des plates-formes faites d’argile ou d’une plaque de culture à 6 puits et remplissez le crâne avec 400 μL de SIF (figure 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez le tissu de souris en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Transférer le tronc cérébral contenant du TNC dans un bouchon de tube de microcentrifugeuse contenant 250 μL de SIF (figure 3D).</li>
		<li>Transférer les deux TG dans un bouchon de tube de microcentrifugeuse contenant 250 μL de SIF (figure 3D). REMARQUE : Placez deux TG par bouchon de tube de microcentrifugeuse lorsque vous utilisez du tissu de souris.</li>
	</ol></li>
	<li>Placer les crânes de rats et les capsules de tubes microcentrifugeuses avec du tissu de rat et de souris dans un incubateur humidifié à 37 °C. Remplacez SIF à l’aide d’une pipette toutes les 5 minutes pendant 20 min. REMARQUE: Il est important de ne pas toucher le tissu lors de l’ajout et du retrait du SIF.</li>
</ol>5. Dépistage des drogues
<ol><li>Déterminez les niveaux de libération du CGRP basal.<ol><li>Après le dernier lavage, ajouter 250 μL de SIF à la souris TG et TNC. Ajouter 350 μL à la TG et au TNC du rat et 400 μL à chaque crâne de rat.</li>
		<li>Après 10 minutes d’incubation, prélever 200 μL de l’échantillon dans un tube microcentrifuge et ajouter 50 μL de tampon EIA 10x (fourni avec la trousse d’immunodosage enzymatique CGRP, voir Tableau des matériaux) pour permettre la mesure de la libération basale de CGRP (étape 6). Jetez le liquide restant. REMARQUE : Le temps d’incubation doit être le même pour tous les échantillons.</li>
		<li>Conserver immédiatement les échantillons à -20 °C.</li>
		<li>Après échantillonnage des niveaux de libération de CGRP basaux, suivre l’une des trois méthodes suivantes : (A) stimulation unique (étape 5.2); (B) Stimulation concentration-réponse (étape 5.3); et (C) Inhibition de la stimulation (étape 5.4) (Figure 4). NOTE: La substance d’essai et les concentrations utilisées dépendent de l’objectif de l’étude.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez une stimulation unique en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Ajouter le composé d’essai ou le véhicule dans le tissu et laisser reposer pendant 10 minutes (volume : 250 μL pour le TG et le TNC de souris, 350 μL pour le TG et le TNC du rat, et 400 μL pour chaque crâne de rat).</li>
		<li>Après 10 minutes d’incubation, prélever 200 μL de l’échantillon dans un tube à microcentrifugation avec 50 μL de tampon EIA 10x. Jeter le liquide restant et conserver immédiatement les échantillons à -20 °C. REMARQUE : Le temps d’incubation doit être le même pour tous les échantillons.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez une stimulation concentration-réponse en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Diluer la substance d’essai ou le véhicule aux concentrations souhaitées. Ajouter la substance d’essai à des concentrations croissantes en commençant par la concentration la plus faible. NOTE: La substance d’essai et les concentrations utilisées dépendent de l’objectif de l’étude. Par exemple, des supercinnamaldéhydes de 1 μM, 10 μM et 100 μM ont été utilisés pour la présente étude.</li>
		<li>Ajouter la concentration la plus faible (1 μM pour la présente étude) de la substance d’essai et du véhicule correspondant à deux préparations tissulaires identiques et incuber pendant 10 min (volume : 250 μL pour le tissu de souris, 350 μL pour le TG et le TNC du rat, et 400 μL pour chaque crâne de rat).</li>
		<li>Après 10 minutes d’incubation, prélever 200 μL de l’échantillon dans un tube à microcentrifugation avec 50 μL de tampon EIA 10x.</li>
		<li>Jeter le liquide restant et ajouter la deuxième concentration la plus faible (10 μM pour la présente étude) dans le tissu.</li>
		<li>Conserver immédiatement les échantillons à -20 °C.</li>
		<li>Répéter cette procédure avec les concentrations restantes (100 μM pour la présente étude).</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer l’inhibition de la stimulation en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Ajouter le bloqueur ou le véhicule au tissu et incuber pendant 10 min (volume : 250 μL pour le tissu de souris, 350 μL pour le TG et le TNC du rat, et 400 μL pour chaque crâne de rat). NOTE: Le bloqueur et la concentration utilisés dépendent de l’objectif de l’étude. Par exemple, 3 μM de glibenclamide ont été utilisés pour le résultat représentatif de la figure 5.</li>
		<li>Après 10 min d’incubation, prélever un échantillon de 200 μL dans un tube microcentrifuge avec 50 μL de tampon EIA 10x. Jeter le liquide restant et conserver immédiatement les échantillons à -20 °C.</li>
		<li>Ajouter l’agoniste ou l’agoniste + bloqueur (voir tableau des matières) au tissu et incuber pendant 10 min. NOTE: L’agoniste, le bloqueur et les concentrations utilisés dépendent de l’objectif de l’étude. Dans la présente étude, 3 μM de glibenclamide et 1 μM de capsaïcine ont été utilisés, Figure 5.</li>
		<li>Après 10 min d’incubation, prélever un échantillon de 200 μL dans un tube microcentrifuge avec 50 μL de tampon EIA 10x. Jeter le liquide restant et conserver immédiatement les échantillons à -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez un contrôle positif pour l’expérience.<ol><li>S’il y a lieu, ajouter un témoin positif (p. ex. 1 à 10 μM de capsaïcine, voir le tableau des matières) au tissu à la fin du protocole et prélever un échantillon de 200 μL dans un tube à microcentrifugation contenant 50 μL de tampon EIA 10x après une période d’incubation de 10 minutes. REMARQUE: Il est avantageux d’inclure un contrôle positif pour s’assurer que la configuration et les tissus fonctionnent. La capsaïcine 48,49,50 ou le stimulus dépolarisant du potassium (40-60 mM de KCl)46,47,49 sont couramment utilisés pour provoquer la libération de CGRP par le système trigéminovasculaire. 40-60 mM de KCl SIF sont préparés sous forme de SIF, sauf que le NaCl est échangé contre KCl sur une base équimolaire.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Analyse des concentrations de CGRP
<ol><li>Mesurer la quantité de CGRP libérée à l’aide d’une trousse d’immunodosage enzymatique (EIA) en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Mesurer la densité optique à 410 nm à l’aide d’un photomètre à plaques. Si un autre kit EIA CGRP est utilisé, mesurez la densité optique à la longueur d’onde indiquée dans le protocole du fabricant. REMARQUE : Les échantillons doivent être dilués pour correspondre à la courbe standard.</li>
	<li>Effectuer une analyse des données.<ol><li>Présenter les données sous forme de concentrations absolues ou normaliser la libération basale de CGRP par le tissu spécifique.</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode décrite a été développée à la suite d’études montrant l’importance du CGRP dans la physiopathologie de la migraine. Il est bien adapté pour étudier les mécanismes impliqués dans la libération de CGRP par le système trigéminovasculaire, ce qui est crucial pour la signalisation de la douleur dans la région de la tête. La quantité de CGRP obtenue dans ce modèle mesure directement la libération de CGRP par les nerfs trijumeaux innervant la dure-mère, la TG et le TNC. La quantité de libération de CGRP est quantitativement plus grande 45,54 que la libération mesurée dans le plasma après thermocoagulation chez l’homme, stimulation du trijumeau chez le chat 39,55,56 et pendant les crises de migraine23. Une explication pourrait être que le CGRP est dilué et dégradé dans le sang54. Cependant, il est à noter que la stimulation directe avec des produits chimiques pourrait être supérieure à l’activation physiopathologique. D’autres avantages sont qu’il est possible de localiser la libération à partir de trois sites différents dans le système trigéminovasculaire et qu’il peut être utilisé avec une manipulation pharmacologique et dans les tissus de rongeurs génétiquement modifiés.
Dernièrement, de nombreux modèles précliniques de rongeurs se concentrent sur l’administration systémique de substances et les lectures ultérieures liées à la douleur ou à la migraine en utilisant les tests de von Frey57,58, grimaçant59,60,61 ou aversion légère 62,63,64. Ces méthodes sont utiles pour comprendre les propriétés analgésiques et analgésiques de différentes substances. Cependant, ces approches ne donnent aucune information sur les tissus cibles spécifiques impliqués. Dans la méthode actuelle, le système trigéminovasculaire est divisé en trois structures: la dure-mère, la TG et le TNC. Cela permet l’exposition locale de chaque structure et l’évaluation du lieu d’action d’une substance spécifique. Cela a été utilisé dans une étude de 2011, où le rôle des canaux calciques voltage-dépendants chez le rat a été exploré, et l’inhibition de ces canaux s’est avérée différente dans les trois structures de la voie trijuminovasculaire47. Lors de la dissection des structures du système nerveux, l’axotomie est inévitable. Il a été démontré que l’axotomie modifie la transcription de divers gènes65. Ces changements transcriptionnels sont trop lents pour impacter les résultats de cette méthode, mais les changements de phosphorylation ne peuvent être exclus par rapport aux situations in vivo 46. Bien que des neuropeptides tels que le CGRP soient formés dans le soma cellulaire, la libération et l’action des neuropeptides se situent généralement au niveau des terminaisons nerveuses centrales ou périphériques. Ainsi, les études des neurones intacts, y compris les terminaux, sont intéressantes lors de l’étude de la libération de neuropeptides. Par conséquent, des méthodes d’étude des cultures de neurones à partir de ganglions isolés ont été établies pour servir de modèle aux terminaux. Cependant, les cultures de cellules neuronales sont sujettes à plusieurs problèmes car la dissociation mécanique peut détruire les neurones dans une culture46. Le délai plus long associé à la culture des cellules rend cette méthode sensible aux changements transcriptomiques dus à l’axotomie et aux conditions de culture65. De plus, l’ajout de facteurs de croissance et la culture sur les revêtements de surface ont altéré les propriétés neuronales en tant qu’émetteur et expression des récepteurs66,67,68,69. Ces problèmes sont évités lors de l’étude de ganglions intacts fraîchement isolés au lieu de cultures de cellules neuronales.
L’un des défis de la méthode de libération ex vivo du CGRP est la dissection précise du tissu nécessaire pour obtenir des résultats reproductibles. La dissection particulièrement précise du TNC est difficile car il s’agit d’une structure dans le tronc cérébral sans frontières visibles. De plus, la dure-mère est fragile et l’ablation du cerveau doit être effectuée avec soin pour assurer une structure intacte. Ces obstacles peuvent entraîner des variations de la taille des tissus et, par conséquent, des niveaux de CGRP basaux et induits par la stimulation. Cependant, cette variation peut s’expliquer par la normalisation de la version CGRP de base. Il convient également de noter que lors de l’isolement du TNC à partir de souris, toute la partie inférieure du tronc cérébral est isolée et non la partie plus spécifique contenant du TNC comme cela a été fait chez le rat. En général, il peut être avantageux d’utiliser du tissu de rat, car cela permet de mesurer la libération de CGRP par la dure-mère et une dissection plus précise du TNC. En outre, la taille du tissu permet également l’utilisation d’un rat comme contrôle du véhicule, car un rat produit deux moitiés crâniennes, deux TG et deux TNC où un morceau du tissu est utilisé pour la stimulation de la substance et l’autre pour le véhicule. Lors de l’utilisation de souris, deux animaux sont nécessaires pour une expérience car les deux TG sont regroupés dans un échantillon, et les CTN sont disséquées comme un seul tronc cérébral. Par conséquent, deux TG et un tronc cérébral sont utilisés pour la stimulation de la substance, et deux TG et un tronc cérébral d’une autre souris sont utilisés pour le contrôle du véhicule. Il en résulte l’utilisation de deux fois plus de souris que de rats pour obtenir le même nombre de réplications. Pour réduire le nombre de souris utilisées, une méthode de mesure de la libération de CGRP à partir de tranches du tronc cérébral a été suggérée49. C’est un avantage que la méthode ait été modifiée pour permettre l’utilisation de souris. Cela permet l’utilisation de nombreuses souches de souris transgéniques déjà disponibles, un outil utile pour étudier, par exemple, les voies de signalisation. Un témoin positif à la fin d’une expérience doit être inclus pour s’assurer que le tissu utilisé dans l’expérience peut libérer du CGRP. Le témoin positif pourrait être la capsaïcine agoniste TRPV1 ou le stimulus dépolarisant potassium (KCl), qui se sont avérés libérer CGRP du système trigéminovasculaire chez la souris et le rat 46,47,48,49,50. En outre, la méthode a également été adaptée pour mesurer la libération d’autres peptides pertinents comme le peptide hypophysaire activant l’adénylate cyclase (PACAP) - un autre peptide d’un grand intérêt dans la recherche sur la migraine70.
La méthode fournit un outil utile pour étudier la libération de CGRP à partir de tissus cibles spécifiques chez les rats et les souris. C’est une méthode relativement rapide qui évite les problèmes associés à la culture des neurones. Le protocole de la méthode peut facilement être modifié pour étudier la relation concentration-réponse ou l’inhibition d’une réponse par divers composés pharmacologiques. La méthode de libération ex vivo du CGRP est l’une des nombreuses méthodes précliniques utiles pour étudier le rôle du CGRP et d’autres mécanismes liés à la libération de CGRP dans la physiopathologie de la migraine.

La migraine est un trouble neurologique qui, selon l’OMS, toucherait plus de 1 milliard de personnes et est l’une des principales causes d’invaliditédans le monde 1. Ainsi, la migraine a un impact significatif sur les patients et la société. Malgré le succès clinique récent des médicaments antagonistes du CGRP, une grande proportion de patients ont besoin d’options de traitement améliorées 2,3,4,5. L’élucidation de la physiopathologie de la migraine menant à de nouveaux traitements efficaces est nécessaire. La signalisation dans le système trigéminovasculaire composé des méninges, des ganglions du trijumeau (TG) et du noyau caudalis du trijumeau (TNC) est centrale pour la physiopathologie de la migraine 6,7.
Le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) neuropeptide à 37 acides aminés a été découvert pour la première fois au début des années 1980 lorsque Amara et ses collègues ont démontré que le transcrit ARN primaire du gène de la calcitonine pouvait être traité pour donner un ARNm codant pour le CGRP en plus de la calcitonine 8,9. La recherche ultérieure a suggéré un lien avec la physiopathologie de la migraine10. CGRP est un neurotransmetteur avec de puissantes propriétés vasodilatatrices 11,12,13,14,15,16,1 7, et il est largement distribué dans le système nerveux central et périphérique 13,14,18,19,20,21,22 . L’implication du CGRP dans la migraine a été soulignée avec la découverte d’une augmentation des taux de CGRP dans la circulation extracérébrale pendant les crises de migraine chez l’homme23, et que la perfusion de CGRP provoque une douleur migraineuse chez les patients24. Deux ans plus tard, la première étude de preuve de concept de l’efficacité de l’antagoniste du CGRP olcegepant dans le traitement de la migraine a été publiée25.
Le CGRP est abondant dans le système trigéminovasculaire comme démontré dans le TG 21,26, fibres nerveuses sensorielles innervant la dure-mère27,28,29, et TNC30. Dans le système trigéminovasculaire, le CGRP se trouve dans les neurones de petite à moyenne taille de la TG, dans les fibres C non myélinisées, et est exprimée dans près de 50% de la population neuronale de la TG. Le récepteur CGRP est exprimé principalement dans les gros neurones et se trouve dans les fibres Aδ myélinisées31,32. Le CGRP est libéré par les neurones lors d’une stimulation chimique ou électrique33,34. Les études des voies menant à la libération de CGRP et de l’emplacement de cette activation sont cruciales pour comprendre la physiopathologie de la migraine. Au cours des 5 dernières décennies, les études précliniques ont contribué à acquérir des connaissances approfondies sur la signalisation liée à la migraine et ont contribué au développement de nouveaux traitements35. De nombreuses méthodes tenant compte de l’implication vasculaire et neurogène ont été modifiées et appliquées dans la recherche sur la migraine. On peut citer les modèles in vivo et in vitro de réponses artérielles à des composés biologiques ou à des traitements pharmacologiques17,36,37, et la neurostimulation électrique38,39. De plus, les neurones activés dans le TNC peuvent être détectés par l’expression c-Fos 40,41,42 et les enregistrements électrophysiologiques dans cette zone 43,44. Les deux méthodes mesurent les signaux nociceptifs transmis au cerveau par la tête, par exemple, la dure-mère. L’utilisation d’un seul modèle préclinique ne présente pas une image complète de la physiopathologie de la migraine. Par conséquent, il est important de combiner différents modèles couvrant autant d’aspects de la physiopathologie de la migraine que possible. Le développement continu de nouveaux modèles couvrira divers aspects des mécanismes de la migraine et, avec le temps, le mystère de la physiopathologie de la migraine sera découvert.
Ici, un protocole détaillé est présenté de la méthode de libération CGRP, réalisée ex vivo dans des TG et TNC isolés de souris après stimulation chimique. La libération de CGRP peut également être étudiée dans la dure-mère des rats. Ainsi, dans le protocole expérimental pour les rats, la dure-mère est décrite avec TG et TNC. La base de la méthode de libération du CGRP a été décrite pour la première fois en 1999, où Ebersberger et ses collègues ont mené des recherches pionnières et ont constaté que le CGRP était libéré de la dure-mère après stimulation chimique et électrique des afférences durales chez le rat45. Plus tard, cette approche a été étendue à la version CGRP du TG46 et du TNC47. Par la suite, la méthode a été modifiée pour s’appliquer à la TG et au TNC chez la souris. Jusqu’à présent, la libération de CGRP de la dure-mère a été difficile chez la souris.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture à 6 puits</td><td>NUNC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Merck</td><td>1.02382.1000</td><td>Pour tampon SIF</td></tr><tr><td>Bouchons pour récipients en plastique</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536617</td><td></td></tr><tr><td>Capsaïcine</td><td>Merck</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>CGRP kits</td><td>AH Diagnostics</td><td>A05482.96</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Strandm&oslash ; llen</td><td>4.6</td><td>Pour le gazage au carbogen de SIF</td></tr><tr><td>Tondeuse osseuse délicate</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>16109-14</td><td></td></tr><tr><td>Glibenclamide</td><td>Tocris</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>Pour tampon SIF</td></tr><tr><td>Guillotine pour rats</td><td>Scandidact</td><td>NS-802</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>Merck</td><td>M5921</td><td>Pour tampon SIF</td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuge + couvercles/capuchons</td><td>VWR</td><td>700-5239</td><td></td></tr><tr><td>Mini Scie à métaux</td><td>BAHCO</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>O2</td><td>Strandm&oslash ; llen</td><td>4.5</td><td>Pour le gazage au carbogen de SIF</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Pharmacie Glostrup</td><td>NA</td><td>Formule magistrale</td></tr><tr><td>Récipients en plastique</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536455</td><td></td></tr><tr><td>Photomètre à plaques - Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td>Infinite M200 n’est plus fabriqué. Un Infinite 200 PRO est disponible sur Tecan. Logiciel : SW Magellan v.6.3</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Merck</td><td>P9333</td><td>Pour tampon SIF</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Allgaier Instruments</td><td>307-156-170</td><td></td></tr><tr><td>Petits ciseaux</td><td>Allgaier Instruments</td><td>04-520-115</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Merck</td><td>S6014</td><td>Pour tampon SIF</td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>de sodiumMerck</td><td>S9888</td><td>Pour tampon SIF</td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté</td><td>Merck</td><td>1.06346.1000</td><td>Pour tampon SIF</td></tr><tr><td>Gluconate de sodium</td><td>Merck</td><td>S2054</td><td>Pour tampon SIF</td></tr><tr><td>Spatule</td><td>Bochem Lab Supply</td><td>3018</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck</td><td>84097</td><td>Pour Tampon SIF</td></tr><tr><td>Supercinnamaldehyde</td><td>Merck</td><td>S3322</td><td></td></tr><tr><td>Tulle (tissus)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Acheté dans le magasin de tissus local</td></tr></tbody></table>

ex vivo libération d’un peptide lié au gène de la calcitonine du système trigéminovasculaire chez les rongeurs

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

Le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) a été découvert pour la première fois dans les années 1980 en tant que variante d’épissure du gène de la calcitonine. Depuis sa découverte, son rôle dans la physiopathologie de la migraine a été bien établi, d’abord par ses puissantes propriétés vasodilatatrices et ensuite par sa présence et sa fonction de neurotransmetteur dans le système trigéminovasculaire sensoriel. La capacité migraineuse du CGRP a aidé l’industrie pharmaceutique à développer des anticorps monoclonaux et des antagonistes inhibant l’effet du CGRP. Un nouveau paradigme de traitement s’est avéré efficace dans le traitement prophylactique de la migraine. L’un des outils utiles pour mieux comprendre les mécanismes de la migraine est le modèle ex vivo de libération de CGRP par le système trigéminovasculaire. C’est une méthode relativement simple qui peut être utilisée avec divers outils pharmacologiques pour acquérir un savoir-faire afin de développer de nouveaux traitements efficaces contre la migraine. Le présent protocole décrit un modèle de libération de CGRP et la technique permettant de quantifier l’effet des agents pharmacologiques sur la quantité de CGRP libérée par le système trigéminovasculaire chez les rongeurs. Une procédure décrivant l’approche expérimentale de l’euthanasie à la mesure des niveaux de protéines est fournie. L’isolement essentiel du ganglion du trijumeau et du noyau du trijumeau caudalis chez la souris et le rat et la préparation de la dure-mère du rat sont décrits en détail. De plus, des résultats représentatifs des deux espèces (rats et souris) sont présentés. La technique est un outil clé pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie de la migraine en utilisant divers composés pharmacologiques et des animaux génétiquement modifiés.

Cette technique est un outil pour étudier les mécanismes moléculaires liés au CGRP impliqués dans la migraine. Il a l’avantage d’évaluer la libération de CGRP à différents niveaux du système trigéminovasculaire et peut être appliqué à la fois sur des souris et des rats de type sauvage et transgénique en combinaison avec divers composés pharmacologiques. Ici, des expériences de concentration-réponse et de blocage sur des rats et des résultats concentration-réponse de souris de type sauvage et transgéniques sont présentés.
La méthode de libération du CGRP a été utilisée pour étudier l’effet du glibenclamide, inhibiteur du canal KATP, sur la libération de CGRP par la TG et la dure-mère chez des rats trijumeaux allodyniques (STA) spontanés femelles. Tout d’abord, la concentration optimale de capsaïcine a été déterminée à l’aide d’un plan d’étude concentration-réponse. L’exposition à la capsaïcine a induit une libération importante de CGRP de la dure-mère et de la TG par rapport au véhicule (figure 5). Dans la dure-mère, la libération maximale de CGRP a été trouvée à 1 μM de capsaïcine, et dans TG, la libération maximale de CGRP a été trouvée à 10 μM de capsaïcine (figure 5A-B). Sur la base des expériences concentration-réponse, 1 μM de capsaïcine et 3 μM de glibenclamide ont été utilisés pour les expériences de blocage. Le glibenclamid n’a montré aucun effet sur la libération basale de CGRP par la dure-mère (P = 0,441) et la TG (P = 0,881) lorsqu’il a été analysé avec une ANOVA51 unidirectionnelle. Le glibenclamide a significativement réduit la libération de CGRP induite par la capsaïcine dans la dure-mère de 40 % (P = 0,031) et la TG de 39 % (P = 0,003) par rapport à la capsaïcine avec le véhicule lorsqu’elle est analysée avec une ANOVA unidirectionnelle (Figure 5C-D)51.
Chez la souris, le protocole a été utilisé pour examiner l’implication du canal ionique potentiel récepteur transitoire ankyrine 1 (TRPA1) dans un modèle murin GTN de migraine, où l’hypersensibilité induite par GTN dépendait entièrement des canaux TRPA1. On a constaté que le supercinnamaldéhyde (SCA), agoniste TRPA1, libérait du CGRP d’une manière dose-dépendante du TG avec 1 μM, 10 μM et 100 μM d’ACS, ce qui a entraîné une augmentation de 9 % (P = 0,23), de 51 % (P = 0,011) et de 69 % (P = 0,0097) de CGRP par rapport au véhicule, respectivement lorsqu’il est analysé avec une ANOVA bidirectionnelle. Ce rejet était absent chez la TG des souris nulles Trpa1 où l’exposition à 1 μM, 10 μM et 100 μM d’ACS a entraîné une variation de 11 % (P &gt; 0,99), -13 % (P &gt; 0,99) et 9 % (P = 0,97) % des rejets de CGRP par rapport au véhicule, respectivement lorsqu’elle était analysée avec une ANOVA bidirectionnelle. La stimulation ultérieure avec 10 μM de capsaïcine (témoin positif) montre que tous les échantillons de tissus pourraient libérer du CGRP (Figure 6)50.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig01.jpg"> Figure 1 : Dissection étape par étape de tissus de rats. Les détails (A-T) sont fournis dans la section protocole (étape 3.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig02.jpg"> Figure 2 : Dissection étape par étape de tissus de souris. Les détails (A-T) sont fournis dans la section du protocole (étape 3.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig03.jpg"> Figure 3 : Lavage et incubation des tissus de rongeurs. (A-B) Tissu fraîchement isolé dans des récipients en plastique avec SIF. Les conteneurs sont recouverts de tulle pour permettre un changement facile de SIF. (C) Tissu de rat - Deux moitiés crâniennes avec dure-mère recouvrant les parois internes du crâne placées sur une plaque de culture à 6 puits. Le noyau caudal du trijumeau droit et gauche dans des couvercles de tubes de microcentrifugation séparés (rangée supérieure de couvercles). Les deux ganglions du trijumeau dans les couvercles individuels des tubes de microcentrifugeuses (rangée inférieure de couvercles). (D) Tissu de souris - Partie du tronc cérébral contenant le noyau du trijumeau caudalis dans un couvercle séparé du tube de microcentrifugation (en haut). Deux ganglions trijumeaux de souris se trouvent dans un couvercle de tube microcentrifuge (en bas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig04.jpg"> Figure 4 : Plans d’étude pour la diffusion du PRMC. Trois protocoles différents pour effectuer des expériences de libération CGRP. Les médicaments doivent être dilués dans du liquide interstitiel synthétique (SIF). (A) Stimulation unique. (B) Stimulation concentration-réponse. (C) Inhibition d’une stimulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig05.jpg"> Figure 5 : Le glibenclamide inhibe la libération de CGRP induite par la capsaïcine par la dure-mère du rat et le ganglion trijumeau. Les concentrations de CGRP provenant de ganglions trijumeaux et de dure-mère isolés chez des rats trijumeaux allodyniques (STA) spontanés femelles (215-318 g) provenant à l’origine de l’Université Thomas Jefferson52 ont été mesurés avec des kits d’EIA CGRP humains commerciaux. (A-B) Libération de CGRP par (A) la dure-mère et (B) le ganglion du trijumeau après augmentation des concentrations de capsaïcine (10 nM, 100 nM, 1 μM et 10 μM) (n = 4). Les données sont présentées sous forme de points individuels et ont été analysées avec une ANOVA bidirectionnelle. p &lt; 0,0001 (C-D) Niveaux de CGRP libérés par (C) la dure-mère et (D) le ganglion trijumeau après 10 minutes d’exposition au véhicule, 3 μM de glibenclamide (glib), 1 μM de capsaïcine et 1 μM de capsaïcine + 3 μM de glib (n = 6-11). Les données sont présentées sous forme de points individuels et de valeurs moyennes et ont été analysées avec une ANOVA unidirectionnelle. *par rapport au véhicule. #capsaïcine par rapport à capsaïcine + glib. #P &lt; 0,05, ** et ##P &lt; 0,01, ****P &lt; 0,0001. Les analyses ont été suivies du test de comparaison multiple de Bonferroni. Un niveau significatif de α = 0,05 a été utilisé pour tous les tests. Ce chiffre a été modifié à partir de Christensen et al. 51. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig06.jpg"> Figure 6 : L’exposition aux ACR entraîne la libération de CGRP dépendante du TRPA1 par le ganglion trijumeau de souris. Les concentrations de CGRP libérées par les ganglions trijumeaux isolés de souris mâles WT et Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 (8-10 semaines) ont été mesurées avec des trousses d’EIA CGRP chez le rat après exposition au supercinnamaldéhyde (SCA) à 1 μM, 10 μM et 100 μM et à la capsaïcine à 10 μM comme témoin positif (n = 6). Les données de chaque souris sont présentées sous forme de points individuels et les barres indiquent les valeurs moyennes. Statistiques : La comparaison entre l’ACS et le véhicule à chaque concentration et entre le témoin basal et le témoin positif a été effectuée avec une ANOVA répétée bidirectionnelle. Un niveau significatif de α = 0,05. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01. Ce chiffre a été modifié à partir de Christensen et al. 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Le présent protocole décrit le modèle de libération ex vivo de peptides liés au gène de la calcitonine (CGRP) et la stratégie visant à quantifier l’effet des agents pharmacologiques sur la quantité de CGRP libérée par le système trigéminovasculaire chez les rongeurs.

Ex Vivo Libération d’un peptide lié au gène de la calcitonine du système trigéminovasculaire chez les rongeurs

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in ...

Cette méthode est un outil pour étudier les mécanismes impliqués dans la libération de CGRP par le système vasculaire du trijumeau. Le principal avantage de cette méthode est la capacité de diviser le système vasculaire du trijumeau en trois sites différents et d’évaluer la libération du CGRP dans chaque site distinct. La procédure sera présentée par moi-même et Inger Jansen-Olesen, une scientifique principale de notre groupe.Pour commencer, préparez le tissu de rat en enlevant la peau et le muscle autour de la tête et du cou à l’aide de ciseaux. Ensuite, utilisez une tondeuse à os et une paire de ciseaux pour séparer les mâchoires inférieures de la tête. Maintenant, exposez la moelle épinière et le tronc cérébral en insérant une tondeuse osseuse caudale dans la partie dorsale des vertèbres et retirez-la.Ensuite, coupez la partie caudale du crâne par les bords des os occipital et interpariétal pour enlever ces structures osseuses, exposant le cervelet. Pour isoler le TNC qui coule caudalement à environ 13 à 16 millimètres du bregma de chaque côté, coupez la partie dorsolatérale du tronc cérébral avec des ciseaux à ressort. Vient ensuite l’immersion des TNC gauche et droit dans SIF.Ensuite, coupez la tête à mi-saggitally pour diviser le crâne en deux à l’aide d’une scie. Maintenant, retirez soigneusement le cerveau sans toucher la dure-mère attachée au crâne à l’aide d’une spatule. Pour isoler le TG, coupez-le y compris ses branches autour des bordures visuelles avec la branche mandibulaire entrant dans le foramen ovale et les branches ophtalmiques et maxillaires entrant dans le crâne.Ensuite, immergez les moitiés crâniennes et les TG dans SIF. Pour préparer le tissu de souris, retirez la peau et le muscle autour de la tête et du cou à l’aide de ciseaux. Maintenant, exposez la moelle épinière et le tronc cérébral en insérant une paire de ciseaux caudale dans la partie dorsale des vertèbres et retirez-la.Coupez ensuite la partie caudale du crâne par les bords des os occipitaux et interpariétaux pour enlever ces structures osseuses exposant le cervelet. Coupez l’os pariétal au milieu de la paggite et retirez l’os pour exposer le cerveau. Retirez délicatement le cervelet pour exposer le tronc cérébral à l’aide d’une spatule.Isoler le TNC contenant une partie du tronc cérébral avec des ciseaux à ressort, puis immerger le tronc cérébral dans le SIF. Maintenant, retirez soigneusement le cerveau à l’aide d’une spatule et coupez le nerf trijumeau où il pénètre dans le tronc cérébral. Pour isoler le TG, coupez-le y compris ses branches autour des bordures visuelles avec la branche mandibulaire où il pénètre dans le foramen ovale et les branches ophtalmiques et maxillaires entrant dans le crâne.Ensuite, immergez les TG dans SIF. Pour faciliter l’échange de SIF, ajoutez un couvercle de péage aux contenants en plastique et commencez à laver le tissu de rat et de souris dans SIF pendant 30 minutes en remplaçant SIF toutes les cinq minutes. Après 30 minutes de lavage à température ambiante, transférer les moitiés TNC et les TG de rat dans des bouchons de tubes microcentrifugés séparés contenant 350 microlitres de SIF.Transférer le tronc cérébral de la souris avec TNC dans un bouchon de tube microcentrifuge contenant 250 microlitres de SIF. Enfin, transférez les deux TG de souris dans un bouchon de tube microcentrifuge contenant 250 microlitres de SIF. Placez les moitiés du crâne de rat sur une plaque de culture à six puits et remplissez le crâne avec 400 microlitres de SIF.Placez les crânes de rats dans des capsules de tubes microcentrifugeuses avec du tissu de rat et de souris dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius. Remplacez SIF à l’aide d’une pipette toutes les cinq minutes pendant 20 minutes sans toucher le mouchoir. Préparer les tubes microcentrifugés pour le prélèvement des échantillons par étiquetage approprié.Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon EIA à 10 concentrations dans chaque tube de microcentrifugeuse. Ensuite, préparer la solution du composé d’essai et la solution du véhicule en diluant dans le SIF pour toutes les concentrations. Après le dernier lavage, ajoutez 250 microlitres de SIF à la souris TG et TNC, 350 microlitres SIF à la TG et au TNC du rat et 400 microlitres au SIF à chaque crâne de rat.Après 10 minutes d’incubation, prélever 200 microlitres de l’échantillon dans un tube microcentrifuge pré-marqué avec 50 microlitres de tampon EIA de 10 concentrations pour permettre la mesure de la libération basale de CGRP. Jetez le liquide restant et conservez immédiatement les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Ajouter le composé d’essai dans le véhicule correspondant à des concentrations croissantes, en commençant par la concentration la plus faible, et incuber pendant 10 minutes.Après 10 minutes d’incubation, prélever 200 microlitres de l’échantillon dans un tube microcentrifuge pré-marqué avec 50 microlitres de tampon EIA de 10 concentrations. Jetez le liquide restant et ajoutez la deuxième concentration la plus faible au tissu. Conservez immédiatement les échantillons à moins 20 degrés Celsius et répétez cette procédure avec la concentration restante.Pour effectuer un contrôle positif pour l’expérience, ajoutez le contrôle positif au tissu à la fin du protocole. Après une période d’incubation de 10 minutes, prélever un échantillon de 200 microlitres dans un tube à microcentrifugation avec 50 microlitres de tampon EIA de 10 concentrations. Les concentrations de CGRP rejetées dans les échantillons prélevés sont mesurées à l’aide d’une trousse d’EIA tout en suivant les instructions du fabricant fournies avec la trousse d’EIE.Chez le rat, l’exposition à la capsaïcine a induit une libération importante de CGRP de la dure-mère et de la TG par rapport au véhicule. Dans la dure-mère, la libération maximale de CGRP a été trouvée à une micromolaire de capsaïcine. Et dans TG, la libération maximale de CGRP a été trouvée à 10 micromolaires de capsaïcine.Lorsqu’il est analysé avec une ANOVA unidirectionnelle, le glibenclamide ne montre aucun effet sur la libération basale de CGRP de la dure-mère et de la TG. Le glibenclamide a significativement réduit la libération de CGRP induite par la capsaïcine dans la dure-mère de 40% et la TG de 39% par rapport à la capsaïcine avec le véhicule lorsqu’elle est analysée avec une ANOVA unidirectionnelle. Le super cinnamaldéhyde agoniste antyrine-1 du récepteur transitoire libérant du CGRP d’une manière dépendante de la concentration du TG avec 1, 10 et 100 micromolaires de super cinnamaldéhyde, ce qui entraîne une augmentation de 9% de la libération de CGRP de 9% et 69% par rapport au véhicule respectivement lorsqu’il est analysé avec une ANOVA bidirectionnelle. La libération accrue de CGRP était absente dans la TG des souris knockout potentielles du récepteur transitoire Ankyrin-1 où l’exposition à 1, 10 et 100 micromolaires de super cinnamaldéhyde entraînant une variation de 11% moins 13% et 9% de la libération de CGRP par rapport au véhicule respectivement lorsqu’elle était analysée avec une ANOVA bidirectionnelle.Il est important de veiller à ne pas toucher le tissu pendant le prélèvement de l’échantillon et d’être précis lors du moment de l’incubation de tous les échantillons. Si des kits ELISA adéquats sont disponibles, il est possible d’appliquer cette procédure pour mesurer la libération d’autres peptides présents dans le système vasculaire du trijumeau.

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Source : Shannonhouse, J., et al. Imagerie calcique in vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions de la racine dorsale intacts. J. Vis. Exp. (2023). La vidéo fait la démonstration d’une technique d’imagerie calcique in vivo pour surveiller l’activité neuronale dans les ganglions de la racine dorsale (DRG) d’une souris transgénique. Les neurones DRG expriment un indicateur de calcium qui augmente l’intensité de la...

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